简便有效分离培养大鼠主动脉内皮细胞的一种新方法

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大鼠肝脏内皮细胞的分离及培养

大鼠肝脏内皮细胞的分离及培养
陈世壮;计磊;李军体;徐爱玲;许青;高勇
【期刊名称】《中西医结合肝病杂志》
【年(卷),期】2000(010)003
【摘要】目的:建立完善的大鼠肝脏内皮细胞分离培养方法.方法:采用胶原酶肝脏原位灌注消化和Percoll密度梯度离心法,分离肝脏内皮细胞,培养后行免疫化学细胞鉴定.结果:分离培养的肝脏内皮细胞经台盼蓝拒染实验,活细胞大于90%.细胞得率为(2～5)×106/g,细胞纯度大于90%.结论:该方法简便、实用、稳定、可靠.【总页数】2页(P22-23)
【作者】陈世壮;计磊;李军体;徐爱玲;许青;高勇
【作者单位】解放军第145医院,山东省莱阳市,265200;解放军第145医院,山东省莱阳市,265200;解放军第145医院,山东省莱阳市,265200;解放军第145医院,山东省莱阳市,265200;上海长征医院;上海长征医院
【正文语种】中文
【中图分类】R5
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3.应用分离微血管段方法培养人脑微血管内皮细胞及对血管内皮细胞生长因子基因表达细胞超微结构的观察 [J], 赵明光;唐涛;高永中;浦佩玉;魏学忠
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随机贴块法培养大鼠主动脉内皮细胞及其鉴定

１１月第３６卷第２１期
２１７７
・
论
著・
随机贴块法培养大鼠主动脉内皮细胞及其鉴定
宋明宝，黄岚△，于学军，朱光旭，张坡，于世勇，赵刚，康华利
ＳＯＮＧＭｉｎｇ— ｂａｏ，ＨＵＡＮＧＬａｎ，ｙＵＸｕｅｊｕｎ，ｅｔａ１．
（ＴｈｅＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒＤｉｓｅａｓｅｓｏｆＰＬＡ，ＸｉｎｑｉａｏＨｏｓｐｉｔａｌ，
ｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｂｙｒａｎｄｏｍｅｘｐｌａｎｔｅｄｒａｔａｏｒｔｉｃｗａｌｌｔｉｓｓｕｅａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｉｇｅｓｔｅｄｒａｔｅ．Ｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ。ｉｔｓｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄａｎｄｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇｆｏｒｖｗＦａｎｔｉｇｅｎａｎｄｉｎｖｉｔｒｏｔｕｂｅｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｗｅｒｅｄｏｎｅ．ＲｅｓｕｌｔｓＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｇｒｅｗｏｕｔｆｒｏｍｅｘｐｌａｎｔｓａｔ３ｄ，ａｎｄｇｒｅｗｔｏｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅａｔ１ｗｅｅｋ．Ｉｍｍｕｎｏ — ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇｆｏｒｖｗＦａｎｔｉｇｅｎａｎｄｉｎｖｉｔｒｏｔｕｂｅｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｗｅｒｅｐｏｓｉｔｉｖｅ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｉｓｉｓａｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔａｎｄｗｉｄｅ — ｌｙａｐｐｌｉｃａｂｌｅｍｅｔｈｏｄｔｏｃｕｌｔｕｒｅＲＡＥＣｓ．

