21世纪单细胞分析发展_程介克
单细胞测序技术
单细胞测序技术单细胞测序技术是一项用于研究和识别单个细胞基因表达特征的先进技术。
通过单细胞测序，我们可以深入了解细胞之间的异质性，揭示细胞发育、功能和疾病发生等重要过程中的细胞类型和状态的差异。
本文将对单细胞测序技术的原理、应用和未来发展进行简要介绍。
单细胞测序技术的原理是将每个单个细胞分离并进行单独处理。
首先，使用一种特殊的方法将细胞分离成单个个体。
然后，通过开发出不同种类的单细胞测序技术，我们可以对每个细胞的基因表达进行测定。
这些测定包括了细胞DNA或RNA的测序，可以帮助我们研究细胞之间的基因调控变化。
单细胞测序技术的一个重要应用是在细胞组学研究中。
通过对各种类型的细胞进行全面的基因表达测定，我们可以更好地了解细胞类型的多样性和功能特性。
通过这种方法，研究人员可以更深入地研究发育过程中不同细胞类型的转录调控网络，揭示细胞发育和分化的分子机制。
此外，单细胞测序技术也有助于我们深入了解疾病的发生和发展机制。
通过对单个细胞的基因表达进行测定，我们可以发现疾病中细胞类型和状态的改变，揭示疾病发生的潜在机制和标志物。
这对于研究疾病的发展途径、发现新的治疗靶点以及开发个性化医学有重要意义。
随着单细胞测序技术的不断发展，越来越多的应用领域将受益于这项技术。
例如，单细胞测序技术在神经科学研究中的应用，可以帮助我们了解大脑中不同神经元亚型的功能和相互作用。
同时，在肿瘤学中，单细胞测序技术可以帮助我们研究肿瘤细胞异质性和治疗抵抗性，为开发个性化肿瘤治疗方案提供新的思路。
尽管单细胞测序技术具有很多潜力和应用前景，但是它也存在着一些挑战。
首先，单细胞的处理和测序过程相对复杂，需要使用高度敏感的技术和设备。
此外，由于细胞的数量和数据量的增加，数据分析的复杂性也大大增加。
因此，我们需要发展更高效和准确的数据处理和分析方法，以便从大量的细胞数据中提取有用的信息。
在未来，单细胞测序技术将继续发展和创新。
我们可以预见，随着技术的不断进步，单细胞测序的分辨率将进一步提高，从而能够更好地解析细胞内基因调控的变化。
单细胞测序技术及应用前景分析
单细胞测序技术及应用前景分析随着科技的不断发展，单细胞测序技术越来越成为了生物医学研究的热门话题。
这项技术可以帮助研究人员更好地了解细胞的分化、发育和功能，深入探索各种疾病的病理机制，并为精准医疗提供有力支持。
本文将主要介绍单细胞测序技术的原理及应用前景。
一、单细胞测序技术的原理单细胞测序技术，顾名思义，就是通过将单个细胞进行分离、捕获、解析和分析，从而实现对单个细胞的RNA或DNA进行检测和测序的一种高通量分子生物学技术。
其主要技术路线包括以下几个步骤：首先，采集样品。
单细胞测序技术需要高品质的单细胞样本，通常采用细胞分选技术、微操纵技术、单细胞随机取材技术等来分离单细胞。
其次，进行单细胞溶解和扩增。
单个单细胞内只有微量的RNA 或DNA，因此需要将其溶解并扩增到足够量的浓度，以便进行后续测序。
接着，构建cDNA文库。
将单细胞中的RNA转录成cDNA，进行文库构建，可以通过实验组成实验组和对照组，从而验证实验数据的可靠性。
最后，进行高通量测序。
对于RNA-Seq分析，常采用Illumina HiSeq X Ten、NovaSeq 6000等高通量测序平台进行构建的文库测序。
对于DNA分析，常用NextSeq 500或MiSeq等测序仪进行测序。
二、单细胞测序技术的应用前景单细胞测序技术在科研领域和临床领域中具有广泛应用前景。
1、分子生物学研究单细胞测序技术的出现，解决了细胞异质性对同一性状评估和研究的限制，从而在细胞分子机理和表观遗传学、基因调控、分化发育和癌症等方面开创了新的研究领域。
首先，RNA测序技术的进步，使得研究人员能够在细胞水平上分析差异基因表达，并对表观遗传学和转录调控机制进行深入探究。
例如，研究人员可以通过RNA分析发育过程中的单个细胞，分析基因表达和转录因子调控过程，揭示发育的分子机理和系统层面的调控网络，同时为研究发育障碍等疾病提供新的思路。
