第五章卫生指标菌的检测OK
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水环境卫生细菌学检测—细菌菌落总数的测定
2.2 平板涂布法
先制作平板；
取样品（无菌水）0பைடு நூலகம்1ml放入平板 上，涂抹棒均匀涂抹平板表面，直至 无残存样品（无菌水）；
翻转放置。
平板涂布
2. 3注意事项
保证无菌操作要求，同时注意不得影响样品中的微生物（培养基不得 太烫，取样时不要离火焰太近）；
制作平板时培养基不得沾附底面之外的侧面甚至盖上，未凝固前不得 翻转；
混匀器
四、接种培养
1.培养数量
不稀释样：样品、无菌水（无菌对照），共2 个培养，每个培养需培养3个平板（重复）；
需稀释样：最大稀释样及前两个稀释样、无 菌水，共4个培养，每个培养需培养3个平板 （重复）；
预先在培养皿底面标记清楚培养稀释度、操 作人、时间等信息。
培养皿标记
2. 接种平板
2.1 混合平板法
三、样品的稀释
主要针对样品中含较多微生物的水样（水源水、污水）；
自来水、饮用水一般不需稀释，可直接取样培养。
1. 分装无菌水 取数支无菌试管，标记10－1、10－2、……,每试管分装9ml无菌水 或无菌生理盐水。 （也可分装好后再灭菌）
稀释所需的数量级根据样品中微生物量的估计而定，一般轻度 污染水稀释到10－3，重度污染水可稀释到10－5、10－6。
对于不利于细菌生长的污染物，常需检测对应专门微生物及污染 物含量的直接检测。
二、稀释平板培养计数法
细菌的个体微小，直接观察、计数困难； 单个细菌经过培养可长成肉眼可见的菌落； 要设法避免多个细菌长成1个菌落，常需对 样品进行稀释处理。
稀释平板培养菌落
1.测定的程序：
样品稀释 接种平板 培养 菌落计数 报告
不同稀释度不得使用同一移液管，防止交叉影响及污染；
版中国药典卫生学检验培训 抑菌剂效力检查法指导原则_OK
抑菌剂效力检查法指导原则
2010年版《中国药典》一部附录XVIII D 2010年版《中国药典》二部附录XIX N
▪抑菌剂效力检查法指导原则——目的
如果药物本身不具有充分的抗菌活性，在正常贮藏和使用过程 中可能发生微生物污染和繁殖使药物发生变质而对使用者造 成危害。故在生产过程中根据制剂特性添加适宜的抑菌剂以 保证药品的质量。 所有抑菌剂都具有一定的毒性，其抗菌效力在贮存过程中有可 能因药物的成分或包装容器等因素而提高或降低，为保证药 品的质量和用药安全，添加抑菌剂的量应根据制剂本身是否 具抗菌活性，保持最低有效量。 抑菌剂效力的测定可为生产过程中添加抑菌剂提供指导，随着 科学发展，新型抑菌剂大量出现，抑菌剂效力的测定更为重 要；使生产者正确掌握产品中添加的抑菌剂的效力，有助于 选择合适的抑菌剂，也可对抑菌剂使用的正确性给予评价。
5
抑菌效力检查法指导原则——实验要点
• 设计实验方案； • 验证计数测定方法； • 制备浓菌液（108cfu/ml）； • 原包装接种； • 立即计数与第7、14、28天计数； • 计数结果的常用对数值比较； • 结果判断。
6
• 抑菌剂效力测定实验
• 1.培养基：胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB)；胰酪பைடு நூலகம்大豆琼脂培养基(TSA)；沙氏葡萄糖液 体培养基；沙氏葡萄糖琼脂培养基。
12
• 取包装完整的供试品至少5份，直接接种试验菌， 或取适量供试品分别转移至5个适宜的无菌容器中 （若试验菌株数超过5株，应增加相应的供试品份 数），每一容器接种一个试验菌。
• 1、2、3类供试品1g或1ml接种菌量为105～106cf u，4类供试品中1g或1ml接种菌量为103～104cfu， 接种菌液的体积不得超过供试品体积的0．5%～1 % ，充分混合，使供试品中的试验菌均匀分布。
2010年版《中国药典》一部附录XVIII D 2010年版《中国药典》二部附录XIX N
▪抑菌剂效力检查法指导原则——目的
如果药物本身不具有充分的抗菌活性，在正常贮藏和使用过程 中可能发生微生物污染和繁殖使药物发生变质而对使用者造 成危害。故在生产过程中根据制剂特性添加适宜的抑菌剂以 保证药品的质量。 所有抑菌剂都具有一定的毒性，其抗菌效力在贮存过程中有可 能因药物的成分或包装容器等因素而提高或降低，为保证药 品的质量和用药安全，添加抑菌剂的量应根据制剂本身是否 具抗菌活性，保持最低有效量。 抑菌剂效力的测定可为生产过程中添加抑菌剂提供指导，随着 科学发展，新型抑菌剂大量出现，抑菌剂效力的测定更为重 要；使生产者正确掌握产品中添加的抑菌剂的效力，有助于 选择合适的抑菌剂，也可对抑菌剂使用的正确性给予评价。
