无菌检查和微生物限度检查操作规范
药包材微生物限度检查操作规程
药包材微生物限度检查操作规程药包材微生物限度检查操作规程一、目的与范围为保障药包材的卫生质量，规范药包材微生物限度检查操作，本操作规程适用于药包材微生物限度检查。
二、术语与定义1. 药包材：指用于药品包装的材料，如玻璃瓶、铝箔、袋子等。
2. 微生物限度：指药包材中的微生物污染的数量不能超过一定的限度。
3. 检查样品：指从药包材中取样检查的样品。
三、操作流程1. 准备工作1.1 检查人员应在工作前进行手部消毒，并佩戴洁净工作服、帽子和口罩。
1.2 检查仪器设备应进行清洁和消毒，确保无污染。
1.3 首次使用检查样品前，应进行无菌处理。
2. 取样2.1 根据药包材的特点，选择合适的取样方法，如剪刀剪取、刮取等。
2.2 取样时应注意避免污染，避免手部和工具的直接接触。
2.3 取样应充分代表药包材的不同部位和不同批次。
3. 样品处理3.1 将取样的药包材放入无菌容器中，避免接触外界环境。
3.2 添加合适的培养基，保证微生物生长。
3.3 药包材中的微生物落菌数较多时，可对样品进行稀释处理。
4. 培养和观察4.1 将培养基接种完毕后，密封容器，确保无菌。
4.2 将培养基置于适宜的温度和湿度条件下培养。
4.3 观察培养基是否出现细菌、真菌等微生物的生长。
5. 计数和判断5.1 培养基培养一定时间后，根据培养基上的菌落形态、颜色等特征进行初步判断。
5.2 将培养基进行放大培养，使用显微镜观察细菌、真菌的形态和结构，进行进一步鉴定。
5.3 使用计数板对菌落进行计数，记录每种微生物的数量。
5.4 根据国家规定的微生物限度标准，判断样品是否合格。
6. 结果记录和分析6.1 将检查结果记录在相应的记录表中，包括药包材名称、样品编号、微生物种类和数量等信息。
6.2 对合格的样品进行合格认证，对不合格的样品进行处理和记录。
6.3 对不合格的样品进行原因分析，查明污染源，并采取相应的措施进行处理和纠正。
四、操作注意事项1. 所有操作应在洁净室中进行，避免外界空气和微生物的污染。
微生物限度检查仪操作规程
微生物限度检查仪操作规程一、目的本操作规程旨在规范微生物限度检查仪的使用，确保检查结果的准确性和可靠性。
二、适用范围本操作规程适用于所有使用微生物限度检查仪进行微生物检测的实验室。
三、设备准备1.检查仪器：确保检查仪器处于正常工作状态，且已经进行了日常的校准和验证。
2.试剂准备：准备好所需要的试剂和培养基，并按照说明书进行储存和使用。
四、操作流程1.样品准备-将待测样品进行预处理，如稀释、过滤等操作，以确保检测结果的准确性。
-按照要求取样品，确保样品的代表性，并且避免外部污染。
-将样品转移至无菌容器中，避免交叉污染。
2.检测操作-打开检查仪器的电源，确保所有参数显示正常。
-设置检测参数，包括样品体积、培养基类型等。
-在无菌条件下，将样品转移到培养基中，确保样品均匀分布。
-在培养基上绘制分类孔，确保每个样品有足够的空间生长。
-关闭培养皿，确保培养皿与培养基接触紧密，并有利于微生物的生长。
-将培养皿放入检查仪器中，确保培养皿的摆放位置正确。
-启动检查仪器，按照仪器的要求进行检测。
-检测结束后，关闭检查仪器，将培养皿取出并妥善处理。
五、数据分析与记录1.对于生长的微生物，根据标准方法进行鉴定，并记录鉴定结果。
2.对于未生长的微生物，根据标准方法进行计数，并记录计数结果。
3.对于得到的结果，根据相关标准进行数据分析，并判断样品是否符合微生物限度要求。
4.将检测结果和分析记录在相关的数据表格或文件中，确保数据的可追溯性。
六、设备维护与清洁1.检查仪器的日常维护工作包括：定期校准、保养和维修。
2.定期清洁检查仪器的内部和外部部件，确保检查仪器的清洁和卫生。
3.根据仪器的使用说明书，进行规定的维护和保养工作。
七、风险控制1.在操作过程中，严格遵守相应的操作规程和安全要求，确保个人和环境安全。
2.如发现异常情况或设备故障，应立即停止操作，并及时报告相关人员进行处理。