大鼠骨髓来源内皮祖细胞的分离培养及鉴定

细胞，然后用添加有多种细胞因子的内皮细胞基础培养基（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｂａｓａｌｍｅｄｉｕｍ，ＥＢＭ一２）诱导培养获取ＥＰＣｓ。
通过形态学观察、ＣＤ１３３和ＶＥＧＦＲ一２抗体免疫荧光染色并结合ＦＩＴＣ－ＵＥＡ－１和Ｄｉｌ — ａｃ — ＬＤＬ的摄取功能来对ＥＰＣｓ进行鉴定分析，同时通过体外管样结构形成能力对ＥＰＣｓ进行功能性评价。结果在ＥＢＭ一２培养基中诱导
12实验方法121epcs的分离培养选用约150g的雄性清洁级sd大鼠采用颈椎脱臼法处死浸泡在70的酒精中消毒510min然后将股骨胫骨迅速从大鼠中剥离下来置于已消毒并盛有含双抗的磷酸缓冲液pbs平皿中将股骨胫骨上残留的肌肉剔除干净用手术剪分别剪去股骨胫骨的两端打开骨髓腔用5ml注射器吸取4ml含10胎牛血清fbs的dmem培养基从骨髓腔的一端将骨髓冲出到培养皿中用吸管将平皿中的细胞悬液轻轻吹打混匀然后将悬液贴壁轻轻加入到预置等体积percoll大鼠淋巴细胞分离液1083gml的离心管中悬于上层2500rmin离心30min用吸管小心地将中间云雾状白膜层的单个核细胞吸取到另一离心管中用dmem培养基洗涤两次1000rmin5min弃上清液用含10fbs和多种细胞因子的ebm2培养基重悬细胞以1105个cm2接种于培养板中1d后将未贴壁细胞悬液接种到fn预先包被好的6孔细胞培养板中置于饱和湿度375co2恒温培养箱
培养７ｄ后，出现类似于血岛样的细胞集落，集落中央的细胞呈圆形，周边的细胞呈放射状；８０以上的细胞都是ＣＤ１３３／ＶＥＧＦＲ一２细胞，并且这些细胞同时能够摄取Ｄｉｌ — ａｃ — ＬＤＬ和结合ＦＩＴＣ－ＵＥＡ－１；ＥＰＣｓ在基质胶表面形成管腔样结构。结论密度梯度离心法结合差时贴壁法从骨髓中分离获得的单个核细胞，然后经ＥＢＭ一２条件培养

大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养与鉴定

大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养与鉴定徐索文肖平喜陈健文乐康沈晓燕黄河清刘培庆【摘要】目的建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型，为体外研究动脉粥样硬化的发病机制提供重要的实验手段。

方法采用改良的植块贴壁法，成功建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型;分别用倒置显微镜和SABC试剂盒对培养细胞进行形态学观察、免疫组织化学和免疫荧光鉴定(平滑肌细胞特异性的α- SM - actin)。

结果原代培养的血管平滑肌细胞在接种后3天开始从组织块周围游出，光镜下培养细胞呈梭形，放射状生长和典型的“峰谷”状生长;免疫组化和荧光染色显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达，证实培养的细胞为血管平滑肌细胞。

结论本法简便、可靠、经济、短期内可获大量高纯度、功能良好的血管平滑肌细胞，可作为研究动脉粥样硬化和移植血管再狭窄机制的有效模型。

【关键词】大鼠;胸主动脉;植块法;血管平滑肌细胞[Abstract]ObjectiveTo establish the culture model of rat aorta vascular smooth muscle cells (VSMCs) to provide important experimental method for the pathogenesis research of atherosclerosis in vitro. MethodsEmploying the explants technique, the primary and sub-culture were completed bymodified tissue-piece inoculation and trypsin digestion respectively. The cultured cells were identified by phase contrast microscopy and immunohistochemical and immunofluorescent staining.ResultsAfter 3 days of inoculation of tissue-pieces, VSMCs migrated from the vessel pieces. The cultured cells showed the typical “hills and valleys”morphological features under the microscope. Immunohistochemical and immunofluorescent staining with monoclonal antibody against mouse α-SM- actin demonstrated these cells were positive. ConculsionIt is a simple and reliable method for obtaining highly purified and satisfactory VSMCs in short term, providing a favorable experimental platform for research into the mechanism of vascular proliferous diseases such as atherosclerosis and restenosis.[Key words]rat;thoracic aorta;explants method;vascular smooth muscle cells血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的异常增殖、迁移、泡沫化及凋亡与冠状动脉旁路移植术(CABG)和经皮冠脉腔内血管成形术(PTCA)术后血管再狭窄、颈动脉球囊损伤术致新生内膜形成(neointima formation)及动脉粥样硬化(atherosclerosis)密切相关[1~4]。

三种分离大鼠主动脉内皮细胞方法的比较研究

砸疆环学杂志
２０年第１卷第４０７７期
基础与实验
维普资讯
１６
张迎红，胡
豫，梅
恒．等
微镜下见细胞收缩变圆，胞间隙增宽后，消化细弃液，１２比例传代。按：
１６ＲＡＣ特性鉴定．Ｅ
用眼科剪将主动脉剪成１ｍｍ×１ｍｍ的小块，眼用
雄性ＳＤ大鼠，体重１００，５～２０ｇ由华中科技大学医学院实验动物中心提供。ＤＨａｋ－ｎｓ干粉、．０１５胰蛋白酶、２明胶、 Ⅱ型胶原酶、血清培养基无
１４ＲＣ纯化．ＡＥ
脉至髂总动脉分支处，出放人ＤＨａｋ液中。无取 — ｎｓ菌剥除血管外膜的脂肪和纤维组织，－ｎｓ液冲ＤＨａｋ洗血管腔。将血管移人另一有培养液的培养皿中，
采用机械刮除法，菌条件下用玻璃针反复刮无
张迎红胡豫梅恒王华芳郭涛魏文宁
［图分类号］Ｒ２． — 中３９２８［献标识码］Ａ文［章编号］１０ — １４（０７０ —０１ —０文０５７０２０）４０５２
●脐皮易得养固内胞获培妊一静细于和脉
脉至髂总动脉分支处，出放人ＤＨａｋ取 — ｎｓ液中，结
扎两端，放人６０Ｃ无菌水中停留２Ｓ后立即取出，放人盛有４Ｄ－ｎｓ液的小瓶中。无菌剥除血管 ℃ Ｈａｋ

