BD ELISPOT —单细胞分析技术
elispot的原理及应用
Elispot的原理及应用1. Elispot是什么Elispot（enzyme-linked immune spot assay）是一种用于测定单个细胞的分泌功能的实验技术。
它通过检测分泌细胞在特定条件下产生的细胞因子或细胞分泌物的分泌量，来评估细胞的免疫反应。
Elispot被广泛应用于免疫学、肿瘤学、感染病学等领域的研究和诊断。
2. Elispot的原理Elispot基于细胞分泌物的分泌原理进行测定。
其原理主要包括以下几个步骤：1.准备ELISPOT板：将特定抗体或刺激物涂覆在固相支持体上，形成抗原或刺激物捕获层。
常用固相支持体有多孔膜、96孔板等。
2.加样细胞：将待测细胞或其他产生细胞分泌物的细胞加入到ELISPOT板中，使其与抗原或刺激物接触。
3.细胞刺激：经过一定的培养条件和时间，刺激细胞产生分泌物。
4.分泌物检测：将细胞移除，用特异性抗体标记待测细胞分泌物中的目标分子，形成复合物。
5.免疫反应可见化：通过酶标法或荧光法，使复合物与ELISPOT板上的底物发生反应，产生可观察的斑点。
3. Elispot的应用Elispot技术广泛应用于以下领域：3.1 免疫学研究Elispot可以用于研究多种细胞因子的产生情况，如干扰素γ（IFN-γ）、白介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子（TNF-α）等。
它可以检测单个细胞的分泌情况，并通过对不同细胞类型进行比较，揭示免疫细胞的功能和相互作用。
3.2 肿瘤学研究Elispot可以评估肿瘤特异性T细胞的活性和功能。
通过使用与肿瘤相关的抗原刺激细胞，可以检测肿瘤特异性T细胞的分泌情况，进而评估免疫治疗的效果和抗肿瘤免疫应答的强度。
3.3 感染病学研究Elispot在感染病学研究中起到重要作用。
通过检测特定感染病原体的抗原刺激下，细胞分泌物的产生情况，可以评估免疫应答的强度和类型，并且可以用于疫苗开发和新药筛选等领域。
3.4 自身免疫性疾病研究Elispot可以用于评估自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等）患者的自身免疫反应。
ELISPOT工作原理
ELISPOT工作原理关键信息项：1、 ELISPOT 技术的定义2、涉及的实验材料和设备3、实验操作步骤4、数据采集与分析方法5、技术的优势和局限性11 ELISPOT 技术的定义ELISPOT（EnzymeLinked Immunospot Assay），即酶联免疫斑点检测技术，是一种用于检测和定量单个细胞分泌特定蛋白质的免疫学方法。
111 原理概述ELISPOT 基于细胞分泌的蛋白质能够在细胞周围的固相载体上形成可见斑点的原理。
当被检测的细胞受到特定刺激后，会分泌特定的细胞因子或抗体等蛋白质。
这些分泌的蛋白质会被预先包被在固相载体（通常是微孔板）上的特异性抗体捕获。
112 与其他技术的比较与传统的 ELISA（酶联免疫吸附测定）方法相比，ELISPOT 能够检测单个细胞的分泌水平，而 ELISA 则是对细胞群体分泌的总和进行测量。
12 涉及的实验材料和设备121 固相载体通常使用 96 孔或 384 孔的微孔板，表面经过特殊处理以增强抗体的吸附。
122 捕获抗体针对待检测的细胞因子或蛋白质的特异性抗体，用于包被微孔板。
123 检测抗体与捕获抗体识别不同表位的另一种特异性抗体，通常与酶标记物结合。
124 酶标记物如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等，用于催化显色反应。
125 显色底物根据所使用的酶标记物选择相应的显色底物，产生可见的斑点。
126 细胞培养相关试剂包括培养基、血清、刺激剂等。
127 细胞分离和制备设备如离心机、移液器等。
13 实验操作步骤131 微孔板包被将捕获抗体稀释至适当浓度，加入微孔板中，在适当条件下孵育，使抗体吸附在微孔板表面。
132 封闭用封闭液封闭微孔板上未结合抗体的位点，以减少非特异性结合。
133 细胞接种将处理好的细胞悬液加入微孔板中，在特定条件下培养。
134 刺激根据实验目的，加入适当的刺激剂，诱导细胞分泌目标蛋白质。
135 孵育在适当的温度和时间条件下孵育，使细胞分泌的蛋白质被捕获抗体捕获。
ELISPT技术
