-化学发光分析法
化学发光法elisa
化学发光法elisaELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的生物化学分析方法，通过检测化学发光信号来定量分析样品中的目标物质。
它是一种高灵敏度、高特异性的实验技术，广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域。
化学发光法ELISA的原理是利用酶标记抗体与待测物质结合，然后通过酶催化反应产生化学发光信号。
ELISA分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA等多种类型，根据实验需要选择不同的方法。
在ELISA实验中，首先需要将待测物质固定在试验板上，然后加入酶标记抗体与待测物质结合。
接着，加入底物溶液，底物与酶催化反应产生化学发光信号。
最后，使用专用的发光仪器测量发光强度，根据发光强度的大小可以定量分析样品中的目标物质含量。
化学发光法ELISA具有许多优点。
首先，ELISA方法具有高灵敏度，可以检测到非常低浓度的目标物质。
其次，ELISA方法具有高特异性，可以准确地区分目标物质与其他物质的结合。
此外，ELISA方法操作简单、快速，可以同时处理多个样品，提高实验效率。
最重要的是，ELISA方法可以应用于多种样品类型，包括血清、尿液、细胞培养液等，具有广泛的应用前景。
化学发光法ELISA在医学领域有着重要的应用。
例如，ELISA可以用于检测血液中的病原体抗体，如HIV、乙肝病毒等。
ELISA还可以用于检测肿瘤标志物，帮助早期发现肿瘤并进行治疗。
此外，ELISA还可以用于检测药物浓度，指导药物治疗的调整。
除了医学领域，化学发光法ELISA在生物学、环境科学等领域也有广泛的应用。
例如，ELISA可以用于检测植物中的激素含量，研究植物生长发育的调控机制。
ELISA还可以用于检测环境中的污染物，如重金属、农药等，评估环境质量。
尽管化学发光法ELISA具有许多优点，但也存在一些局限性。
首先，ELISA方法对样品的处理要求较高，需要进行样品预处理、稀释等步骤，增加了实验的复杂性。
化学发光分析法
应用
➢ 直接作用：增敏和抑制作用
过渡金属：Cu2+,Cr3+,Ni2+,Co2+,Fe2+
维生素B6，维生素B12，维生素C，吗啡，可待 因，肾上腺素，多巴胺，细胞色素
➢ 间接作用
如 Fe2+对鲁米诺-H2O2体系有催化增敏作用，而 蛋白质却抑制此作用，据此可建立检测血清中蛋 白质含量的方法。
合成
高沸点溶剂（如二甘醇）
3-硝基邻苯二甲酸 + 肼
缩合反应
H2O + 3-硝基邻苯二甲酰肼 保险还粉原(强还原剂） 3-氨基邻苯二甲酰肼(鲁米诺)
化学发光分析法
发光体系 ➢鲁米诺-H2O2体系 ➢鲁米诺-KIO4体系
化学发光分析法
鲁米诺-H2O2的反应是自身化学发光反应
在PH=11的水溶液中发光效率最大 鲁米诺与氢氧化物反应时生成了一个双负离子（Dianion），它可被过氧化 氢分解出的氧气氧化，产物为一个有机过氧化物。该过氧化物很不稳定， 立即分解出氮气，生成激发态的3-氨基邻苯二甲酸。 激发态至基态转化中，释放的能量以光子的形式存在，波长位于可见光的 蓝光部分
化学发光分析法
➢基本原理 ➢常用的化学发光物质 ➢仪器装置 ➢影响化学发光的因素 ➢定性定量分析
化学发光分析法
• 化学发光（chemiluminescence）：又称为 冷光，它是在没有任何光、热或电场等激 发的情况下由化学反应而产生的光辐射。
由于不需要外源性激发光源，避免了背景光和杂 散光的干扰，降低了噪声，大大提高了信噪比。 具有灵敏度高，线性范围宽，设备简单，操作方 便，易于实现自动化，分析快等特点。在生物工 程学，药物学，分子生物学，临床和环境化学等 各个领域正显示出它蓬勃的生机。
《化学发光分析》课件
本课程将介绍化学发光分析的工作原理、分类、常用试剂和仪器、典型实验 操作步骤以及优点和应用。让我们一起探索这一极具活力和创新性的化学分 析技术。
化学发光分析概述
什么是化学发光分析？
化学发光分析是指利用发光剂 （luminophore）与感光器 （photodetector）在光激发条件下 发生发光反应进行分析的技术。
发光机制和原理
发光反应主要包括螯合发光、化学 发光、电化学发光和生物发光，其 基本原理为激发能量从分析物传递 到发光剂。
化学发光分析的分类