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抑菌效力检查法指导原则——实验要点
• 设计实验方案； • 验证计数测定方法； • 制备浓菌液（108cfu/ml）； • 原包装接种； • 立即计数与第7、14、28天计数； • 计数结果的常用对数值比较； • 结果判断。
6
• 抑菌剂效力测定实验
• 1.培养基：胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB)；胰酪பைடு நூலகம்大豆琼脂培养基(TSA)；沙氏葡萄糖液 体培养基；沙氏葡萄糖琼脂培养基。
12
• 取包装完整的供试品至少5份，直接接种试验菌， 或取适量供试品分别转移至5个适宜的无菌容器中 （若试验菌株数超过5株，应增加相应的供试品份 数），每一容器接种一个试验菌。
• 1、2、3类供试品1g或1ml接种菌量为105～106cf u，4类供试品中1g或1ml接种菌量为103～104cfu， 接种菌液的体积不得超过供试品体积的0．5%～1 % ，充分混合，使供试品中的试验菌均匀分布。
微生物学理论指导：大肠杆菌的卫生细菌学检查
⼤肠杆菌不断随粪便排出体外，污染周围环境和⽔源、⾷品等。
取样检查时，样品中⼤肠杆菌越多，表⽰样品被粪便污染越严重，也表明样品中存在肠道致病菌的可能性越⼤。
故应对饮⽔、⾷品、饮料进⾏卫⽣细菌学检查。
1.细菌总数：检测每毫升或每克样品中所含细菌数，采⽤倾注培养计算。
我国规定的卫⽣标准是每毫升饮⽔中细菌总数不得超过100个。
2.⼤肠菌数指数：指每⽴升中⼤肠菌群数，采⽤乳糖发酵法检测。
我国的卫⽣标准是每1000ml饮⽔中不得超过3个⼤肠菌群；瓶装汽⽔、果汁等每100ml⼤肠菌群不得超过5个。
第五章卫生指标菌的检测OK
2019年9月17日星期二
14
式中：
N——样品中菌落数；
ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之 和；
n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d——稀释因子（第一稀释度）。
2019年9月17日星期二
15
注意：旧版标准的做法为：比值小于或等于2取 平均数，比值大于2则其较小数字
国家标准(2003版)： 三步法：乳糖胆盐发酵试验→分离培养→证实试 验(乳糖发酵试验)
行业标准： 两步法：推测试验→证实试验
国家标准(2010版)： 两步法：LST发酵→BGLB复发酵
2019年9月17日星期二
32
GB 4789.3-2010
月桂基硫酸盐胰蛋白胨 （Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤
肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)
肺炎，泌尿系、创伤感染 败血症等
阴沟肠杆菌(Enterobacter) 产气杆菌 (E.aerogenes)
很少引起原发性感染
哈夫尼亚菌属 (Hafnia) 沙雷氏菌属 (Serrati) 变形杆菌属 (Proteus) 耶尔森氏菌属 (Yersinia)
蜂窝啥夫尼亚菌 (H.alvei) 粘质沙雷氏菌 (S.marcescens)
8、稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈 多。如出现逆反现象，不可作为检样计数报告的 依据。
2019年9月17日星期二
21
复习题
1、什么是菌落总数？ 2、测定食品、饮料等产品的菌落总数有什么意
义？ 3、画出平板倾注法测定菌落总数的示意图。 4、在测定菌落总数时，如何选择菌落进行计数？ 5、在菌落总数的检验中，要注意哪些事项？ 6、在菌落总数的检验中，如何根据样品的特性
怎样才能方便的观察和检测细菌和真菌_OK
53
细菌、真菌培养的一般方法是：
配制培养基 高温灭菌冷却
接种
培养
54
提示:
1.在没有想好如何工作以前,不能打开培养皿 2.在标签纸上标出组别. 实验日期.