大鼠胸主动脉内皮细胞培养方法的改进

维普资讯
・
１４・６
ＡｔｃｄＭｅｃａＡａｄＮｅｉＭｏｇｌＪｎ２０Ｖ１２Ｎｏ３ｎｏｕ．０７ｏ．９．

大鼠胸主动脉内皮细胞培养方法的改进
瞿海龙，陈晓春
（内蒙古医学院第三附属医院心内科，内蒙古包头０４１）１００
ｒａｈｄｍｏｏａｅｏｆｅｃ．ｅＣｆｐｓａｅ２ｗｅｅｉｅｔｅｙｆｃｏｅａｅｎｇｎｅｃｅｎｌｙｒｃｎｌｎｅＴＥｓｏａｓｇｒｄｎｉｄｂａｔｒＷｒｌｔｄａｔｅｕｈｉｆｉ
摘
要：目的：建立一种简单易行的ｓＤ大鼠胸主动脉的内皮细胞培养方法。方法：离大鼠胸主动脉，分清除
血管外结缔组织，将其剪成厚约１５ｍ的血管环，１２．ｒａ以５— ０个血管环密度接种于２ｃ５ｍ培养瓶中，以含２％胎０
牛血清的ＤＥ液培养，ｈＭＭ６后去掉血管环。待细胞生长达单层融合时，０消化传代。对Ｐ代细胞应用抗Ⅷ 因子２
抗体进行鉴定。结果：０后，６ｈ细胞呈集落样散在分布于瓶底；９７— ｄ细胞汇合成单层，呈销路石状。经Ⅷ 因子相
关抗原免疫组化鉴定，所培养细胞为内皮细胞。结论：管环贴壁法培养ｓ血Ｄ大鼠胸主动脉内皮细胞简易可行。
关键词：鼠；大内皮细胞
中图分类号：３９Ｒ２
ｈｏｇｍｍｕｏｙｏｈｍｉａｔｏｔｒｕｈｉｎｃｔｃｅｃｍｅｄ．ＲｅｕｔＡｆｅ０ｈｕｓｏｕｔｒｎｌｈｓｌｓ：ｔｒ６ｏｒｆｃｌｕｇ，ｔｅｃｌｉｔｉｕｅｎｉｈｅｓｄｓｒｂｔｄｉａｃｕｔｒｏｅｂａｅｎ．Ａｔｒｓｖｎ —ｎｉｅｄａｓｔｅｃｌｅｃｅｎｌｙｒｃｎｌｅｃｓ “ ａｉｇｌｓｅｎｔｓｍｅｔｆｅｅｅｈｎｙ，ｅｓｒａｈｄｍｏｏａｅｏｆｕｎｅａｈｐｖｎ

大鼠血管内皮细胞培养研究

大鼠血管内皮细胞培养研究血管内皮细胞是血管中重要的细胞类型，其在维护血管生理特性以及参与血管病理反应中都具有重要的作用。

大鼠作为实验动物，其血管内皮细胞的研究也是非常重要的。

在这篇文章中，我们将重点介绍大鼠血管内皮细胞的培养技术及其在血管生物学研究中的应用。

一、大鼠血管内皮细胞培养技术1.1 资源准备大鼠动脉、静脉组织、FBS、DMEM/F12、胰酶、胰酶抗性味粉、细胞凝集素、槲皮素、PBS、二氧化碳培养箱、显微镜、离心机、相位对比显微镜、细胞均质器等。

