免疫组化常用方法
检验科免疫组化常见检测与分析方法
检验科免疫组化常见检测与分析方法免疫组化技术是一种利用免疫学原理，通过检测和定位特定蛋白质在组织或细胞中的表达水平和位置的方法。
在医学检验科中，免疫组化技术被广泛应用于疾病的诊断、治疗及预后评估。
本文将介绍一些常见的免疫组化检测与分析方法。
一、免疫组化染色法免疫组化染色法是免疫组化技术中最常用的方法之一。
它通过采用免疫荧光、酶标记、金标记或放射性标记等技术，将特定抗原与特异性抗体结合，并通过染色或荧光的方式来显示其位置和表达水平。
免疫组化染色法广泛应用于各种疾病的诊断，如肿瘤标记物的检测、感染性疾病的诊断等。
二、免疫组织化学法免疫组织化学法是一种在组织切片上进行免疫组化染色的方法。
它通过对切片进行蛋白质抗原的恢复处理和抗体的特异性结合，来检测和显示抗原在组织中的位置和表达水平。
免疫组织化学法主要应用于病理学领域，帮助医生确定疾病的类型和分级。
三、免疫荧光法免疫荧光法是利用特异性抗体与抗原结合后，在显微镜下观察抗原在组织或细胞中的分布情况和表达水平的技术。
免疫荧光法具有高灵敏度和高特异性的优点，被广泛应用于自身免疫性疾病、感染性疾病等的诊断。
四、免疫电镜法免疫电镜法是一种在电镜下观察和检测抗体与抗原结合的方法。
它通过在样品上标记抗体或抗原，然后利用电镜来观察并获得高分辨率的图像。
免疫电镜法主要用于对超微结构进行研究和观察，是研究细胞和组织的重要手段。
五、免疫组化信号放大技术免疫组化信号放大技术是一种能够放大免疫染色信号并提高染色效果的方法。
常见的免疫组化信号放大技术包括多聚酶法、银增强法、酶蛋白复合物法等。
这些技术在免疫组化检测中可以提高检测的灵敏度和准确性。
免疫组化技术因其高度敏感、高特异性和定量分析的优势，成为了疾病诊断与治疗中不可或缺的重要方法。
随着技术的发展和创新，免疫组化技术将在临床医学中发挥越来越重要的作用。
综上所述，本文介绍了免疫组化检测与分析的常见方法，包括免疫组化染色法、免疫组织化学法、免疫荧光法、免疫电镜法以及免疫组化信号放大技术。
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。
如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。
就拿温度来说，可以有4 度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。
2、免疫组化最大的优势是定位和定性。
相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。
尤其对于有些因子的转位研究十分有用。
3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。
免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。
4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。
阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。
前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。
5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。
如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。
当然也不能做假阳性或假阴性结果。
6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。
我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。
免疫组化常用的对照方法
免疫组化常用的对照方法
免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种用于检测组织或细胞中特定蛋白质表达的技术。
在进行免疫组化实验时，对照组是非常重要的，它可以帮助确定实验结果的准确性和可靠性。
以下是免疫组化常用的对照方法：
1. 阴性对照，阴性对照是使用不含目标蛋白的组织样本或细胞作为对照。