3.定期开展培训和教育，提高操作人员的专业知识和操作技能。
微生物限度及无菌检查
计数方法适用性检查
1.供试液的制备
u 水溶性供试品 u 非水溶性供试品：可适量加入如聚山梨酯80等表面活性剂，加入量及加 入的试剂均需进行验证，以证明其无明显抑菌性。 u 油性供试品：十四烷酸异丙酯或其它无抑菌性的表面活性剂。 u 肠溶供试品：一般肠溶制剂用pH8.6磷酸盐缓冲液，结肠制剂用pH7.6磷 酸盐缓冲液。
阳性对照组：相当于1g或1ml的供试液+不大于 100cfu的目标菌
阴性对照组：与供试液同体积的稀释液
耐胆盐格兰阴性菌检查
1.供试液制备和预培养：取供试品10g，加胰酪大豆胨液体培养基至100ml，放置20~25℃培养 约2小时内。 2.定性试验：取1:10的供试液10ml，加至肠道菌增菌培养基中（加入量应经过验证），此方法 适用于标准为不得检出的供试品。 3.定量试验：三管法，同上述MPN法，每级稀释级均取1ml加入一管培养基中。 4.选择与分离：取上述培养物划线于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上。 5.结果判断：若紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长，定性试验判断是否检出；定量试验 则对应培养管，查表确定供试品中含有耐胆盐格兰阴性菌的可能菌数。
概要
实验室 管理要
求
菌种管 理
培养基 适用性 检查
微生物 限度检
查
无菌检 查
总体要求： 各功能区域应明确标识，特别是菌种储藏室、污染物处理
区、阳性菌室等存在生物安全危害的区域。
洁净室要求： 洁净室作为药品微生物实验室的核心区域，应远离交通干道、厕所及污染区，
应选上、下水道及其他安装适宜的位置。 洁净室与各配套功能区，包括清洗、培养基配制、消毒/灭菌、灭菌物品存放和
洁净度级 过滤完整性 别
气流组织
A级
B级
微生物限度检查法标准操作规程
1.目的建立微生物限度检查法的标准操作规程，规范微生物限度检验操作。
2.范围适用于QC生测室微生物限度检查的操作。
3.责任人微生物限度检验员、QC部负责人对本规程的实施负责。
4.依据《中国药典》2010版二部附录5.程序5.1.微生物限度检查法定义微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。
检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。
5.2.微生物限度检查室环境要求微生物限度检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
5.3.抽样5.3.1.供试品一般按批号随机抽样。
5.3.2.抽样量为一般检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。
5.3.3.抽样时，凡发现有异常可疑的样品，应选有疑问的样品，但因机械损伤明显破裂的包装不得作为样品，凡已能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、长霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格，无需再抽样检验。
5.4.供试品保存5.4.1.供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，以防供试品中的污染菌因保藏条件而引起致死、损伤或繁殖。
5.4.2.供试品在检验之前，应保持原有包装状态，严禁开启，包装已开启的样品不得作为供试品。
5.5.检查前的准备5.5.1.用具的洗涤与灭菌5.5.1.1.试管：使用过的试管经消毒后，将培养基倒出，用清洁液洗刷，用水冲洗4-5次，倒立，晾干备用。
灭菌前，用棉塞塞上管口，牛皮纸包紧，扎紧。
5.5.1.2.吸管：使用过的吸管用清洁液浸泡数分钟后，用水冲洗4-5次，晾干，备用。