ELISPOT技术ELISPOT方法从创立至今已经有20多年的历史了。
1983年，在地球南北两个半球地理位置相距遥远的两个研究小组几乎同时、独立的创立了这项技术。
一个研究小组位于澳大利亚西部的柏斯Peth，牵头人是当时正在当地Margaret 女王医院儿童医学研究所攻读博士学位的Jonathon D. Sedgwich （Sedgwick JD et. al., 1983）。
另一个研究小组位于北欧瑞典城市哥德堡Gothenburg，带头人是哥德堡大学医学微生物系的学者Cecil C. Czerkinsky （Czerkinsky CC et. al., 1983a）。
前者开创ELISPOT方法是为了研究B淋巴细胞分泌IgM抗体的情况（Holt PG et. al., 1984；Sedgwick JD et. al., 1984）；而后者除了用于研究B淋巴细胞分泌抗体的情况（Czerkinsky CC et. al., 1983b; 1983c），还应用于大肠杆菌分泌肠毒素（Czerkinsky CC et.al., 1983a）和成纤维细胞分泌纤维连接蛋白（Czerkinsky CC et. al., 1984）的研究中。
虽然研究的对象不一样，但是该实验技术所涉及的原理以及方法步骤和我们现在的标准ELISPOT 几乎完全相同。
这二十多年来，ELISPOT基本技术并没有什么重大变化，但是技术进步一直没有停顿，实验材料的改进了，实验灵敏度与重复性提高了，实验应用领域也拓宽了。
（1）底板材质的改进ELISPOT技术从创立之初，检测底板都是使用的普通塑料板，它的蛋白吸附能力差，因此实验的灵敏度有限。
1985年，Moller SA和Borrebaeck CA将膜板引入ELISPOT中（Moller SA et. al., 1985），检测的也是分泌抗体的阳性B细胞。
他们引入的是硝酸纤维素膜，获得了远远优于塑料板的结果。
bd单细胞测序原理
bd单细胞测序原理随着生物技术的不断发展，单细胞测序技术已经成为研究生物学和医学领域的重要工具之一。
而bd单细胞测序作为其中的一种技术手段，具有高通量、高灵敏度和高准确性的特点，被广泛应用于基因表达、细胞异质性和个体差异等研究领域。
bd单细胞测序是通过将单个细胞分离和捕获，然后将其转录本进行扩增、测序和分析的方法。
其原理基于高通量测序技术，可以实现对数千个单个细胞的基因表达进行全面的分析。
bd单细胞测序的工作流程可以分为以下几个步骤：1. 细胞分离和捕获：首先，需要将目标细胞进行分离和捕获。
常用的方法包括流式细胞术、微流控芯片和微操作技术等。
这些方法可以帮助将单个细胞分离出来，并将其固定在特定的载体上，以便后续的处理和分析。
2. 转录本扩增和准备：在细胞捕获后，需要对其转录本进行扩增和准备。
这一步骤主要包括RNA的提取、反转录和cDNA合成。
通过这些步骤，可以将单个细胞中的RNA转录本扩增为足够数量的cDNA，以便进行后续的测序分析。
3. 测序：在转录本准备好后，接下来就是进行测序。
bd单细胞测序通常采用高通量测序技术，如Illumina测序平台。
通过测序，可以获取每个单细胞的转录本序列信息，从而了解其基因表达情况。
4. 数据分析：最后，对测序数据进行分析和解读。
这一步骤包括数据质控、比对、基因表达量计算和差异分析等。
通过这些分析，可以得到每个单细胞的基因表达谱，进而研究细胞异质性和个体差异等重要问题。
bd单细胞测序原理的关键在于将单个细胞进行分离和捕获，以及对其转录本进行扩增和测序。
这种方法可以避免传统的群体测序方法中的细胞异质性和掩盖效应，从而更准确地揭示细胞的功能和特性。
然而，bd单细胞测序也存在一些挑战和限制。
首先，细胞分离和捕获的效率和准确性需要进一步提高，以便更好地捕获稀有细胞和亚群体细胞。
其次，对转录本的扩增和测序过程中会引入一定的偏差和误差，需要采取相应的校正和标准化方法。
此外，数据分析的复杂性和存储的需求也是一个挑战，需要开发更高效和精确的算法来处理和解读大量的测序数据。
ELISPOT技术简介及实验步骤
Table :
Real Plate
Number of Counts / Table
Table Number :
3
24/11/2003
50
Average Values
Cummulated values
Experiment Well
Sp ot s/Well