这可以帮助排除假阳性结果，即实验结果中出现的信号并非由于目标蛋白的存在所致。
2. 正性对照，正性对照是使用已知含有目标蛋白的组织样本或细胞作为对照。
这可以确保实验条件下目标蛋白的免疫反应性，并验证实验方法的可靠性。
3. 内部对照，内部对照是在同一组织样本或细胞中使用与目标蛋白不同但稳定表达的蛋白作为对照。
这有助于纠正实验中可能存在的变异性，如组织处理、染色效果等。
4. 同型对照，同型对照是使用与目标蛋白相同种属来源的免疫球蛋白（IgG）作为对照。
这可以帮助排除实验中可能存在的非特异
性结合或交叉反应。
以上是免疫组化常用的对照方法，正确选择和使用对照可以有效地确保免疫组化实验结果的准确性和可靠性，为科研工作提供有力的支持。
免疫组化操作方法
免疫组化操作方法免疫组化是一种常用的实验方法，用于检测和定位细胞或组织中特定蛋白质的表达。
它结合了免疫学和生化学的原则和技术，可以提供对细胞或组织中不同蛋白质的分子特征、活动状态和相互作用的信息。
本文将详细介绍免疫组化的操作方法，包括材料和试剂的准备、标本的制备和固定、抗原检测和可视化等步骤。
材料和试剂的准备1.活体或固定的细胞或组织标本。
2.组织培养基和适当的培养器具。
3.PBS(磷酸缓冲盐溶液)或其他细胞/组织冲洗缓冲溶液。
4.组织切片刀、显微刀片、显微镊子、镊子等操作工具。
5.细胞/组织固定剂，如乙醛、甲醛、乙酸乙酯等。
6.可溶性和固相抗原检测试剂，如抗体、蛋白质等。
7.染色试剂，如荧光染料、酶底物等。
8.实验室耗材和设备。
标本的制备和固定1.如果使用活体标本，如细胞培养物，应先将其转移到无菌培养器皿中，并在适当的培养条件下培养至合适的生长期。
2.对于组织标本，可以通过切片或切块的方式进行制备。
切片时要求切片薄而均匀，一般为5-10μm。
切块时要求尽量保持组织完整性。
3.制备好的细胞或组织标本需要尽快进行固定，以保持其形态和蛋白质的天然状态。
常用的细胞/组织固定剂有乙醛、甲醛和乙酸乙酯。
不同的固定剂选用方法有一定差异，具体应根据实验要求和文献建议进行选择。
抗原检测和可视化1.固定后的标本需要进行脱水和透明化处理，以便于抗原检测的进行。
可以使用乙醇或队列进行脱水处理，然后用透明化溶剂进行透明化处理。
2.抗原检测需要使用抗体识别目标蛋白质。
对于免疫组织化学，常用的抗体类型包括一抗和二抗。
一抗为直接与目标抗原反应的抗体，二抗为与一抗结合并由可视化标记物进行信号产生的抗体。
一抗和二抗的选择应根据目标抗原和实验要求进行合理选择。
3.免疫染色前，可进行一些前处理步骤以增强染色效果，如抗体预处理、抗原修复、背景消除等。
4.免疫染色操作中，需要逐层进行抗体处理、洗涤和可视化标记物处理。
一般步骤包括：一抗与标本结合、一次洗涤、二抗与一抗结合、二次洗涤、可视化标记物与二抗结合、最终洗涤。
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤
免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测和鉴定生物样本中的特定分子。
下面我会给出大致的免疫组化操作步骤，供你参考。
1.样本处理：将生物组织或细胞样本获取并处理成合适的形式，如切片或细胞悬液。
2.预处理：对于组织样本，可以使用甲醛等固定剂或冰冻保存。
对于细胞样本，也可以用1%的乙醇醋酸钠或甲醛冷冻保存。
3.抗原结构暴露：对于组织样本，可以使用抗原恢复液如缓冲盐水或热诱导抗原恢复等来暴露抗原结构。
对于细胞样本，可以用洗涤缓冲液洗涤，以去除细胞外蛋白质，并暴露出内部抗原。
4.阻断非特异性结合：使用非特异性结合物（如牛血清白蛋白、大肠杆菌蛋白等）进行阻断，以减少非特异性的背景信号。
5.抗体结合：加入目标抗体，与待测分子特异结合。
6.洗涤：洗涤掉未与抗体结合的废液，减少背景信号。
7.二抗结合：加入辣根过氧化物酶标记的二抗，与目标抗体结合，形成目标抗体-二抗复合物。
8.再次洗涤：冲洗掉未与二抗结合的废液，减少背景信号。
9.底物添加：加入染色底物，辣根过氧化物酶催化产生可见信号。
10.反应停止：停止底物活性，如加入酸性溶液。
11.显微镜观察：将样本放置在玻璃载玻片上，使用显微镜观察并记录结果。
12.图像分析：使用光学显微镜或荧光显微镜等设备获取图像，使用图像分析软件进行定量分析。
