实验室常用实验方法-人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养
人脐静脉内皮细胞分离、培养及鉴定
人脐静脉内皮细胞分离、培养及鉴定权燕;郑练【期刊名称】《汕头大学医学院学报》【年(卷),期】2009(22)4【摘要】目的:寻求一种简单、实用的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)分离及培养方法。
方法:在传统HUVECs分离、培养的基础上,进行实验方法的改进,用Ⅰ型胶原酶分离HUVECs;通过倒置显微镜观察HUVECs生长情况,最后使用Ⅷ因子免疫荧光及摄取Dil-Ac-LDL实验鉴定HUVECs,采用流式细胞术检测HUVECs纯度。
结果:改进实验工序和精化实验操作后,HUVECs分离不受影响,原代HUVECs3～4d后融合,传代后2～3d融合,倒置显微镜下见细胞呈"铺路石"状,有接触性抑制现象,Ⅷ因子及摄取Dil-Ac-LDL实验呈阳性,流式细胞术检查细胞纯度达92.9%。
结论:本培养方法操作简便,培养周期短,获得的HUVECs纯度较高,有助于体外研究血管内皮细胞模型的构建。
【总页数】4页(P209-211)【关键词】人脐静脉;内皮细胞;细胞培养;分离;鉴定【作者】权燕;郑练【作者单位】汕头大学医学院第一附属医院小儿外科【正文语种】中文【中图分类】R329.2【相关文献】1.人脐静脉内皮细胞分离培养及鉴定技术 [J], 吴金义;张蕾;张秀英;曲丽梅2.人脐静脉内皮细胞的分离培养和鉴定及酪氨酸激酶受体-2在其中的表达 [J], 吴世卿;郑俊发;曾曙光;陈少鹏;薛国初;章锦才3.人脐静脉内皮细胞体外分离培养方法改进的探索及鉴定 [J], 林少芬;周焕娇;丁运刚;梁小玲;罗燕;唐仕波4.人脐静脉内皮细胞的分离培养及鉴定 [J], 牛成伟;曹凯5.人脐静脉内皮细胞的体外改良分离、培养及鉴定 [J], 阮溦;李锁北;戴如平;徐军美因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定
本课题为安徽省自然科学基金安科医药专项资助项目(01043708)作者单位:230001 合肥 安徽省立医院普外科安徽医科大学2001级硕士研究生(傅斌生)人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定余继海 许戈良 汪 建 荚卫东 傅斌生[摘 要] 目的 探讨新生儿脐静脉内皮细胞的培养及鉴定方法,建立血管内皮细胞培养模型,为体外研究血管内皮细胞提供实验手段。
方法 采用胶原酶 灌流消化法培养人脐静脉内皮细胞,当原代培养细胞80%以上汇合后,用胰蛋白酶消化传代;根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术(F M 术)免疫荧光检查对细胞进行鉴定。
结果 种植在培养瓶中的内皮细胞12小时贴壁生长,48~72小时生长最快,7~10天汇合。
内皮细胞呈接触抑制生长、呈鹅卵石样外观,FM 术检测CD31和V -R-Ag 均为阳性表达。
结论 消化酶灌注脐静脉消化内皮细胞是获取血管内皮细胞的一种好方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型。
[关键词] 内皮细胞;培养C ulture and identif ication of human endothelial cells derived f rom umbilical veins Y u Jihai ,Xu Geliang,W ang J ian,et al A nhui Prouincial H osp ital,H ef ei 230001[Abstract] Objective T o extablish the methods of culturing human endothelial cells (EC)and identifing the cells ac cording to t he antigens expressed and their morpholog ical aspect.Methods A fter digestion w ith t ype collagenase at 37!for 10minutes,the cells were centrifuged,and the cell pellet was resuspended in DEM E medium containing fetal bovine serum (10%vol/vol),seeded on gelatin(0.1%w t/vol)procoated dishes at aconcentr at ion of 10,000per square centimeter.T he medium was changed 1days later when the cells w er e attached and every 2days,until the cells reached confluence.Phase