其次，单细胞测序技术还有助于发现不同肿瘤细胞中的基因差异和异质性，探索癌细胞异质性的来源和机制，帮助研究人员了解肿瘤细胞内突变和异质性的分布模式，寻求突破肿瘤个体化治疗的可能性。
单细胞流式质谱
单细胞流式质谱单细胞流式质谱技术是一种分析单个细胞分子组成的非常强大而有效的技术，它结合了流式细胞术和质谱分析技术的优点。
这种技术已经被广泛应用于许多领域，例如生物医学、生物学、药理学和毒学等领域。
本文将详细介绍单细胞流式质谱技术的原理、应用、局限性和未来的发展方向。
一、原理单细胞流式质谱技术的原理主要是基于质谱分析技术和流式细胞术技术。
通过流式细胞术技术，可以将包含目标细胞的样品以事先确定的速率排列并单独通过质谱质谱仪进行分析。
在分析过程中，可以使用激光或其他辐射源对单个细胞进行离子化。
然后将产生的离子发送到质谱仪进行分离，并通过检测电离产物和质量比来确定每个单个细胞的分子组成。
二、应用单细胞流式质谱技术已被广泛应用于研究不同细胞类型之间的分子差异以及细胞内分子的时空调节。
具体应用包括：1. 癌症药物的研究：单细胞流式质谱技术可以确定癌细胞内药物的分子代谢，并研究药物排泄的动态过程。
2. 免疫学研究：单细胞流式质谱技术可以用于研究不同免疫细胞亚型之间的分子差异和活性调节。
3. 脑科学研究：单细胞流式质谱技术可以用于研究脑细胞内各种分子的时空调控和信号转导。
4. 微生物研究：单细胞流式质谱技术可以用于研究不同微生物基因表达的时空差异以及微生物的生长过程。
三、局限性尽管单细胞流式质谱技术已经被广泛应用于许多领域，但它仍存在一些局限性。
主要包括：1. 低灵敏度：与传统质谱技术相比，单细胞流式质谱技术具有较低的灵敏度。
这是由于分析单个细胞需要使用较小的激光功率和离子源的体积。
2. 难以分析复杂样品：单细胞流式质谱技术对于复杂样本的分析有限。
这是由于光谱重叠和质谱强度变化的影响。
四、未来的发展方向尽管单细胞流式质谱技术仍存在一些局限性，但它已经成为分析单个细胞分子组成的非常强大而有效的技术。
未来的发展方向主要包括：1. 提高技术的灵敏度和分辨率。
2. 开发更好的数据处理和分析工具。
3. 开展更多的应用研究，尤其是在癌症诊断和治疗方面。
基于单细胞测序技术的轨迹分析
基于单细胞测序技术的轨迹分析随着科学技术的不断发展，人们对生命基本单位——细胞的研究也越来越深入。
而单细胞测序技术是对单个细胞进行高通量表达谱分析的一种手段，可以从细胞内的RNA序列、DNA序列等方面了解细胞的不同特性。
而基于单细胞测序技术的轨迹分析是一种结合机器学习的方法，能够帮助分析出不同细胞数量和功能的变化规律，可用于肿瘤、胚胎发育等领域的研究。
一、单细胞测序技术的发展概述单细胞测序技术起源于上世纪90年代，当时主要用于细胞基因表达水平的测定。
经过多年的研究和发展，单细胞测序手段也得到了不断完善，由最初的cDNA合成、PCR扩增等技术逐步发展为包括单个细胞的放大、测序、数据分析等多个步骤的完整流程。
目前，流式细胞术+单细胞RNA测序(FACS-seq)、全长转录组测序等这些技术被广泛使用，且数据质量以及检测灵敏度也不断提高。
二、单细胞测序技术的应用单细胞测序技术可以广泛应用于不同的生物领域，如肿瘤学、胚胎学等，以及分析因个体差异导致的疾病。
相比传统的细胞学方法，单细胞测序技术可以将一个样本划分为不同的单个细胞，而不是直接对整个样本进行平均处理，能够检测到细胞异质性，且能够检测到存在于低频率中的突变或者修改。
因此，单细胞测序技术使得我们能够研究特异性的、数量非常稀有的特定人群中细胞表达水平的变化，且不需要对其进行异常富集分离。
在肿瘤学领域，单细胞测序技术也被广泛应用于靶向治疗中，催化药物的研究。
相比传统的癌症治疗，在更好地理解癌症的异质性特点后，能够采用与肿瘤细胞相关的治疗方案是更精确和有效的。