Opt. Density * Area
area **
• 左图来自我们在中检所建立ELISPOT制备准质控细胞的实验结果 • 右图来自我们建立ELISPOT标准化的实验结果
培 养 基 种 类
RPMI 1640+10%FBS
无血清培养基
ELISPOT质控
Optic reading
ELISPOT数据处理
• 数据处理：斑点判读和统计分析 • 斑点判读：
人工计数 仪器分析
• 统计分析：
Bioreader：不同斑点大小分布图、软件自动计算细胞的分
泌频率
统计学分析软件
ELISPOT结果统计分析
• 常见实验数据统计分析； • 批量样本实验数据统计分析； • 单孔样本分析； • 单个细胞水平结果分析；
Quality of spots
Spots Reader 1. Manual
2. Automated
Results Criteria of positivity Storage of data source
解决方案
1.样品细胞的分离
*淋巴细胞分离技术 ™ EZ-Sep 系列分离 液、分离管
4.实验过程
ELISPOT技术及实 验
ELISPOT简介
• ELISPOT全文为Enzyme-linked Immunospot Assay，中文： 酶联免疫斑点技术。
ELISPOT工作原理
ELISPOT工作原理ELISPOT是一种基于酶联免疫斑点（enzyme-linked immunospot）技术的生物学实验方法，用于检测单个活细胞产生的细胞因子数量，以获得关于特定免疫反应的定量信息。
ELISPOT方法已成为研究和临床诊断中常用的细胞免疫分析技术。
本文旨在介绍ELISPOT技术的原理和应用。
1. ELISPOT技术的基本原理ELISPOT技术的基本原理是利用单个细胞在聚焦区域中分泌细胞因子的能力。
首先在多孔板上涂覆特定抗体，并使用细胞悬浮液孵育，使细胞吸附在多孔板上，然后刺激细胞产生细胞因子，特异性抗体识别并结合细胞因子，供试细胞被固定，而其产生的细胞因子仍然可扩散进入周围。
接着使用酶标技术，添加酶标抗体-酶复合物识别并结合周围可扩散的细胞因子，形成可被酶底物着色的斑点。
ELISPOT试验可用于检测细胞因子的免疫反应，可以在不光化细胞，也无需使用放射性同位素进行标记的情况下，测定非常微量的细胞因子。
2. ELISPOT技术的应用ELISPOT技术的应用非常广泛，可以用于研究细胞免疫学、癌症、感染病原体和自身免疫性疾病等。
下面将分别介绍这些应用。
2.1. 研究细胞免疫学ELISPOT技术可以用于检测不同和同种发育阶段、性别、某些基因型或特定条件下的免疫细胞产生的细胞因子。
例如，可以对不同的激活剂进行测试，检测免疫细胞的分泌情况，揭示特定免疫反应的机制。
此外，由于ELISPOT对特异性和非特异性T和B淋巴细胞的敏感性非常高，所以可以使用这种技术来监测疫苗接种效果或者进行不同细胞因子分子和癌细胞的功能评估等。
2.2. 癌症的研究和治疗免疫疗法已成为一种治疗恶性肿瘤的新式方法，其中包括活体细胞治疗和肿瘤抗原刺激，此类方法具有极大的潜力来抑制肿瘤细胞的增长和扩散。
ELISPOT技术用于评估肿瘤抗原特异性T细胞水平的变化，可以在研究和临床实验中确定特异性的肿瘤抗原。
ELISPOT技术具体可用于肿瘤特异性免疫反应的检测、克隆增殖能力的测定、转移性肿瘤特异性T细胞反应的检测，以及抗肿瘤免疫反应治疗效果的评估等。
一种有效的免疫学检测技术——ELISPOT
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药物生物技术 ，０ ４ １ （） ２ ７２ ０ ２０ ， １４ 。６ －７ ［ ４ 周安宇 ， １３ 张 在 肾脏科学研究 中的应 用 ［ 国外 医学 一泌 尿系 统分 册 ， 刀．
Ｅ ＩＰ Ｌ Ｓ ＯＴ
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ELISPOT技术原理及其应用
X坐标：各检测方法的检测结果 坐标：
Y坐标：每百万APC中实际IFN-γ+T细胞数量 坐标：每百万APC中实际IFNAPC中实际IFN
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达科为生物
第二部分： 第二部分：技术特点