将标签贴在培养皿的底面
3.接种时只需抬起培养皿盖子一侧,动作要迅 速,尽量使培养基与空气接触的时间短. 4.在操作中,无菌棉棒只需在物体表面轻轻的 擦过，不能过于用力，更不能把培养基戳破。
在土壤中、水中、空气中 乃至我们的身体上，都可 以找到细菌和真菌。甚至 寒冷的极地，很热的热泉 中，也有他们的踪迹。
不同环境中都有细
菌和真菌吗？我们可
以通过活动来探究。
极端环境（寒冷的极地，热温泉
中，深海的火山口）
20
四、检测不同环境中的细菌和真菌
●科学探究是生物学学习的重要途径,那 么探究的步骤有哪几步呢? P68
氧呼吸而产生乳酸等产物。
35
P70 练习： 你见过泡菜坛吗？
制作泡菜的原 理就是利用乳酸 菌使蔬菜中的有 机物生成乳酸。 泡菜坛的结构， 既要加盖，还要 用一圈水来封口， 你能推测其中的 科学道理吗？
乳酸菌是异养厌氧型细菌， 乳酸菌是一类可以产生乳酸的细菌的总称。
36
想一想 议一议
P66 养鸡场饲养员像医生一样穿白大褂的原因是什么？
2、培养细菌和真菌的方法分为几个步骤？ 3、请你预测细菌和真菌的分布情况怎样？
40
三.细菌和真菌的分布特点：
• 在生物圈中广泛分布
土壤 水体 空气 工农业产品 人体及动物 极端环境
41
想一想：
• 细菌和真菌的分布如此广泛，那它们的生存都需要哪些条件呢？ • 蘑菇是真菌的一种，你知道它喜欢生活在哪里吗？ • 由此你能推测出什么来？
细菌、真菌培养的一般方法是：
配制培养基 高温灭菌冷却
接种
培养
54
提示:
1.在没有想好如何工作以前,不能打开培养皿 2.在标签纸上标出组别. 实验日期.
将标签贴在培养皿的底面
3.接种时只需抬起培养皿盖子一侧,动作要迅 速,尽量使培养基与空气接触的时间短. 4.在操作中,无菌棉棒只需在物体表面轻轻的 擦过，不能过于用力，更不能把培养基戳破。
在土壤中、水中、空气中 乃至我们的身体上，都可 以找到细菌和真菌。甚至 寒冷的极地，很热的热泉 中，也有他们的踪迹。
不同环境中都有细
菌和真菌吗？我们可
以通过活动来探究。
极端环境（寒冷的极地，热温泉
中，深海的火山口）
20
四、检测不同环境中的细菌和真菌
●科学探究是生物学学习的重要途径,那 么探究的步骤有哪几步呢? P68
氧呼吸而产生乳酸等产物。
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P70 练习： 你见过泡菜坛吗？
制作泡菜的原 理就是利用乳酸 菌使蔬菜中的有 机物生成乳酸。 泡菜坛的结构， 既要加盖，还要 用一圈水来封口， 你能推测其中的 科学道理吗？
乳酸菌是异养厌氧型细菌， 乳酸菌是一类可以产生乳酸的细菌的总称。
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想一想 议一议
P66 养鸡场饲养员像医生一样穿白大褂的原因是什么？
2、培养细菌和真菌的方法分为几个步骤？ 3、请你预测细菌和真菌的分布情况怎样？
40
三.细菌和真菌的分布特点：
• 在生物圈中广泛分布
土壤 水体 空气 工农业产品 人体及动物 极端环境
41
想一想：
• 细菌和真菌的分布如此广泛，那它们的生存都需要哪些条件呢？ • 蘑菇是真菌的一种，你知道它喜欢生活在哪里吗？ • 由此你能推测出什么来？
手卫生微生物学检测的标准
手卫生微生物学检测的标准
手卫生微生物学检测的标准主要包括细菌菌落总数的合格标准。
普通手卫生的细菌菌落数应≤10cfu/cm²，而外科手消毒的细菌菌落数应≤5cfu/cm²。
这意味着在手卫生消毒后，每平方厘米的手部皮肤上，细菌的数量不应超过这些标准。
此外，手卫生消毒效果的监测还应考虑不同环境下的手合格标准。
例如，在Ⅰ类和Ⅱ类区域，细菌菌落总数应≤5cfu/cm²；在Ⅲ类区域，细菌菌落总数应≤10cfu/cm²；在Ⅳ类区域，细菌菌落总数应≤15cfu/cm²。
这些标准旨在确保手部卫生在不同环境下都能达到一定的卫生标准，从而减少细菌感染的风险。
总的来说，手卫生微生物学检测的标准是确保手部清洁和卫生，减少细菌数量，以降低感染的风险。
医务人员和公众都应遵循这些标准，并定期进行手部卫生检测，以确保手部的卫生状况符合要求。
细菌的一般检验方法
细菌的一般检验方法细菌的检验是微生物学中非常重要的一环，它可以帮助我们了解细菌的种类、数量和特性，为疾病的预防和治疗提供重要依据。
而细菌的一般检验方法则是我们进行细菌检验的基础，下面将为大家介绍几种常用的细菌检验方法。
首先，我们来介绍细菌培养法。
这是一种最常见的检验方法，通过在适当的培养基上培养细菌，观察其形态、生长速度、产生的色素等特征来进行鉴定。
细菌培养需要严格控制培养条件，包括温度、湿度、氧气浓度等，以保证细菌能够正常生长。
在培养基上形成的细菌菌落可以通过形态学和生理生化试验来进一步鉴定。
其次，酶标记法也是一种常用的细菌检验方法。
这种方法利用细菌产生的特定酶来进行检测，常见的有氧化酶、还原酶、水解酶等。
通过对细菌培养基添加特定底物，观察产生的色素变化或气体释放等现象，可以判断细菌的种类和数量。
另外，PCR法也是一种快速而准确的细菌检验方法。
PCR法是一种利用DNA聚合酶链式反应来扩增细菌DNA的技术，通过特定引物引导下，可以在短时间内扩增出目标细菌的DNA片段，再通过电泳或其他方法进行鉴定。
除了上述方法，还有一些免疫学方法也常用于细菌的检验，比如ELISA法和免疫胶体金法。