1.2 组织消化将新鲜的大鼠动脉或静脉取出，去除外膜及脂肪组织，用PBS缓冲液清洗数次。

接着，用胰酶液消化组织，割碎后转移到消化液中，37℃孵育1-2小时，直到组织消化完全。

1.3 筛选基质消化完全的组织过筛，筛子孔径为80目。

去掉筛子上的淋渣后，产出的细胞可以用显微镜观察并鉴定是否为血管内皮细胞。

1.4 细胞培养将产出细胞悬浮在完全培养基（DMEM/F12，10% FBS，100ug/mL嘌呤鸟嘌呤，100ug/mL青霉素和50ug/mL链霉素）中，在培养室内孵育。

按细胞密度不同，可选用不同的培养方法，比如单细胞悬浮培养、半贴壁培养和全贴壁培养等。

1.5 纯化细胞如果需要纯化大鼠血管内皮细胞，还需要使用血管壁内形成的凝集素贴壁分离技术，配合药物槲皮素进行消除非内皮细胞。

二、大鼠血管内皮细胞在血管生物学研究中的应用2.1 血管内皮损伤与修复在血管损伤修复研究中，常常会使用拉环法、加热法、切割法、放置血栓等手段产生不同程度的血管内皮损伤模型，进而观察、探究血管内皮细胞的响应和修复机制。

例如研究大鼠颈动脉内皮细胞在内膜损伤后的DNA修复机制是一个非常热门的研究课题。

2.2 血管疾病如高血压、动脉硬化、心血管疾病等，都与血管内皮细胞的损伤和功能异常有关。

通过培养大鼠血管内皮细胞，可以模拟这些血管疾病模型，如在培养基中将NO剂加入，从而模拟高血压或将脂质压入细胞内，模拟动脉硬化等，可以帮助我们更好的探究血管疾病的病理生理机制。

体态和液晶态

体态”和“液晶态”,双分子膜从原来的紧密排列状态开始紊乱,膜刚性和膜厚度降低,膜通透性增加,从而使其理化稳定性发生很大的变化。

另外冻干脂质体的制备工艺流程也会对其稳定性产生一定的影响,如冻干过程中的温度和降温速率都会对产生的脂质体产生很大影响7。

总之,冻干脂质体在适宜的温度条件下(-18、4、25℃)经过一定时间的储存,氧化和水解程度维持在较低的水平;重新水化后粒径分布比较稳定,是一种很好的脂质体制剂形式。

由于冻干法制备的脂质体可单独制备、储存,使用时迅速地将相应药物包载进去,这样制备的载药脂质体可以有效地延长药品在体内的作用时间,降低药品的毒副作用,提高药品在体内的有效生物利用度,使脂质体原有作为药物载体的优点进一步扩大,为药物研发开辟了一个崭新的空间。

关键词:脂质体;冻干;稳定性;脂质氧化;水解中图法分类号:R913 文献标识码:B 参考文献:1Lasic D D,Papahadjopoulos D.Lipos omes revisited J.Science,1995, 267(5202):1275-1276.2Suggy S C,Murari R,Imran A.Lipos omes(a review)J.Biopharm, 2001,11(13):10-14.3Huang Y Y,Chung T W,Wu C I.E ffect of saturatedΠunsaturated phos2 phatidylcholine ratio on the stability of lipos ome2encapsulated hem oglobin J.Int J Pharm,1998,172(5):161-167.4Panasenko O M,Evgina S A,Driomina E S,et al.Hypochlorite induces lipid peroxidation in blood lipoproteins and phospholipid lipos omesJ.Free Radic Biol M ed,1995,19(2):133-140.5F omus o L B,C orredig M,Akoh C C.M etal2Catalyzed oxidation of a struc2 tured lipid m odel emulsionJ.J Agric F ood Chem,2002,50(24):7114 -7119.6T ang D,B orchm an D.T em perature induced structural changes of beta2crystal2 line and s phing om yelin bindingJ.E x p E ye Res,1998,67(1):113-118. 7Crowe J H,Crowe L M.Factors affecting the stability of dry lipos omesJ.Biochim Biophy Acta,1988,939(2):327-334.(编辑　冯崇英)技术方法文章编号:100025404(2004)0620554202血管内皮2平滑肌细胞双层联合培养模型的改进Modified co2culture model of vascular endothelial cells and smooth muscle cells于学军,何作云,王晓燕,高凌云,牟　娇,杨生平,董琼兰 (第三军医大学新桥医院心血管内科,全军心血管内科中心,重庆400037) 提　要:目的　建立并改进血管内皮和平滑肌细胞双层联合培养模型,为进一步研究血管内皮和平滑肌细胞间的信号传递奠定基础。

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简便有效分离培养大鼠主动脉内皮细胞的
一种新方法
【摘要】目的：探索分离、培养鼠主动脉内皮细胞的有效方法。