con trast microscopy and flow cy tometry with specific antisera against von willebrand factor and CD31were used to obser ve and i dentify the culturedcells.Results At confuluence (7~9days),the cultured cells had a cobbestone appear ance wit h a strict monolayer grow th and contact inhibition.T he mean fluorescence intensity of the cells was similar w ith both antibodies for the cultured cells vs controls.C onclusion T he cultured cells are endothelial cells,and the method of identification is practical and convenient.[Key words] Endot helial cells;Culture我们采用胶原酶 灌流消化法成功培养人脐静脉内皮细胞,根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术免疫荧光检查对细胞进行鉴定,从而构建体外研究血管内皮细胞的模型,现报告如下。
huvec小管生成实验方法
huvec小管生成实验方法HUVEC小管生成实验是一种常用的细胞实验方法，旨在研究人体血管内皮细胞（HUVEC）在体外形成管状结构的能力。
本文将介绍HUVEC小管生成实验的整体流程和关键步骤。
一、实验前准备在进行HUVEC小管生成实验之前，需要准备以下实验材料和设备：1. HUVEC细胞系：HUVEC细胞系是由人体血管内皮细胞培养而成的细胞株，可通过购买或实验室培养获得。
2. 培养基：HUVEC细胞的培养基通常为含有生长因子和营养物质的培养基，如EGM-2培养基。
3. 细胞培养器具：培养皿、离心管、移液器等。
4. 细胞培养条件：实验室内需要提供恒温恒湿的培养箱，并保持细胞培养条件稳定。
二、实验步骤1. HUVEC细胞的处理将培养好的HUVEC细胞从培养瓶中取出，用PBS缓冲液洗涤细胞，以去除培养基中的残留物。
然后加入胰酶等胰蛋白酶类物质，使细胞与培养瓶底分离，放置一段时间，使细胞形成单细胞悬浮液。
2. 细胞计数和制备细胞悬液用显微镜和细胞计数板对HUVEC细胞进行计数，以确定细胞的浓度。
根据所需实验的细胞密度，将细胞悬液稀释至适当浓度。
3. 细胞培养和形成小管将稀释后的HUVEC细胞悬液均匀地加入预先涂覆有基质（如Matrigel）的培养皿中，使细胞悬液均匀分布。
然后将培养皿置于培养箱中，保持适宜的温度和湿度进行培养。
在一定时间后，通过显微镜观察细胞是否形成管状结构。
4. 小管形成的评估使用显微镜观察和拍摄HUVEC细胞形成的小管结构，并记录相关数据。
可以通过图像处理软件对小管网络的形态参数进行分析，如长度、分支数等。
5. 对实验结果的统计分析根据实验数据，使用统计学方法（如t检验、方差分析等）对不同处理组的小管生成能力进行比较和分析，以获得可靠的实验结果。
三、实验注意事项1. HUVEC细胞的培养条件和培养基的配方需要根据实验目的和相关文献进行优化选择。
2. 在实验过程中应注意细胞的无菌操作，避免细胞受到污染。
人脐静脉血管内皮细胞HUVEC
第三：铺板加样方法错误。
• 6孔、12孔、24孔、48孔与96孔的细胞接种铺板过程中，你的 加样方式是哪种？你觉得加样方式对后期的接种均匀度影响大 吗？例如你是否有过垂直加入96孔板的经历？是不是有的孔就 比较均匀，而有的孔就聚集在了一起？六孔板怎么摇晃也不均 匀？其实也许你离铺好板就差一种适合你的方法。
• 2、不是所有细胞消化后都会变成圆形
• 有些细胞(比如U87，U251)消化好了也不会变成圆形， 只是呈半沙状。
• 3、有些细胞即使变圆，也有脱落的细胞，但还是没消化好 • 比如7860，要等到大部分细胞脱落培养皿底部才可以停
止消化，否则很难吹打下来，这种情况一般发生于难以消化 的细胞。
• 4、对于一些特殊的细胞需要消化过一点 • 有些细胞吹成单个细胞反而对细胞的状态会好一点，一
6孔板、12孔板或24孔板
• 为防止表面张力导致的中间液面太低细胞聚集的现象。通常 每孔首先滴加少量培基，轻轻晃动浸润整个孔底以保证板子 的孔底都是湿润的，这样加液后细胞悬液会平铺在整个孔底， 可以避免加在中间位置和加在周边晃匀后周边细胞局部太多 的现象，细胞分散会较均匀。注意加完细胞悬液后要放工作 台静置一下（5-10分钟）。镜下观察细胞均匀度，如不均匀 可采用以下8字法、十字法及震荡法等方法进行细胞均匀度 处理