灭菌前，在吸管上端距0.5cm处塞入约2cm左右的适当疏松棉花，用牛皮纸裹紧。
5.5.1.3.研钵：使用过的研钵用清洁液洗刷后，用水冲洗数次，晾干备用。
微生物限度检查标准操作规程
微生物限度检查标准操作规程一、引言。
微生物限度检查是指在制药生产过程中，对原料药、辅料、中间体、制剂等药品进行微生物检查的一项重要工作。
微生物限度检查的目的是为了保证药品的质量和安全，防止因微生物污染而引起的药品变质和危害患者健康的风险。
本操作规程的目的是规范微生物限度检查的操作流程，确保检查结果准确可靠。
二、适用范围。
本操作规程适用于制药企业进行微生物限度检查的操作人员，包括检验员、操作人员等。
三、术语和定义。
1. 微生物限度，指药品中允许存在的微生物的最大数量，通常以菌落形成单位（CFU）或细菌总数来表示。
2. 微生物限度试验，是指对药品中的微生物进行检查的一种实验方法，包括细菌总数、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、霉菌和酵母菌等指标。
3. 标准菌株，指已经鉴定并保存在实验室中的具有代表性的微生物菌株。
四、操作流程。
1. 样品准备。
（1）取样品，按照规定的取样方法，从所检查的药品中取得代表性样品。
（2）样品处理，根据检测要求，对样品进行必要的处理，如稀释、均质等。
2. 培养基制备。
（1）准备培养基，根据检测要求，准备所需的培养基，包括琼脂培养基、液体培养基等。
（2）灭菌处理，对培养基进行高压蒸汽灭菌处理，确保培养基的无菌状态。
3. 菌种接种。
（1）接种方法，根据检测要求，选择适当的接种方法，包括平板法、涂布法等。
（2）接种数量，根据微生物限度试验的要求，按照规定的接种数量接种标准菌株。
4. 培养条件。
（1）温度控制，根据不同的微生物菌种，控制培养的温度，通常为30-35摄氏度。
（2）培养时间，根据微生物限度试验的要求，培养一定的时间，通常为24-48小时。
5. 菌落计数。
（1）观察菌落，根据培养基上的菌落形成情况，进行菌落计数。
（2）结果判定，根据菌落计数的结果，判定样品中微生物的数量是否符合规定的限度要求。
五、质量控制。
1. 内部质量控制，每批次微生物限度试验前，进行内部质量控制，确保实验条件的稳定性和可靠性。
医疗器械产品无菌和微生物限度检查法
（8）检验方法 （9）污染废弃物的处理 （10）检测结果的质量保证和检测的质量控制 （11）实验记录 （12）结果的判断和检测报告 （13）文件
一、微生物实验室质量管理指导原则
1.人员
（1）检验人员要求
✓ 具备微生物学或相近专业知识的教育背景 ✓ 必须熟悉相关检测方法、程序、检测目的和结果评价 ✓ 岗前培训 ✓ 持续培训 制定继续教育计划，保证知识与技能不断的更新
应根据检验目的选择适宜的方法进行样品检验
✓ 检验方法的验证
1 药典方法或标准中规定的方法是经过验证的，当进行样品检验时 ， 应进行方法适用性确认
2 如果不是药典或标准中规定的方法，使用前应进行替代方法的验 证，确认其应用效果优于或等同于药典方法
3 替代方法的验证按药品微生物检验替代方法验证指导原则（通则 9201）进行
防措施
一、微生物实验室质量管理指导原则
12.结果的判断和检测报告
✓ 样品检验应有重试的程序 ✓ 微生物实验室检测报告应该符合检测方法的要求 ✓ 实验室应准确、清晰、明确和客观地报告每一项或每一
份检测的结果
一、微生物实验室质量管理指导原则
13. 文件
✓ 文件应当充分表明试验是在实验室里按可控的检查法进行的 ✓ 一般包括
一、微生物实验室质量管理指导原则
6. 设备
✓ 一般要求
（1）微生物实验室设备配备
➢ 与检验能力和工作量相适应
➢ 类型、测量范围和准确度等级
应满足检验所采用标准的要求
（2）设备的安装和布局
➢ 便于操作 ➢ 易于维护 ➢ 易于清洁和校准 ➢ 保持清洁 ➢ 保持良好工作状态
（3）唯一标识
➢ 用于试验的每台仪器、设备应该有 唯一标识