方法：将鼠主动脉内膜翻向外，结扎两端，置于50 mL培养瓶中培养、传代，Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色。

结果：培养6～8 d 时有少量细胞自主动脉迁移出并贴壁生长；12～14 d 时贴壁细胞覆盖大部分培养瓶面，约80%的细胞汇合成单层；传代细胞生长旺盛；细胞汇合后呈现典型的“鹅卵石”样内皮细胞特征，内皮细胞标志物Ⅷ因子相关抗原表达阳性；未见杂细胞。

结论：此方法无损伤、不需要酶消化，能比较容易的获得高纯度大鼠原代主动脉内皮细胞，适用于细小血管内皮细胞的分离与培养。

【关键词】主动脉·体外培养·内皮细胞·大鼠
A new method for isolation and culture of the endothelial cells of the rat aorta
【ABSTRACT】Objective:To investigate a modified method of isolating and culturing the endothelial cells from the rat aorta for endothelial bioresearch. Methods:Turned inside out, the aorta of the rat, of which the intima tunica was exposed, was ligated at both ends and cultured in a 50 mL culture bottle. Results:A small amount of cells migrated out from the aorta 6
to 8 days after cultured; the migrating cells spread over most of the culture surface of the bottle 12 to 14 days after cultured, 80% of them in a confluent monolayer. The confluent cells were identified as endothelial cells with the typical cobblestone appearance and the positive reaction for factor Ⅷ relative antigen, no other types of cells was observed. Conclusion:This is a woundless, nonenzymatic method of obtaining highly purified primary endothelial cells of the rat aorta, especially practical for isolation and culture of small vascular endothelial cells.
内皮细胞是研究心血管、炎症、肿瘤等疾病最常用的工具。

目前，对脐静脉等较大血管原代内皮细胞的分离与培养1般采用酶消化法，技术已经成熟。

但对于大鼠等小动物血管而言，由于管径细小，操作难度大，其内皮细胞的分离与培养1直存在产量少、易混入杂细胞等问题［1］。

本研究经过反复实验，建立了1种有效获取高纯度、高数量大鼠原代血管内皮细胞的分离与培养方法。

1 材料与方法 1.
2 培养方法 1.2.２细胞传代培养原代培养约12 ～14 d，迁出生长的细胞覆盖培养瓶面积的2/3以上，约80 %的细胞汇合即可传代。

取出主动脉，用D-Hanks液冲洗培养瓶2次，常规消化、吹打，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入含10% 胎牛血清的DMEM/F12培养液适量，制成细胞悬液，依照细胞的量按1：1或1：2传代培养，
3 d换液1次。

另9只大鼠以同样步骤重复上述
实验。

1.4 细胞纯度分析取6次培养的第2代主动脉内皮细胞，vWF 免疫细胞化学染色后，每张盖玻片400倍镜下随机选5个视野计数细胞，计算细胞阳性表达率（细胞阳性表达率=阳性细胞数/细胞总数）。

2 结果 2.2 免疫细胞化学染色 vWF免疫细胞化学染色，细胞质呈现棕黄色阳性反应。

每张盖玻片100倍镜下随机选10个视野进行观察，均未见染色阴性表达细胞（图2）。

2.3 细胞纯度分析 vWF免疫细胞化学染色后，每张盖玻片400倍镜下随机选5个视野计数细胞，所见细胞均为阳性染色细胞，阳性表达率为100%，即获取的内皮细胞纯度为100%。

重复实验10次，均获得同样结果。

[NextPage]
3 讨论酶消化法可以在相对短的时间内获取细胞。

大鼠主动脉较细，本实验发现150 g的大鼠主动脉管径约2 mm，其分支非常细且不易结扎，灌注的酶消化液容易经其分支渗漏至管外，使外膜也被消化，导致其他细胞混入；细胞产量亦较低，且大多需同时获取多条动脉，操作复杂；有时因酶的活性改变而使消化时间难以掌控,不仅影响内皮细胞的分离和提取，亦可直接影响内皮细胞的活力［7］。

组织块移植培养法操作简单，对细胞活力无损伤，缺点为长出的细胞成分比较复杂，内皮细胞纯度低［8］，常伴有成纤维细胞污染。

由于成纤维细胞生长迅速，最终过度生长甚至覆盖内皮细胞而影响内皮细胞增殖。

有学者将大鼠主动脉外膜做瞬间热处理后再进行植块培养，提高获取内皮细胞的纯度至67.8%［6］。

此方法解决了鼠主动脉内。