三、轨迹分析的概念和方法轨迹分析是一种基于单细胞测序技术数据的分析方法，可推理出来自异质细胞组成的不同发育或转化方向的细胞进程。
轨迹分析可以被认为是有固定起点到达不同终止点的连续周期，揭示不同细胞类型在发育过程中的发展特征和规律性，即在该过程中，不同状态之间有类似于曲线一样的连续性过渡。
轨迹分析的输入数据是从样本中获取的单细胞分型和测序数据，输出数据则是表明细胞的发展特性和规律性的结果。
单细胞基因测序技术
单细胞基因测序技术单细胞基因测序技术是一种用于分析单个细胞基因组的先进技术，它已经在生物医学研究领域展现出巨大的潜力。
本文将介绍单细胞基因测序技术的原理、应用和未来发展趋势。
一、技术原理1. 单细胞分离：单细胞基因测序技术的第一步是将复杂的细胞样本分离成单个细胞。
这可以通过流式细胞术、微流控技术或手工操作来实现。
2. 细胞裂解：得到单个细胞后，需要对其进行裂解处理，释放其中的RNA或DNA。
3. 库构建：裂解后的RNA或DNA需要经过反转录、扩增和测序库构建步骤，形成测序所需的样本。
4. 序列测定：最后一步是通过高通量测序技术对样本进行测序，获得每个单细胞基因组的信息。
二、技术应用1. 发育生物学：单细胞基因测序技术可以揭示胚胎发育过程中不同细胞类型的基因表达模式，有助于理解细胞分化和组织形成的分子机制。
2. 肿瘤研究：通过对肿瘤细胞进行单细胞基因测序，可以发现不同肿瘤细胞中的基因组变异和表达异质性，有助于揭示肿瘤内部的细胞异质性和进化过程。
3. 精准医学：单细胞基因测序技术有助于个体化医疗，可以帮助医生诊断和治疗疾病，同时也有望促进新药的发现和开发。
三、未来发展趋势1. 技术改进：随着技术的进步，单细胞基因测序技术将变得更加高效、精准和经济，为大规模单细胞测序提供可能。
2. 数据分析：随着单细胞基因测序数据量的增加，数据分析算法和软件工具也将得到不断改进，以更好地挖掘数据中的生物学信息。
3. 应用拓展：单细胞基因测序技术将在药物筛选、疾病诊断和个性化治疗等领域发挥更广泛的作用，有望成为生物医学研究和临床应用的重要工具。
单细胞基因测序技术的出现为生物医学领域带来了革命性的变革，它将有助于我们更深入地理解细胞和疾病的本质，并为未来的个性化医疗和药物研发提供重要支持。
随着该技术的不断发展和应用，相信它将在未来的生物医学研究和临床实践中发挥越来越重要的作用。
单细胞转录组测序技术的发展及其应用
单细胞转录组测序技术的发展及其应用单细胞转录组测序技术是一种能够对单个细胞进行测序和分析的技术。
它的出现彻底改变了我们对细胞的认识和了解。
有了这项技术，我们能够更加深入地研究细胞的特性、功能、亚细胞结构等等，从而更好地了解生物体的运作原理和机制。
一、技术发展及其历程单细胞转录组测序技术的发展早在上世纪90年代就开始了。
当时，研究人员使用微操纵器将单个细胞吸管至小管中，然后将其与反转录剂等试剂一起反应，最后进行PCR扩增。
尽管这项技术具有很大的前景，但是由于其操作过于复杂、耗时、并且存在很大的误差，因此并未得到广泛应用。
直到近年来，随着高通量测序技术不断升级和普及，单细胞转录组测序技术才得以快速发展和广泛应用。
目前，市面上已有多家公司推出了单细胞转录组测序的商用设备和试剂盒，如10x Genomics、Mission Bio、Fluidigm等。
二、技术原理及流程单细胞转录组测序技术的基本原理是将单个细胞中的mRNA通过反转录转换为cDNA，然后进行二代测序。
一般来说，其基本流程如下：首先，需要对单个细胞进行取样，并且在抽取过程中要避免细胞的损伤或降解。
然后，通过某种方式对细胞内的mRNA进行拷贝，并且在其中添加一串barcode，用于区分不同细胞的RNA。
接下来，反转录生成cDNA，并将这些cDNA进行PCR扩增，并进行二代测序。
最后，使用某种软件将得到的数据进行拼接和解码，从而得到每个细胞的RNA序列信息。
三、技术应用单细胞转录组测序技术可以广泛应用于包括癌症、胚胎发育、免疫系统、神经系统等领域中。