微生物限度检查法标准操作规程3篇
微生物限度检查法标准操作规程第一篇：微生物限度检查法标准操作规程概述1.引言微生物限度检查法（Microbial Limit Test, MLT）是药品、医疗器械、食品和化妆品等生物制品产品质量控制检验的重要手段之一。
它的意义在于保证制品中微生物污染的可控性，保障产品的安全有效性。
本篇文章将围绕微生物限度检查法的标准操作规程，对其概述进行介绍。
2.主要内容2.1 微生物限度检查法的定义微生物限度检查法（Microbial Limit Test, MLT）是指对药品、医疗器械、食品和化妆品等生物制品产品中细菌和真菌等微生物数量进行检查的方法和标准。
它是评价产品质量与卫生安全性的重要方法。
2.2 微生物限度检查法的目的微生物限度检查法的目的在于评价药品、医疗器械、食品和化妆品等生物制品产品中的微生物数量是否在规定的限度范围内，以保证产品的安全性和有效性。
同时，微生物限度检查法也可为制品的生产、质量控制和质量管理提供有效依据。
2.3 微生物限度检查法的适用范围微生物限度检查法适用于药品、医疗器械、食品和化妆品等生物制品的质量控制检验。
其中，针对药品类，在我国《药典》中有详细规定。
3. 微生物限度检查法的标准操作规程3.1 样品处理样品处理过程应密闭、无菌且保持无菌状态。
洗手、穿戴无菌工作服及手套等工艺应符合规定，以避免二次污染。
3.2 检验方法微生物限度检查法主要分为计数法和筛选法，具体方法可根据制品的特性进行选择使用，并符合规定的国家标准。
对于细菌，常用的检验方法包括菌落计数法、薄膜过滤法等；对于真菌，常用的检验方法包括直接涂片法、薄膜过滤法等。
3.3 限度对于不同的制品，在药品中通常采用菌落计数法，在制品中微生物的限度规定一般标准分别为：细菌总数不超过10^3CFU/g或/mL，霉菌和酵母菌总数不超过10^2CFU/g或/mL。
3.4 结果判定若检测出的微生物数目符合规定限度，则判定结论为合格；若其中一个指标不符合规定，则判定为不合格。
微生物限度检查法标准操作规程完整
3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性检查 供试品微生物计数中 所使用的培养基应进行适用性检查。供试品的微生物计数方法应进行方法适用性 试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。
4、菌种及菌液的制备
试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0袋），并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。计数培养基适用性检查和计数方法 适用性试验。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B) 10104]
大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B) 44102])
乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)[CMCC(B) 50094]
白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98001]
薄膜过滤法采用的滤膜孔径不大于。滤膜直径一般为50mm。滤器及滤膜使用 前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供 试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。为发挥滤膜的最大过滤效率，应 注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要 用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量不超过100ml，总冲洗量不得超过1000m1；以免滤膜上的微生物受损伤。