化学发光分析主要分为储能法、电 化学发光法、免疫分析法、分子印 迹技术法和气相化学发光分析 （GPCA）等。
优点和应用
快速、敏感、高效
化学发光法具有灵敏度高、特异性强、检测时间短和快速分析等优势，被广泛应用于临床、 食品、环境、药学、安全等领域。
数据统计和分析
4
利用计算机等工具进行数据的整理、计算与 分析，得出结果，并进行结果的验证和确认。
取样
用适当的方法取得样品，并得到有效的样品。
发光检测
激发分析样品使其产生发光，并利用仪器对 其进行检测。
案例分析和总结
CRO公司使用化学发光分析技术加 快药代动力学评估
合同研究组织（CRO）将计划100名志愿者的药代动力 学模拟研究里程碑提前了八个月，其采用了高通量类 似物筛选、高通量药代动力学测定和新一代大规模并 行化药代动力学建模等技术。这些技术包括，化学发 光法作为测定细胞器的特异性标记的方法。
电化学发光分析
电化学发光分析仪（ECL）是用于 电化学发光分析的专用设备，适用 于光谱分析和光度测定等分பைடு நூலகம்。
酶标仪
酶标仪是一种测量酶反应的光度仪 器，通常用于免疫学、生化学等领 域的分析。
化学发光分析法(现代表征方法与技术-朱昌青
Instrumental Analysis
7
c. 乙烯与O3的发光反应
乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：
CH2O* → CH2O + h 最大发射波长：435nm；对O3的特效反应；线性响应
范围1 ng/cm-3 ～1g/cm-3；
Instrumental Analysis
8
（2）火焰中的化学发光反应
Instrumental Analysis
19
b.氧原子与SO2、NO、CO的发光反应 O3 → O2 + O （1000 C石英管中进行） SO2 + O + O → SO2* + O2 SO2 * → SO2* + h
最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-3；
Instrumental Analysis
6
氧原子与NO的发光反应：
pH7 - 8
复合物与氧反应，产生化学发光： AMP· 2 · + O2 [氧化荧光素]* + AMP+CO2 + H2O LH E
[氧化荧光素]* 氧化荧光素 + h
最大发射波长562nm；
Instrumental Analysis
14
生物发光分析应用 2
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在细菌中的黄素酶作用 下，在氧化型黄素单核苷酸(FMA)存在下，发生发光反应 ： NADH + FMA + H+ NAD+ + FMNH2
（3） 间接测定某些生物试样
氨基酸 + O2
葡萄糖氧化酶 氨基酸氧化酶
酮酸 +NH3 + H2O2
葡萄糖 + O2 + H2O 葡萄糖酸 + H2O2 通过测定生成的H2O2 ，确定氨基酸、葡萄糖含量。
化学发光分析法的应用
在大多数人的概念里，化学发光分析法没有多大的作用，只是一个用来研究发光不发光的方法。
但其实，化学发光分析法的应用是十分广泛的，在药物、临床、食检、水质监测中都发挥着重要的功效。
化学发光分析法是分子发光光谱分析法中的一类，是指物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，从而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出一定波长的光。
根据化学发光反应到某一时刻的发光强度或发光总量来确定组分含量的分析方法就叫做化学发光分析法。
由于化学发光分析法中没有可能产生背景信号的散射激发辐射，因此，比起其他发光分析法更为灵敏。
化学发光分析法作为一种有效的微量和痕量分析的手段，已经被广泛应用到各个领域。
特别是分析检测领域，加之化学发光分析法具有仪器设备简单，线性响应范围宽等特点，近年来特别受到人们的中式。
目前，在水质污染的检测和研究中，已经成功运用了化学发光分析法。
化学发光分析法是根据化学反应产生的辐射光的强度或辐射总量来确定其相应组分含量的分析方法。
自19世纪下半叶发现一般有机物的化学发光反应以来，化学发光分析法便被应用到分析化学领域中，特别是近十年来化学发光分析法取得了很大的进展。