需要注意的是，实际操作中会根据具体的实验目的和技术要求进行适当的修改和调整。
免疫组化在科学研究和临床诊断中都有广泛应用，可以用于检测肿瘤标志物、病原体、免疫相关分子等，对于疾病诊断和治疗具有重要意义。
免疫组化方法
免疫组化方法
免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测组织或细胞中特定蛋白质
的表达和定位。
其基本原理是利用特异性抗体与目标蛋白质结合，再通过
染色或荧光标记等方法来检测抗体与蛋白质的结合情况。
免疫组化方法主
要包括以下几个步骤：1.样品制备：将组织或细胞样品固定、切片或涂片
等处理，以便于后续的抗体结合和检测。
2.抗原修复：对于某些抗原易于
失活或难以检测的样品，需要进行抗原修复处理，如加热、酶解等，以恢
复抗原的结构和活性。
3.抗体结合：将特异性抗体加入样品中，与目标蛋
白质结合形成免疫复合物。
抗体可以是单克隆或多克隆，也可以是直接标
记或间接标记的。
4.洗涤：用缓冲液洗涤样品，去除未结合的抗体和杂质，以减少假阳性的干扰。
5.检测标记：将荧光标记、酶标记或金标记等标记
物加入样品中，与免疫复合物结合，以便于检测和定位。
6.显色或荧光：
通过染色或荧光显微镜等设备，观察样品中的免疫复合物的分布和定位，
以确定目标蛋白质的表达和定位情况。
总之，免疫组化方法是一种高灵敏度、高特异性的实验技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开
发等领域。
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的存在和定位。
其步骤包括样本制备、抗原去原、阻断试验、一次抗体处理、二次抗体处理、显色和镜检。
下面将详细介绍每个步骤：1.样本制备：收集需要检测的样本，可以是细胞、组织或体液。
样本收集后，需要进行固定和切片处理，以保持细胞和组织结构的完整性。
2.抗原去原：蛋白质在组织中可能会被结构和其他因素影响，使其在免疫组化实验中难以被检测到。
因此，需要进行抗原去原处理。
常用的方法有热处理、酸碱处理、酶解处理等。
3.阻断试验：细胞和组织常常会存在非特异性结合位点，会使得后续的免疫反应变得模糊不清。
为了减少这种非特异性结合，需要进行阻断试验。
常用的阻断试验方法有牛血清白蛋白（BSA）、动物血清等。
4.一次抗体处理：在一次抗体处理步骤中，需要准备与目标蛋白质特异性结合的一次抗体。
将制备好的一次抗体加入样本中，使其与目标蛋白质发生反应，并形成抗原抗体复合物。
5.二次抗体处理：一次抗体只能与抗原结合，无法提供光学信号。
因此需要加入与一次抗体结合的二次抗体，该二次抗体与荧光物质或酶偶联，可以提供可视化信号。
常见的二次抗体有HRP（辣根过氧化物酶）、荧光染料等。
6.显色：通过加入合适的显色底物，可以使得与二次抗体结合的酶产生可见的颜色反应。
常用的显色底物有DAB（3,3'-二氨基联苯），其在酶的作用下会产生棕色的显色产物。
7.镜检：最后一步是使用光学显微镜对样本进行观察和分析。
通过镜检可以确定抗原存在的位置和分布情况，并对结果进行定量分析。
总结：免疫组化是一种确定蛋白质存在和分布的重要实验技术。
通过以上步骤的顺序操作，可以获得可靠的结果。
实验人员需要熟悉每个步骤的操作方法，并根据实验样本的要求进行调整和优化，以获得准确和可重复的结果。
06 免疫组化常用方法
1
B. 1966年, Nakane和Pierce研发了用HRP作为标记物的酶 标抗体法. 该法结果可永久保存, 但因酶和抗体之间形成 化学键时可能影响双方活性, 造成敏感度降低. C. 1970年, Sternberger等研发了未标记抗体法大大提高了 敏感度, 并将酶和抗酶抗体制成复合物(PAP)以便储存, 使 用和商业化. D. 1971年, Faulk和Taylor研发了胶体金标记的抗体在EM下 检查表面抗原, 但检测内部抗原时因金颗粒穿透力差较 造成敏感度降低. E. 1981年, Hsu等研发了抗生物素蛋白-生物素(AvidinBiotin)系统, 形成比PAP法还要敏感的ABC法. 两者的有色 终产物可用普通LM观察或锇(Os)化后在EM下观察, 但锇 化常掩盖超微结构.
3
DAB-H. 1st anti-urokinase (尿激酶).Human mammary carcinoma tissue.