取照上述“供试液的制备”和“接种和 稀释”制备的供试液适量（一般取相当于1g、1ml、10cm2的供试品，若供试品 中所含菌数校对，供试液可酌情减量），加至适量的稀释液总，混匀，过滤，用 适量的冲洗液冲洗滤膜。测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨 琼脂培养基平板上；测定霉菌和酵母菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖 琼脂培养基平板上，按规定条件培养、技术。每株试验菌每种培养基至少制备1张滤膜。同法测定供试品对照组和菌液对照组菌数。
微生物限度检查操作规程
更改历史微生物限度检查操作规程1.0 目的建立微生物限度检查标准操作规程，规范检验操作，确保检验结果准确2.0 范围适用于本公司采用微生物限度检查法测定的供试品。
3.0 职责质量部负责按本规程的要求执行微生物限度检查操作。
4.0 工作程序4.1 洁净区间的确认微生物计数检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全部过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品（即待检样品、产品）中微生物的检出。
4.2 培养基4.2.1 应使用按中国药典处方及规定的方法制备的培养基。
4.2.2 所用培养基可按中国药典规定的处方及制备方法自行配制，也可使用按中国药典规定的处方生产的脱水培养基进行配制；或购买商品化的预制培养基。
4.2.3 配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
制备好的培养基若不即时使用，应置于无菌密闭容器中，在2~25℃、避光的环境下保存。
4.2.4 胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数。
4.2.5 供试品微生物计数、控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
4.2.6 供试品的微生物计数方法、控制菌检查方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数或控制菌检查。
4.3 菌种及菌液制备检查所用的菌种及菌液制备见附件 1 微生物计数培养基的适用性检查和附件3 控制菌检查培养基的适用性检查。
稀释剂、冲洗液及其制备的要求见附件1 微生物计数培养基的适用性检查。
4.4 培养基的适用性检查供试品微生物计数、控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
微生物限度检查所用的培养基每批均应进行适用性检查，检查可在供试品检查前或与供试品检查同时进行。
具体要求见附件1 微生物计数培养基的适用性检查和附件3 控制菌检查培养基的适用性检查。
4.5 方法适用性试验供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。
无菌、微生物限度检查及方法验证
01
02
03
直接接种法
将样品接种在培养基上， 观察是否有微生物生长。
薄膜过滤法
将样品通过薄膜过滤，收 集滤膜上的微生物，再进 行培养。
离心沉淀法
将样品离心，收集沉淀物 中的微生物，再进行培养 。
无菌检查的注意事项
确保环境洁净
无菌检查需要在洁净的环境中进行，以避免 外界微生物的污染。
避免样品中防腐剂的影响
方法验证
方法验证的定义与目的
定义
方法验证是对检测方法的可靠性、准确性和可重复性的评估过程，以确保该方 法能够满足预期的检测要求。
目的
方法验证的目的是确保所采用的无菌、微生物限度检查方法具有足够的灵敏度 、特异性、重现性和可操作性，以保证检测结果的准确性和可靠性。