随着人们对环境保护的重视，对环境监测要求也愈来愈高，化学发光分析法的众多优点使得其在环境监测分析方面的应用也逐渐增加，特别是在水和废水中对无机离子的分析监测方面有较多应用。
近年来，随着环境科学研究的深入和发展，化学发光分析法在环境监测中的应用也日益增多，并成功地应用于大气监测、水质监测以及环境污染机理的研究中。
化学发光分析法。
10.化学发光分析法
18
快速、高通量催化剂筛选新方法
CL Intensity (A.U) CO Conversion ( % )
CO Conversion
CO在不同催 化剂上的化 学发光信号
化学发光信号 与催化剂活性 的相关性
B 80000
84 82
70000
80
CL Intensity
78
60000
CO Conversion
16
纳米材料表面化学发光的化学选择性
同一样品在不同纳米
材料上的化学发光强
乙
度不同
醇
硫化氢 三甲胺
不同的样品在相同纳 米材料上的化学发光 强度也不同
17
化学发光阵列传感器及分子识别原理
纳米材料表面化 学发光阵列传感 器原理图
不同种类 样品图案
结构相似的 同系物图案
空白
乙醇
三甲胺
硫化氢
甲醇
乙醇
丙醇
丁醇
Au/TiO2 Au/MgO Au/SiO2 Au/ZrO2 Au/ZnO
-19℃
42℃65℃74℃84℃
-80
catalytic activity
Au/TiO 2 Au/MgO
Au/SiO2 Au/ZrO2 Au/ZnO
0
40
80
T (℃)
100%
-40
0
40 80 120 160
Temperature (℃)
自然界奇妙之事
化学发光
1
生活中常见的化学发光现象
2
化学发光定义
化学反应的能量把体系中共存的某种分子从基态激 发到激发态从而产生发光的现象。
3
电致化学发光（ECL)
化学发光法检测分析中的应用
化学发光法检测分析中的应用化学发光法是一种应用广泛的分析方法，其可以被用于各种领域的检测分析，如医学、药学、食品科学、环境科学等等。
通过化学反应方式发生的化学发光，在定量和定性分析中都具有重要的应用。
本文将介绍化学发光法的检测原理、检测方法和应用案例。
一、检测原理化学发光是指某些物质在化学反应中释放出光的现象。
常见的化学发光反应有氧化还原反应、酶催化反应、亚硝胺反应等等。
这些化学反应所释放出的光与反应物的浓度成正比关系，因此可以通过测量光强来确定反应中物质的浓度。
二、检测方法1. 酶促发光法酶促发光法是基于酶催化反应和化学发光原理的检测方法。
此方法为生物技术和生物医学领域应用广泛的检测方法。
该方法主要采用双酶法，将触媒化学发光底物催化剂和酶学底物相互作用产生化学反应链，从而放出化学荧光。
通过测量荧光的强度，可以得出样品中酶的含量。
2. 气相色谱发光检测法气相色谱发光检测法是一种将气相色谱技术与发光检测方法相结合的新型检测方法。
该方法首先将样品通过气相色谱柱进行分离，然后在检测器中通过光的激发作用产生化学发光，通过检测这种化学发光的强度进行分析和检测。
3. 化学发光免疫分析法化学发光免疫分析法是一种基于化学反应和免疫学原理相结合的检测方法。
该方法将样品与已知抗原或抗体进行反应，然后添加酶标记抗体或抗原，通过荧光或化学发光检测法分析产生的化学反应。
该方法可快速、准确、灵敏地检测出各种生物分子。
三、应用案例1. 生化污染的检测生化污染是指非法添加和假冒伪劣的生化制品的行为，而定量测定小分子抗生素中的残留成分是评价生化制品较重要的一个指标。
李梅等人通过化学发光法检测分析，发现处于贮存温度较高或贮存时间过长的青霉素、链霉素等抗生素，其残留量有较大增加，因此化学发光法被广泛用于生化污染的检测。
2. 药物纯度及含量的检测药学中常常需要检测药品的纯度及含量。
王丽等人通过化学发光法检测氨氯地平的药剂及体外生物样品，发现药品残留量与样品的浓度呈线性关系，因此化学发光法可被用于药物纯度及含量的检测。
化学发光分析法
化学发光分析法
荧光光谱分析技术是一种重要的计量分析技术，它广泛应用于化学、生物学、物理学等各个学科领域。
尤其是化学发光分析法，属于一种特殊的光谱分析方法，其本质是利用荧光发射现象中的特征频谱，用于观测物体的成分、离子类型和定量测定。
化学发光分析法具有优越的特点，该技术要求样本中存在放射性核变异，以激发荧光发射。
基本原理是：使用特定能量(通常是电子、α射线或紫外线)激发物质，从而产生荧光。
观测荧光发射谱，即可确定荧光物质的构成和含量。