4
C. 未标记抗体酶法: 酶桥法. 一抗和二抗均未被酶标记. 通 常利用二抗作为桥, 将一抗和终抗体连接起来, 而终抗体 为抗酶抗体(即被酶标记), 产生于与一抗来源相同的动物 种属. 终抗等常被制成复合物形式, 如碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)-抗碱性磷酸酶(APAAP), 过氧化物酶 (Peroxidase)-抗过氧化物酶(PAP), 抗生物素蛋白(Avidin)-生 物素(Biotin)-过氧化物酶复合物(ABC)法, 以及蛋白A法等. 1. APAAP法: 一抗为兔抗鼠IgG, 二抗用未标记的羊抗兔IgG, 终抗是提前制成的AKP-兔抗AKP复合物. 其中二抗需过量, 其一个Fab段与一抗结合, 另一个Fab段与兔APAAP复合物 中抗酶抗体结合.
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标记生物素-抗生物素技术(Labelled Avidin-biotin technique,LAB技术)
2.差异大,注意厂家、批号
3.4C保存
Disadvantages of ABC
1.ABC的IP约为10,中性pH时带正电荷,容易与nucleus等带负电荷结构非特异结合.
2.Avidin是glycoprotein,与lectins等分子通过碳水化合物连接
•通过用streptavidin(抗生蛋白链霉素)代替avidin克服上述缺陷.
3.标本:不能太厚
4.封裱剂:无自发荧光,无色透明,pH8.5-9.5,常用甘油和0.5mol/L pH9.0-9.5碳酸盐缓冲液等量混合
5.镜油:无荧光镜油,或甘油或液体石蜡
2.Enzyme-Mediated Detection
直接法(Direct)
间接法(Indirect)
基本原理
•以间接法法为例
•阳性对照：已知阳性
•阴性对照：
1.已知阴性
2.空白对照BS代替特异性抗体
3.替代对照:用同种属正常血清代替特异性抗体
4.吸收实验:先用抗原吸收一抗
5.抑制实验:先用未标记抗体,再用标记抗体
6.置换实验:用无关的特异性抗体代替一抗
Antibody Detection
• There are several different methods that can be employed to detect antibodies bound to tissue, depending upon whether the label used is enzymatic or fluorescent.
•光源寿命有限,应集中观察,防止反复点燃,灯熄后应充分冷却才能再次点燃,一次观察时间不能太长,以2-3h内为宜
•标本染色后应尽快观察,存放在4C能延缓荧光衰减,标本不能长时间暴露于紫外线
荧光显微镜标本制作要求
1.载玻片:厚度均匀,0.8-1.2mm之间,光洁,无自发荧光
2.盖玻片:厚度0.17mm,光洁
•一抗是对组织细胞内某种抗原的特异性抗体（80-90%多抗由家兔制得，单抗由小鼠制备）
•二抗为一抗（IgG）的抗体。
•优点：只要一抗来自同一种属，同一标记的二抗就能用来显示不同的抗原，避免了直接法标记每一种一抗，提高了敏感度。
酶标抗体法的特点
•用于标记的酶应具备以下几点:
1.酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，易于光、电镜观察
抗原与抗体、植物凝集素与糖类、生物素与抗生物素、SPA与IgG、阳离子与阴离子、配体与受体等。
• Avidin-Biotin interactions or other commercially-available amplifiers
生物素-抗生物素基本原理
• Avidin卵白素，统称为抗生物素或亲和素a basic glycoprotein，MW 68 Kd
7.载体蛋白抗体:制备半抗原的抗体时,使用了载体蛋白,用固相吸收技术将载体蛋白抗体除去
增加染色强度方法
1.重复显色
2.重复一抗
3.双桥PAP法
亲和组织化学（Affinity histochemistry）
•新技术的出现----新进展
•特点一些具有双价或多价结合力的物质如植物凝集素(Lectin)、生物素（Biotin）和葡萄球菌A蛋白（Staphylococcal protein, SPA）等被应用于ICC，其共同特点是以一种物质对某种组织成分具有高亲和力为基础。它们既有别于古老的组织化学的分解、置换、氧化和还原，本质上又非抗原抗体反应。称为亲和组织化学（Affinity histochemistry）。广义的亲和组织化学包括：
Antibody Staining
• Primary antibody may be directly labeled
• labeled secondary antibody or more complex detection system.