方法验证的流程
准备验证计划
制定详细的验证计划，包括验 证实验的设计、实验步骤、数 据收集和分析等内容。
进出口检验
进出口药品需要进行严格的微生物限度检查，以确保药品符合进口 国或地区的质量标准，保障公众健康。
方法验证在药品质量控制中的应用
验证无菌、微生物限度检查方法的可靠性
通过方法验证可以确保无菌、微生物限度检查方法的准确性和可靠性，提高药品质量控制 水平。
评估检测方法的性能指标
方法验证过程中需要对检测方法的性能指标进行评估，如灵敏度、特异性、重现性等，以 确保检测结果的准确性和可靠性。
如果样品中含有防腐剂，可能会抑制微生物 的生长，因此需要进行相应的处理。
正确选择培养基
根据待测样品的特性，选择适合的培养基， 以确保微生物能够正常生长。
定期进行方法验证
无菌检查方法需要定期进行验证，以确保其 可靠性。
0义与目的
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无菌检查和微生物限度检查操作规范（中国药品生物制品检定所）一、无菌室的要求：无菌室是无菌检查、微生物限度检查的重要设备，面积不小于6平米，高度2.4-2.8m为宜。
建筑材料要光洁，不吸潮，无凸起，耐腐蚀，易清洗。
无菌室内部应六面光滑，无缝隙，里面连接处应呈凹凸形，不留死角。
操作间和缓冲间的门不应直对，缓冲间两个。
无菌室内采光面积要大，照明灯应镶嵌在天花板内，光照应分布均匀，光照度不低于300lux，电源开关应设在室外。
无菌室、缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯，每立方米2-2.5瓦，距实验台高度不超过1米，并应定期检查辐射强度，距1米处应不低于70微瓦/平方厘米，无菌室内应安装空气除菌过滤层流装置及调温装置，控制温度18-26℃，相对湿度40%-60%，操作间或净化工作台的洁净空气应保持与相临环境形成正压，不低于4.9帕。
操作区洁净度100级，操作间洁净度10000级，洁净度定期检查。
无菌室及缓冲间不得存放其他杂物，如培养箱。
用消毒液清洁无菌室操作台面，开启无菌室紫外灯和层流空气过滤30分钟以上。
无菌室的无菌程度，常用的沉降菌测定方法为：取营养肉汤琼脂平板3个，置无菌室的操作区台面左、中、右位置上，开盖暴露30分钟，在30-35℃培养2天后，计算菌落数。
用于无菌检查的无菌室或微生物限度检查的无菌室，细菌总数应小于3个，浮游菌每立方米应小于5个，否则，不能用于无菌检查和微生物限度检查。
二、培养基的准备1、培养基的制备：配制培养基的蒸馏水或去离子水应符合规定。
再称取需气菌、厌气菌培养基、真菌培养基的干燥培养基，加水溶化后，调节PH值，使灭菌后需气菌、厌气菌培养基的PH值为7.0-7.3，真菌培养基的PH值为6.2-6.6，分装、盖塞、灭菌，待用。
2、培养基灵敏度试验：培养基是无菌试验的基准物质，关系到无菌试验结果的科学、准确、可信度，因此，培养基灵敏度试验是无菌试验的重要组成部分。
只有使用灵敏度试验合格的培养基，才能保证无菌试验结果准确、可靠。
培养基灵敏度试验操作如下：取藤黄微球菌、生孢梭菌、白色念珠菌的新鲜培养液，分别10倍递增稀释，制成每ml 含10-100个菌，并作菌落记数。
将制备好的菌液分别加至需气菌、厌气菌培养基、真菌培养基各3管。
至规定温度培养5天，每株菌接种的培养基不少于2管生长，则改培养基的灵敏度试验合格。
3、培养基用前的检查：（1）无菌检查：各种培养基在规定温度培养3天，应无菌生长。
（2）新鲜程度检查：需气菌、厌气菌培养基氧化层的颜色用前不能超过1/5，否则，不能使用。
应煮沸去氧，只限加热一次。
4、培养基的保存时限：配制好的无菌试验用培养基在2周内用完。
三、菌种复苏和保藏1、菌种复苏：先将冻干菌种的封口端用砂轮刻痕，在刻痕处过火焰数次，用无菌湿棉球炸裂后打开，然后，加入0.3-0.4ml稀释液于菌种管底部，将菌种稀释、混匀，并吸出菌液，接种于适宜的培养基。
培养时间和温度根据不同的菌种而定。