此外，该技术利用激发源和检测器轻松实现样本的定量检测，尤其是在检测低浓度物质的场合，具有显著的优势。
化学发光分析法在高等教育领域也得到了较为广泛的应用，尤其是在高校实验室实验中。
在元素有机衍生物（比如有机氯化物等）检测、生物抗原定位与定量等方面，化学发光分析法均得到了广泛的应用。
这有利于学生深入研究各种有趣的科学现象，增强学术研究能力及相关的实践操作能力。
此外，化学发射分析法在基础研究方面也有重要的价值，因为它可以有效地改进现有的实验系统，帮助理解物质发射的原因。
临床治疗的新方法也是化学发光分析法的重要应用领域，包括早期检测和治疗肿瘤等疾病，以及诊断蛋白质、核酸和其他生物分子表型等诊断技术，得到了越来越广泛的应用。
总之，化学发光分析法是一种重要的技术，它在综合研究、教育实践和日常检测中都有着重要的应用。
它能够准确有效地测定各种物质，更有效地分析出物质成分，促使众多学科的发展。
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黄素酶
FMNH2 + RCHO + O2 FMN + RCOOH + H2O + h 最大发射波长495 nm；
AMP·LH2 ·E + O2 [氧化荧光素]* + AMP+CO2 + H2O [氧化荧光素]* 氧化荧光素 + h
最大发射波长562nm；
2020/7/30
生物发光分析应用 2
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在细菌中的黄素酶作用 下，在氧化型黄素单核苷酸(FMA)存在下，发生发光反应 ：
NADH脱氢酶
2020/7/30
氧原子与NO的发光反应：
O3 → O2 + O （1000 C石英管中进行） NO + O → NO2* NO2 * → NO2 + h 发射光谱范围：400～1400nm；灵敏度1ng/cm-3；
氧原子与CO的发光反应：
CO + O → CO2* CO2 * → CO2 + h 发射光谱范围：300～500nm；灵敏度1ng/cm-3；
2020/7/30
c. 乙烯与O3的发光反应
乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：
CH2O* → CH2O + h 最大发射波长：435nm；对O3的特效反应；线性响应 范围1 ng/cm-3 ～1g/cm-3；
2020/7/30
（2）火焰中的化学发光反应
在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应； a. 一氧化氮
2020/7/30
生物发光分析应用 1
在pH 7～8；荧光素酶(E)和Mg2+的存在下，荧光素
(LH2)与磷酸三腺甙(ATP)的反应，生成磷酸腺甙(AMP)荧光 素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi)：
ATP
+
LH2
+
E
+
Mg2+
pH7 - 8
AMP·LH2
·E
+Mg
ppi
+
2H+
复合物与氧反应，产生化学发光：
该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这 一现象可测定这些金属离子。 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：
2020/7/30Leabharlann 5. 化学与生物发光分析的应用
（1） 该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用 这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+ 、Mn2+ 、Co2+、V4+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等
（2） 可检测低至 10-9 mol/L 的H2O2； （3） 间接测定某些生物试样
氨基酸 +
氨基酸氧化酶
O2
酮酸 +NH3 + H2O2
葡萄糖氧化酶
葡萄糖 + O2 + H2O 葡萄糖酸 + H2O2
通过测定生成的H2O2 ，确定氨基酸、葡萄糖含量。
2020/7/30