• secondary antibody against the immunoglobulins of the primary antibody source
过氧化物酶抗过氧化物酶法(Peroxidase Antiperoxidase ,PAP法)
•原理与酶桥法相似
•制备PAP复合物:使抗HRP抗体与HRP形成可溶性复合物
PAP复合物的特征
•在抗原稍过量时,所有抗HRP抗体均参与形成可溶性PAP复合物
• PAP复合物的形状相当稳定,不受抗原量的影响
• PAP复合物中HRP/抗HRP抗体的比例为3:2,即由3个HRP分子与2个抗HRP抗体组成,呈五角形结构
• Streptavidin: a protein (MW 60 Kd) isolated from the bacterium Streptomyces avidinii(链霉亲生物素蛋白), and like avidin, has four high affinity binding sites for biotin. IP接近中性,在中性pH时很少带电荷, not a glycoprotein and therefore does not bind to lectins.
1）脱蜡、水化组织切片。
2）预处理组织切片（据一抗具体说明而定）
3）蒸馏水漂洗，置于TBS中。
4）阻断内源性过氧化物酶（仅用于EnVisionTM/HRP）
5）蒸馏水漂洗，置于TBS，10分钟
6）一抗孵育10-30分钟
7）TBS漂洗10分钟
8）EnVisionTM孵育10-30分钟
9）TBS漂洗10分钟
减少或消除非特异性染色的方法
•最常见原因蛋白吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上
•最有效方法
1.在用第一抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清（1:5-20）10-20min，
2.加入2-5%牛血清白蛋白可进一步减少非特异性染色，
3.用除制备第一抗体以外的其它动物血清（非免疫的）
对照实验
主要是针对第一抗体对照，常用方法：
10)色源底物溶液孵育10分钟
11)蒸馏水漂洗
12)复染及封片
免疫染色方法
The basic principles of ICC
•抗原抗体反应
•标记化学反应
•呈色化学反应
要求
待检标本形态结构
和抗原性保存良好,Байду номын сангаас
抗原不从原位扩散
或丢失
Specimen preparation
取材新鲜，固定及时，形态保存完好，抗原物质的抗原性不丢失、不扩散和被破坏
2.所形成的终产物必须稳定,不能弥散
3.较易获得,价廉,最好已商品化
4.组织中不应存在内源性酶或类似物质
5.酶应稳定,标记后保持酶和抗体的活性
缺点酶与抗体共价结合损害部分抗体和酶的活性
三步法(HRP labelled)
多层反应法
Alkaline Phosphatase - Anti-Alkaline Phosphatase (APAAP) Technique
免疫组化常用方法
二步法：EnVision System
EnVision显色系统是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即
EnVision）直接放大信号40-50倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。特点：敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生物素干扰）。
EnVision工作程序：
1. Fluorescence
2. Enzyme-Mediated Detection
3.亲和组织化学（Affinity histochemistry）
1. Fluorescence
Directly Indirectly
直接法间接法
补体法
双标法
使用荧光显微镜的注意事项
•暗室
•点燃汞灯5-15min,稳定后再开始观察
PAP法的评价
•抗体活性高:非标记抗体酶法最大限度地保存了抗体活性
•灵敏度高:3个酶分子对应1个抗原
•不适合免疫电镜AP复合物分子量大
•背景染色低
假阴性及其处理
假阳性及其处理
1.组织细胞内色素:如神经黑色素,可用AKP代替HRP
2.假过氧化物酶活性:如RBC内的血红素辅基,用甲醇-0.3%H2O2预处理15-20min(室温)
• biotin生物素，small water soluble vitamin（vitamin H），MW 24Kd，
• Avidin(卵白素)具有4个同biotin(生物素)亲和力极高（较抗原抗体高100万倍）的结合点。能够彼此牢固结合而不影响彼此的生物学活性。同时它们都具有与其它示踪剂结合的能力。
3.内源性过氧化物酶活性:如粒细胞、巨噬细胞等，用AKP代替HRP
4.游离醛基:与蛋白质(含IgG)非特异性结合,用白蛋白预孵育封闭之
5.疏水键和离子键: Ig可通过疏水键和离子键与组织中的碱性蛋白或Fc受体非特异性结合,用正常血清(首选制备二抗的种属)于一抗前孵育封闭之
6.天然抗体及不纯抗体:增加一抗稀释度
• Fixation
• Sample Type
Cryostat (frozen) sections
Paraffin Sections
Antigen Retrieval Techniques
• Intention: To facilitate the immunological reaction of antibodies with antigens (increase reactivity of the majority of antigens) .