• HUVEC细胞培养难度较高，建议使用内皮细胞专用培养基， 选用优质胎牛血清。细胞推荐传代比例为1:2-1:3，胰酶消化室 温1-2分钟，传代周期通常为3-4天。需要注意的是，如 HUVEC出现聚团生长，可能由于培养板亲水性差或者血清中 促贴壁因子不足，可考虑用人纤维粘连蛋白包被培养板，能有 效预防细胞聚团。
第二：细胞吹打次数不够，细胞悬
液密度不均匀。
在Transwell小室中分离培养人脐静脉内皮细胞的研究
在Transwell小室中分离培养人脐静脉内皮细胞的研究张又枝;黄琦;任平【摘要】目的建立一种在特殊材料Transwell培养小室中分离培养原代人脐静脉内皮细胞的技术.方法采用酶消化法分离得到人脐静脉内皮细胞(HUVEC),免疫荧光法检测内皮因子Ⅷ予以鉴定,待长满后用不含EDTA的0.25％胰酶传代到Transwell小室中,观察小室中HUVEC的生长情况.结果在脐带长度一定的情况下,HUVEC分离所得到细胞的多少以及细胞的状态与胰酶的用量、时间、温度及是否含EDTA关系密切.本研究胰酶消化时间在室温(25℃左右)情况下要消化30min,用的胰酶是含EDTA和不含EDTA的胰酶1∶1混合;长满之后传代消化的胰酶只能用不含EDTA的胰酶消化,时间以在镜下的细胞状态为准.结论在特殊材料Transwell小室中成功分离培养HUVEC,一定要在比较温和的条件下消化HUVEC,这样才可能得到活力比较好、数量比较多的细胞.【期刊名称】《湖北科技学院学报（医学版）》【年(卷),期】2015(029)002【总页数】3页(P96-97,103)【关键词】人脐静脉内皮细胞;Transwell小室;胰酶【作者】张又枝;黄琦;任平【作者单位】湖北科技学院药学院,湖北咸宁437100;湖北科技学院糖尿病及心脑血管病变湖北省重点实验室;湖北科技学院药学院,湖北咸宁437100;湖北科技学院药学院,湖北咸宁437100【正文语种】中文【中图分类】R329.3人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在医药学的基础研究中应用广泛，主要是其比较易得到，而且又具有内皮细胞的特征，对疾病的发病机制的研究极为重要。
但是该细胞比较脆弱，极易损伤，在研究中不易得到活力比较好的细胞。
Transwell 小室是一种嵌入细胞培养板，其小室底部含有聚碳酸酯膜的材料，亦称为PET 膜，该膜根据孔径不同将其分为不同种的小室，但是共有的特点是其具有通透性，使小室内外培养液的成分相互影响，从而影响细胞的生长、运动等。
huvec小管生成实验方法
huvec小管生成实验方法HUVEC小管生成实验方法引言：HUVEC（人脐静脉内皮细胞）是一种常用的体外模型系统，用于研究血管生成和血管内皮细胞功能。
HUVEC小管生成实验是一种常见的方法，用于评估血管形成的能力和细胞迁移的能力。
本文将介绍一种常用的HUVEC小管生成实验方法及其步骤。
材料与试剂：1. HUVEC细胞系：通过细胞培养技术获得。
2. 培养基：使用适合HUVEC细胞培养的培养基，如DMEM/F12。
3. 培养皿：使用96孔板或24孔板。
4. 载玻片：用于观察和分析小管生成。
5. Matrigel：一种基质蛋白，用于模拟细胞外基质环境。
实验步骤：1. HUVEC细胞的培养a. 将HUVEC细胞解冻并在培养基中孵育。
b. 细胞密度达到80-90%时，用PBS洗涤细胞。
c. 使用细胞消化酶（如胰酶）消化细胞。
d. 将细胞重新悬浮在培养基中，并计数细胞数目。
2. Matrigel涂层a. 在载玻片上滴加2-3滴Matrigel。
b. 使用移液器均匀涂覆整个载玻片表面。
c. 在37摄氏度下孵育30分钟至凝胶化。
3. 细胞接种a. 将预定细胞数目的HUVEC细胞悬浮在培养基中。
b. 将细胞悬浮液加入预先涂有Matrigel的孔板孔中。
c. 将培养皿放置在37摄氏度的细胞培养箱中，孵育24-48小时。
4. 观察和图像获取a. 使用显微镜观察HUVEC细胞在Matrigel上的小管生成。
b. 使用图像采集系统捕获并保存小管生成的图像。
5. 分析小管生成a. 使用图像处理软件对图像进行分析，包括测量小管长度、分支点数目等。
b. 统计和比较不同处理组的小管生成结果。
结果与讨论：通过HUVEC小管生成实验，可以评估细胞的血管生成能力。
实验结果显示，HUVEC细胞在Matrigel上能够形成分支的管状结构，模拟血管形成的过程。
小管长度和分支点数目可以作为评估血管生成能力的指标。
此外，通过比较不同处理组的结果，可以进一步研究各种因素对血管生成的影响。
HUVEC培养步骤
HUVEC原代培养方案1 实验材料1.1实验器材广口瓶（250ml）1个，注射器（30ml,20ml各2个），灌胃针头3个，止血钳3把，离心管（10ml）4根，铝饭盒1个，烧杯4个，橡胶塞4个，细胞培养箱，莱卡倒置显微镜。
1.2实验试剂I型胶原酶（Gibco 批号：1344183），PBS 自制，M199（Sigma lot No 083K83581），胎牛血清（Gibco）2 实验方法1）从无菌的广口瓶中取出新生脐带，剪去钳痕和凝血块阻塞部分，找到脐静脉，在脐静脉的一端插入带钝头的灌胃针，用止血钳固定。
2）30ml注射器吸取温PBS后接灌胃针头，反复冲洗至流出的液体无色。