仔细检查菌种的有关特性，如无发现异常，即可传代、使用。
2、药品微生物用的菌种传代方法：取复苏好的菌种一支，接种于规定的培养基数管，培养后，置冰箱中保藏。
取出使用的菌种，经一段时间后即可废弃。
为防止微生物突变，菌种应尽量避免不必要的接种和传代。
3、菌种保藏：常用的菌种保藏方法有多种。
一般微生物实验室常用琼脂斜面和半固体低温保藏法。
大型实验室常用冷冻真空干燥法和液氮超低温保藏法。
4、菌种保藏的注意事项：破伤风梭菌、生孢梭菌选用胞肉培养基；铜绿假单孢菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，可用半固体法室温保存。
四、阳性对照菌液的制备阳性对照试验的目的是根据阳性菌在加入供试品的培养基中能否生长，以验证供试品有无拟菌活性和试验条件是否符合要求。
中国药典规定，使用的阳性菌为金黄色葡萄球菌（CMCCB26003）、生孢梭菌（CMCCB64941）、白色念珠菌（CMCCF98001）。
所有对照菌液的制备及阳性对照菌试验，必须在另一专用净化台上操作，应与其他无菌室分开。
对照菌液制备方法：通常根据供试品抗需气菌、抗厌氧菌或抗真菌的特性，选取相应的阳性对照菌培养物，制成菌液。
现以金黄色葡萄球菌为例，说明对照菌液配制的方法：取营养琼脂斜面新鲜培养物1白金耳，接种于营养肉汤培养基中，在30-35℃培养18-24小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每ml含10-100个菌作为对照菌液。
同时，分别取对照菌液1ml加至双碟中，倾入适量的营养琼脂培养基，制备两个平板。
培养后，以平均结果记数。
制备的对照菌液应在当日使用。
五、拟细菌拟真菌实验中国药典2000年版增订了拟细菌拟真菌实验，在实验前必须对供试品的拟菌性有一些了解。
取需气菌、厌气菌培养基4管，真菌培养基2管，其中2管需气菌、厌气菌培养基分别加10-100个金黄色葡萄球菌，另2管分别加生孢梭菌。
真菌培养基2管分别加10-100个白色念珠菌，其中1管加定量供试品。
所有培养基管置规定温度培养3-5天，观察结果，如各培养基管24小时内微生物生长良好，则供试品无拟菌作用；如加供试品的培养基管与未加供试品的培养基管对照比较，微生物生长微弱、缓慢或不生长，均判供试品有拟菌作用。
供试品如无拟菌作用，可采用直接接种法。
对有拟菌作用的供试品，可采用稀释法、中和法或薄膜过滤法。
六、操作人员的准备操作人员准备进入无菌室：操作人员关闭紫外灯，用洗手液洗手，进入缓冲间换工作鞋、消毒手、戴帽、穿无菌衣、口罩、手套，不得戴装饰物。
在缓冲间着无菌装时，袖口不能翻转折叠，严防暴露手腕。
七、无菌检查无菌检查法包括直接接种法、薄膜过滤法，前者适用于非抗菌作用的供试品，后者适用于有抗菌作用或大容量的供试品。
1、直接接种法：取供试品11支，用消毒液浸泡或擦拭，划痕，用75%酒精消毒棉球或碘伏棉球擦拭，过火焰，搬断，用无菌玻璃注射器或一次性注射器取规定量供试品，接种至需气菌、厌气菌培养基6管，接种真菌培养基5管，同时取供试品稀释液接种需气菌、厌气菌培养基和真菌培养基各1管做阴性对照，其中1管接种10-100个对照菌作阳性对照。
需气菌、厌气菌培养基管置30-35℃，真菌培养基管置20-25℃，培养7天，逐日观察记录结果。
接种供试品后或培养过程中，如培养基中出现浑浊现象，培养7天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量，转种至同种新鲜培养基中或斜面培养基上继续培养，细菌培养2天，真菌培养3天，观察是否再出现浑浊或斜面有无菌生长，或用接种环取培养液涂片、染色，用显微镜观察是否有菌。
2、薄膜过滤法：将灭菌的排液槽安装好，取三元一次性集菌培养器，将滤器导管放在集菌仪的移动泵管槽内，进液导管的双星针头插在0.9%的无菌氯化钠冲洗液的胶塞上，启动集菌仪，将冲洗液瓶倒置在支架上，冲洗液自滤器下孔流出即可。
关集菌器。