这些方法利用细菌与抗体的特异性结合来进行检测，具有高灵敏度和高特异性。
细菌的一般检验方法虽然多种多样，但每种方法都有其适用的范围和局限性。
在进行细菌检验时，我们需要根据具体的情况选择合适的方法，并结合多种方法进行综合分析，以确保检验结果的准确性和可靠性。
总的来说，细菌的一般检验方法是微生物学研究的基础，它为我们提供了解细菌特性和行为的重要手段。
通过不断的研究和实践，我们可以不断完善和发展细菌检验方法，为保障公共卫生安全和疾病防治提供更可靠的技术支持。
希望本文所介绍的内容能够对您有所帮助，谢谢阅读！。
大肠菌群检测作业标准书ok
4.术语
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
5.操作方法
5.1仪器：
5.1.1冰箱：0℃-4℃
下限
上限
0
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1
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5.4.1.2用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1∶100的稀释液。
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
5.操作方法
5.1仪器：
5.1.1冰箱：0℃-4℃
下限
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5.4.1.2用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1∶100的稀释液。
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2020年7月16日星期四
17
3、菌落数的报告
① 菌落数在1～100时，按“四舍五入”原则， 以整数报告；
② 如大于100时，则报告前面两位有效数字， 第三位数按四舍五入计算。
③ 固体检样以克（g）为单位报告，CFU/g;
④ 液体检样以毫升（mL）为单位报告， CFU/mL;
⑤ 表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告， CFU/ cm2; 。
选择培养温度和时间？
2020年7月16日星期四
22
第二节 食品中大肠菌群的检验
2020年7月16日星期四
23
一、大肠菌群
1、 什么是大肠菌群？ 指一群在37℃能分解乳糖产酸、产气，需氧及兼性
厌氧的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌。 2、大肠菌群的组成:
大肠埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属(又叫 产气杆菌属，包括阴沟肠杆菌和产气肠杆菌)、克雷伯 氏菌属的一部分和沙门氏菌属的第III亚属。
8、稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈 多。如出现逆反现象，不可作为检样计数报告的 依据。
2020年7月16日星期四
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复习题
1、什么是菌落总数？ 2、测定食品、饮料等产品的菌落总数有什么意
义？ 3、画出平板倾注法测定菌落总数的示意图。 4、在测定菌落总数时，如何选择菌落进行计数？ 5、在菌落总数的检验中，要注意哪些事项？ 6、在菌落总数的检验中，如何根据样品的特性
2020年7月16日星期四
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（2）如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数 乘以稀释倍数报告
（3）如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数 乘稀释倍数报告
（4）如菌落数有的大于300，有的又小于30，不在 30～300之间，以最接近300或30的平均菌落数乘 以稀释倍数报告
（5）如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘 以最低稀释倍数报告。
原理：样品经过稀释后，使样品悬液中的细菌分期 存在，接种一定量（一般为1mL）到培养基中，再 加入适量的培养基，充分混匀。从理论上讲，微生 物在培养基中分散呈单个存在，一个菌体长出一个 肉眼可见的菌落。
2020年7月16日星期四
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检 验 步 骤 (程 序)：
2020年7月16日星期四
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（一）样品稀释及做平板
2020年7月16日星期四
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式中：
N——样品中菌落数；
ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之 和；