3）冲洗干净后，挤压去掉脐静脉内的PBS，另一端插入灌胃针头并用止血钳固定。
4）向脐静脉内注入0.1%的I型胶原酶，使之充盈，用橡胶塞封闭两端的灌胃针头，再将脐带放入37度孵箱中温育适当时间并不时摇动以促进消化。
5）无菌条件下取出脐带，取出橡胶塞，将含有内皮细胞的胶原酶液注入10ml的锥形离心管中。
6）用止血钳轻轻挤压脐静脉管壁后，再用20ml注射器吸取PBS冲洗，流出液一并收集于10ml的离心管中。
7）1200RPM离心10分钟，弃上清，加入完全培养基，充分混合制成细胞悬液。
3 注意事项1）实验前准备充分，取脐带时一定要注意无菌。
2）实验时不要说话，注意无菌操作，并且要规范。
3）把握好胶原酶消化时间，不同批次胶原酶活性不一样，消化能力不一样，所以换酶时需要重新掌握好消化时间。
试剂配制：1）I型胶原酶溶液称取I型胶原酶适量，用PBS配制成浓度为0.1%的溶液，过滤后分装，-20℃保存，临用时融化并预热。
2）M199培养液M199 9.8g 青霉素 60mg链霉素 100mg 碳酸氢钠 2.2g肝素 50mg 谷氨酰胺 293.2mg共配成1000ml 过滤后放冰箱备用。
HUVEC培养过程
HUVEC培养过程（Human Umbilical V ein Endothelial Cells）1.细胞名称：人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells）2.购买公司：Cascade Biologics （Invitrogen公司），Catalog Number: C-023-5C；3.试剂及培养液配制注：此处所用TTrypsin/EDTA solution、Trypsin Neutralizer solution为培养HUVEC细胞用专有的消化、中和液，切勿用其他代替。
M200+LSGS：4.培养过程（简略）HUVEC为原代细胞，除复苏、冻存过程中与常规细胞系如293T等贴壁细胞雷同外，需主要注意的是培养液放置温度、Trypsin消化细胞过程。
1）培养液放置温度：细胞代理销售公司技术推荐在使用前30min室温（25-27℃）中放置配制好的培养液，用脸贴培养瓶而感觉到不冷（即接近人体温）即可使用。
Trypsin/EDTA solution、Trypsin Neutralizer solution可同样处置。
2）Trypsin消化细胞过程：加入4mL Trypsin/EDTA solution/ 25cm2 flask后晃动3次，吸弃3mL Trypsin/EDTA，室温中作用1-3mins，显微镜下观察细胞变圆、脱离培养皿即可加入3mL Trypsin Neutralizer solution进行终止作用。
3）转移细胞至15mL离心管中，1000rpm 离心5mins，弃上清，加入新鲜的培养液转移至新的培养皿/瓶。
4）复苏、冻存雷同其他细胞操作，细胞复苏、传代后不可多次传代，一次复苏的细胞尽量满足连续性试验需要。
5）可参考Cascade Biologics公司的操作。
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人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养
1.将15-20cm 长的新生儿脐带放入无菌的PBS 溶液中储存。
（注：4℃下最多贮存24 小时，室温下不超过6 小时，否则废弃）
2.用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的PBS 溶液冲洗3-5 次，将污
血冲洗干净为止。
3.用手术钳夹紧脐带下端，加入15m l的胶原酶（1m g/ml）室温下消化15-20
分钟，并不时上下摇动脐带。
4.消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50 m l无菌离心管中，用无
菌的PBS 溶液冲洗脐带2-3 次。
5.将收集液离心（2000 转/分）3 分钟。
6.倒去上清，加入10m l M199培养基（加入10U/m l的bF G F），用弯管吹散细
胞，将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中，37℃培养。
（注：每个培养瓶中加入3-4ml 无菌的1%的明胶溶液，摇匀使得明胶溶液完全铺满瓶底，放入37℃孵育，最少2 小时，用前将明胶溶液倒了即可，明胶包被有利于细胞贴壁。
）
7.培养24 小时后，倒掉培养基，并用无菌的PBS 溶液清洗2-3 次，洗掉红细
胞和死细胞，加入10 m l新鲜的M199培养基。
8.以后每2 天换一次培养基（每次换掉2/3 的培养基）。
9.一般培养5-7 天，细胞可长满至80-90%单层，这时可以传代。
10.倒掉培养基，用无菌的PBS溶液清洗2-3 次，加入2-3m l消化液（0.25%胰酶
+0.1%EDTA）消化细胞，在显微镜下观察，一旦细胞变圆，即加入2-3 倍的——————————————————————————————————————————————。