取供试品6瓶，用消毒液浸泡或擦拭，去铝盖或塑料盖，瓶塞过火焰，用注射器取氯化钠注射液适量注入瓶中，使供试品充分溶解。
用注射器将供试液分别转移至100ml稀释液中，摇匀，尽快将进液导管上的双星针头插入该瓶塞上，同时启动集菌器，过滤，直到滤膜上无药液。
将6瓶供试品稀释液全部过滤。
用1000ml的氯化钠溶液冲洗薄膜，每冲洗100ml适当摇动滤器，抽滤干净，冲洗3次。
用夹子加紧滤器上一个进液导管的前端，将每个滤器上的排气孔胶帽取下，堵在滤器底部的排液孔上，各加入100ml需气菌、厌气菌培养基于2个滤器内，取下第一个夹子，再用两个夹子加紧另外2个滤器进液导管的前端，加入100ml真菌培养基于第三个滤器内，前两元滤器中的一个要加入金黄色葡萄球菌10-100个，作阳性对照。
另取两元一次性集菌培养器安装于集菌仪上，用200ml氯化钠溶液冲洗薄膜，用夹子加紧一个滤器的进液导管的前端，然后加入100ml需气菌、厌气菌培养基。
取下夹子，再用夹子加紧另一个滤器进液导管的前端，加入100ml真菌培养基，作阴性对照。
需气菌、厌气菌培养基管置30-35℃，真菌培养基管置20-25℃，培养7天，逐日观察记录结果。
3、无菌检查结果判断：当阳性对照管显浑浊并确有菌生长，阴性对照管呈阴性时，可根据观察所得结果判定。
如需气菌、厌气菌及霉菌培养管均为澄清或浑浊，但经证明并非有菌生长，均为供试品合格；如需气菌、厌气菌及霉菌培养基管中任何一管显浑浊，并确有菌生长，应取样并分别依法复试。
除阳性对照管外其他各管均不得有菌生长，否则，应判定供试品为不合格。
八、微生物限度检查1、供试液的制备：（1）固体供试品固体供试品包括片剂、丸剂、胶囊剂。
称取供试品10g放入灭菌好的匀浆杯中，加稀释剂100ml，启动匀浆仪,以每分钟3000转，旋转3分钟，使供试液均匀，制成1：10供试液。
（2）液体供试品取供试品10ml放入已灭菌锥形瓶中，加入90ml稀释剂，使均匀，制成1：10供试液。
（3）非水溶性供试液制备称供试品5g，加入装有已灭菌融化的温度约45℃的司盘-80 5g，单硬脂酸甘油3g和聚山梨酸10g混合物锥形瓶中,摇匀，加0.9%灭菌氯化钠溶液80ml使供试品充分乳化，制成1：20供试液。
2、细菌霉菌（酵母菌）计数：以固体供试液为例，供试液以10倍递增稀释，将匀浆杯中内容物摇匀，取2-3支灭菌中试管，分别加入9ml灭菌稀释剂。
另取一支1ml灭菌吸管，吸取供试液1ml，加入第一支试管中，混匀，制成1：100的供试液，以此类推，作10倍递增稀释。
根据供试品污染的程度可稀释至10-3或10-4，一般取连续三级稀释液检验。
取吸管分别吸取1ml 10-1供试液加入4平皿中。
再取另一支吸管分别取第二级稀释液1ml加入4个平皿中，第三级稀释液同样操作。
将45℃左右的营养琼脂培养基按每一级稀释液倒入2个平皿，每个平皿15-20ml，立即摇匀。
再取玫瑰红钠琼脂培养基按每一级稀释液倒入2个平皿，同样操作。
细菌数和灭菌数的阴性对照试验：分别吸取稀释剂各1ml加入到4个平皿中，再分别加入营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基各制成2个平板。
检查细菌的平板倒置于30-35℃培养箱中，培养2天。
检查霉菌的平板倒置于25-28℃培养箱中，培养3天。
逐日观察并记录结果。
阴性对照的平板培养后均不得长菌。
3、大肠杆菌检查：取胆盐乳糖培养基3份，每份100ml，两份分别加入规定量的供试液，其中一份加对照菌50-100个作阳性对照。
第三份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照，培养18-24小时。
阴性对照应无菌生长。
取上述三份培养物各0.2ml，分别接种至5mlMUG培养基管内培养，分别于5小时与24小时时取未接种的MUG培养基管作本底对照。
将各管置366nm紫外灯下5cm处观察有无蓝白荧光，然后，加靛基质试液4-5滴于上述MUG培养基管内，适当震摇后，观察液面颜色。