草酸二酯(能量提供体)+高浓度双氧水+稠环芳烃(能量接 受体)+金属离子+溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光 ，发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光( 冷光源)。
第十六章
一、基本原理
分子发光分析法 principle
二、化学发光分析的特点
molecular luminescence characteristics
analysis
三 装置与技术
第三节 化学发光分析法
instrument and technology
chemiluminescence analysis
NO + H → HNO* HNO * → HNO + h 发射光谱范围：660～770nm； 最大发射波长：690nm； 在富氢火焰中： NO2 + 2H → NO + H2O 该反应十分迅速；
2020/7/30
b.硫化物
挥发性硫化物SO2 、H2S 、CH3SH、 CH3SCH3等在富 氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：
SO2 + 2H2 → S + 2H2O S + S → 2S2 * S2 * → S2 + h 发射光谱范围：350～460nm； 最大发射波长：394nm； 灵敏度： 0.2 ng/cm-3； 发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。
2020/7/30
（3）液相中的化学发光反应
Cu、机M理n研、究Co较、多V、，F在e、分C析r、中C应e用、最Hg多、；Th可等测。痕量的H2O2 、 应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）； 化学发光反应效率：0.15～0. 05； 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：
2020/7/30
一、基本原理 principle
1. 化学发光反应
在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从 激发态返回基态时，发射出一定波长的光。
A +B = C + D* D* → D + h （1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物； （2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 E=170～300 kJ/mol；位于可见光区； （3）发光持续时间较长，反应持续进行； 化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中， 称生物发光(bioluminescence)。
cl
c
2020/7/30
4.化学发光反应的类型
（1）气相化学发光反应
a. 一氧化氮与O3的发光反应 NO + O3 → NO2* NO2* → NO2 + h
发射的光谱范围：600～875nm，灵敏度1ng/cm-3； b.氧原子与SO2、NO、CO的发光反应
O3 → O2 + O （1000 C石英管中进行） SO2 + O + O → SO2* + O2 SO2 * → SO2* + h 最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-3；
在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多， 对于一级动力学反应：
dc/dt =Kc；
K 为反应速率常数。
定性依据：
（1）在一定条件下，峰值光 强度与被测物浓度成线性；
（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被 测物浓度成线性：
A
t 0
I cl t dt
cl
t 0
dc dt
dt
2020/7/30
2.化学发光效率
发射光子的分子数
cl 参加反应的分子数 ce em
化学效率：
激发态分子数
ce 参加反应分子数
发光效率：
产生光子数
em 激发态分子数
时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：
Icl
t
cl
dc dt
dc/dt 分析物参加反应的速率；
2020/7/30
3.化学发光强度与化学发光分析的依据