1.技术操作流程 1.技术操作流程 2.ELISPOT技术要点 2.ELISPOT技术要点 ELISPOT 3.塑料板与膜板 3.塑料板与膜板 4.膜结构与抗体包被 4.膜结构与抗体包被 5.细胞处理 5.细胞处理 6.有血清与无血清 6.有血清与无血清 7.刺激物选择 7.刺激物选择 8.建立阳性对照 8.建立阳性对照 9.调整适当的细胞浓度 9.调整适当的细胞浓度 10.预培养法与直接法 10.预培养法与直接法 11.各种染色系统 11.各种染色系统
细胞因子的分泌以及对效应细胞的调节构成了一个精确的免 疫系统调节网络。 疫系统调节网络。
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3.ELISPOT技术原理 3.ELISPOT技术原理
达科为生物
用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以斑点显色 的方式将其表现出来。
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1，2 ，
3
4
5
6
7
8
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ELISPOT技术要点 2. ELISPOT技术要点
达科为生物
细胞培养和培养前阶段无菌操作， 细胞培养和培养前阶段无菌操作，避免污染 细胞在ELISPOT板上孵育时要避免震动，包括开关 板上孵育时要避免震动， 细胞在 板上孵育时要避免震动 CO2孵箱 洗涤要充分， 洗涤要充分，尤其是裂解细胞之后的洗涤 洗涤时，枪头不能接触到膜，从孔中移出液体采用倾倒 洗涤时，枪头不能接触到膜， 的方式 洗涤最后一次要用高质量的吸水纸拍干
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BD ELISPOT —单细胞分 疫苗开发 -亦可评估疫苗效力，或是疫苗注射路径影响 Th0/Th1/Th2细胞转换分析 自体免疫研究 – 免疫调节及免疫治疗研究 癌症研究 -肿瘤反应T细胞作用 过敏机制探讨 – IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参
做出不同大小斑点的分布图，快速、精确、还能 平衡背景信号。 软件自动计算出细胞的分泌频率
BD ELISPOT 应用文献
Detection of GAD65-reactive T cells in Type1
diabetes by immunoglobulin-free ELISPOT assays. Diabetes Care, 2002, 25:1390-97.
与过敏机制之细胞因子研究 传染疾病研究 体液免疫研究 – B细胞免疫球蛋白及特定亚型反应的进展
研究
BD ELISPOT原理
ELISPOT实验设计: 是在96微孔培养板底部披覆PVDF薄膜，用来吸附特殊挑选,
且无毒性（不含sodium azide、内毒素endotoxin）的单株 抗体。静脉血PBMC经适当分离处理后分配到微孔上，再接受 适当的抗原刺激，并将微孔板放置于温箱中过夜培养一段时 间。一般而言，记忆性T细胞在受抗原刺激数小时后会开始 分泌细胞因子，此时局部(在紧靠分泌细胞的周围)分泌出的 细胞因子会被PVDF薄膜上特异抗体捕获。微孔板中的细胞被 移除并清洗后，被捕获的细胞因子可进一步使用生物素 （Biotin）标记的一抗来标识，其后再与辣根过氧化物酶标 记的亲合素作用，并加入底物使其呈色，有反应作用的细胞 会留下约10-20mm大小染色的斑点。
Cytokine detection by ELISPOT: relevance for
immunological studies in Type 1 diabetes. Diabetes Metab Res Rev, 2002, 18:367-380.
Direct Visualization of Cytokine-Producing Recall
BD ELISPOT 流程
BD ELISPOT 结果显示
样本孔出现颜色斑点 Usu. 10～20 mm
Blank controls: G1-9: 无刺激剂的细胞 H1-9: 无细胞的刺激剂
BD ELISPOT 结果分析
在显微镜下计数，一个斑点代表一个分泌细胞 用Elispot Reader 进行分析对斑点自动计数，并