n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d——稀释因子（第一稀释度）。
2020年7月16日星期四
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注意：旧版标准的做法为：比值小于或等于2取 平均数，比值大于2则其较小数字
3
二、菌落总数测定的意义
1、判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。 2、了解细菌在食品中的繁殖动态。 3、预测食品贮藏期限的长短。
2020年7月16日星期四
4
三、菌落总数测定的方法
※ 平板倾注法＃ 平板表面涂布法 平板表面点滴法
2020年7月16日星期四
5
四、平板倾注法测定菌落总数 GB4789.2-2010
第五章 卫生指标细菌 的检验
第一节 食品中菌落总数的测定
2020年7月16日星期四
2
一、菌落总数
概念：是指食品检样经过处理，在一
定条件下培养后,单位质量（g）、容积 （mL）或表面积（cm2）内所形成的好氧 或兼性厌氧细菌菌落的总数。
是活菌计数，需氧菌数； 不代表实际所有的细菌总数。
2020年7月16日星期四
11
（三）计数和报告
到达规定培养时间，应立即计数。 如果不能立即计数，应将平板放置于 0~4℃，但不得超过24h。
2020年7月16日星期四
12
1、菌落的选择
（1）单个菌做一个菌落计 （2）呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，作为一
个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链 均应按一个菌落计算。 （3）如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀， 则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。
2020年7月16日星期四
10
（二）培养
➢ 倒放平板 ➢ 普通食品：36 ℃±1℃ 48h±2h ➢ 水产品: 30℃±1℃ 72h±3h
如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥
漫生长的菌落时，可在凝固后的平板计数 琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约 4mL），凝固后翻转平板，按上步条件进 行培养。
2020年7月16日星期四
2020年7月16日星期四
18
2020年7月16日星期四
19
(四) 检验注意事项
1、对照平板出现几个菌落时，要追加对照平 板；
2、吸管进出瓶子或试管时，吸管口不得触及 瓶口、管口的外围部分；
3、吸管插入试样液内的深度不得小于2.5cm, 调整时要使管尖与容器内壁紧贴;
4、进行稀释时,吸管口不得与稀释液接触; 5、检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用
1ml 1ml 1ml
1:10
1:100
25g/m 1ml l样品
1:1000 1:10000
1ml
1ml
生理盐 水
1ml
2020年7月16日星期四
加入46℃营养琼脂15~20mL
8
（一）样品稀释及做平板
பைடு நூலகம்
2020年7月16日星期四
9
检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所 用时间不宜超过20min，以防止细菌有所 死亡或繁殖。
2020年7月16日星期四
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属
代表种
埃希氏菌属 （Escherichia） 大肠埃希氏菌 (E.coli)
致病性 肠道外感染， 急性腹泻
志贺氏菌属 （Shigella）
痢疾志贺氏菌 (Sh.dysenteriae) 细菌性痢疾
时间不宜超过20min.
2020年7月16日星期四
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(四) 检验注意事项
6、为防止细菌增殖产生片状菌落，在检液加入平皿后， 应在20min倾入琼脂，并立即使之与琼脂混合均匀。 (在平面上先左右摇动，后顺时针和逆时间旋转)
7、加入平皿内的检样稀释液有时带有检样颗粒，需加 做平皿放在4℃的环境中，以便计数时排除颗粒的 影响。
2020年7月16日星期四
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2、平板菌落计数的选择
(1) 选取菌落数在30～300之间的平板（SN标 准要求为25～250个菌落）
➢ 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计 数范围内，计算两个平板菌落数的平均值， 再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g （mL）样品中菌落总数结果。
➢ 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计 数范围内时，按公式（1）计算：