以下是技术应用的几个例子：1. 癌症诊断：利用单细胞转录组测序技术，可以快速、准确地检测癌症细胞的转录组变化，从而对患者进行个性化诊断和治疗。
2. 胚胎发育：单细胞转录组测序技术可以帮助我们更好地了解胚胎发育中各种细胞类型的转录组特性和功能，从而更好地探究胚胎发育的规律和机制。
3. 免疫系统：通过对单个细胞进行转录组测序，可以深入了解各种免疫细胞的表达谱和功能，从而更好地研究免疫系统中的信号传递、发炎反应等过程。
人类遗传学的新发现和进展
人类遗传学的新发现和进展人类遗传学是研究人类基因的科学，它有着广泛的应用，包括疾病的诊断和治疗、生殖医学、基因编辑等。
在遗传学领域，近年来发生了很多值得关注的新发现和进展。
一、大规模基因组测序技术的广泛应用大规模基因组测序技术（Next Generation Sequencing，NGS）是近年来遗传学领域的一大突破，它可以对整个基因组进行高通量测序，这使得遗传学研究从以往的小样本和点突变为主，向整体基因组水平进行了拓展。
目前，NGS技术已经被广泛应用于人类疾病的遗传机制研究、基因诊断、疾病风险评估等方面。
二、单细胞测序技术的发展在过去的研究中，组织和细胞的混合使得我们只能了解整个组织或细胞群体的遗传信息。
单细胞测序技术的出现解决了这个难题，它可以对单个细胞进行基因组、转录组、表观转录组等方面的测序，为我们提供了有关细胞功能和遗传特征的详细信息。
这对于研究基因调控、细胞分化、肿瘤发生等有关细胞核心生命机制的问题具有极大的意义。
三、基因编辑技术的广泛应用基因编辑技术是指通过人为的干预来改变基因信息的技术，目前广泛应用于生殖医学、基因治疗、农业和畜牧业等领域。
CRISPR/Cas9技术是近年来被广泛使用的一种基因编辑技术，它通过改变基因序列来修复或删除有害或无益突变。
这为治疗遗传病、肿瘤、传染病等提供了新的希望。
四、人类基因多态性的分析人类基因组中的多态性是指同一种基因在不同个体中存在差异，这种差异涉及基因的序列、表达和功能等方面。
多态性的存在为疾病的发生和个体表型的差异提供了解释。
近年来，人类基因组多态性分析的技术和方法得到了极大的提高，这将有助于更好地理解人类发病机制、遗传特征和进化历程。
五、新型基因突变的发现在人类遗传学研究中，新的基因突变一直是一个重要的领域。
近年来，随着NGS技术的不断发展和应用，越来越多新型基因突变的发现。
这些新型突变不仅为我们提供了更多认识人类基因组的信息，同时也为疾病的诊断和治疗提供了新思路。
单细胞分析的研究
胞分析方面的研究成果及单细胞分析在国内外的最 新发展。这部专著在单细胞分析方面是目前仅有的 一本参考书。 # # 本文重点介绍我们研究组在单细胞分析方面的 研究及近三年国内 外 用 毛 细 管 电 泳、 微流控芯片进 行单细胞分析的新发 展。 !$$% 年 以 来， 在单细胞分 析方面的综述有我们 研 究 组［ & ］撰 写 的 “ 单细胞分析 新发展” ， 该 文 对 单 细 胞 的 操 纵、 毛 细 管 电 泳 分 析、 成像观测、 实时动态 监 测 及 各 种 方 法 的 应 用 进 行 了 全面综述。 4*+/- 和 @##［ ’ ］撰写的 “ 单细胞动力学分 析用于生物学” ， 介绍了高 通 量 单 细 胞 分 析 法 （ 流体 细胞法、 激 光 扫 描 流 体 细 胞 法、 自动化显微镜） 、 微 流控技术、 阵列技术、 分离技术等在生物学方面的应 用， 对开展单细胞分析有极好的参考价值。
’( ［#］ ［%］
囊泡释放多巴胺［ "$ ］。 金 文 睿 研 究 组 对 毛 细 管 电 泳 电化学检测单细胞中的组分进行了一系列研究。最 近他们采用氢醌及 过 氧 化 氩 作 酶 催 化 反 应 底 物， 用 微池双电极伏安法测量单个中性白细胞及急性白血 病细胞中过氧化 酶 的 活 性［ "" ］。 随 后 又 报 道 高 通 量 检测单细胞中过氧 化 酶 的 新 方 法， 连续检测速度高
对细胞
的输入及输出响应机理进行了研究 （ 见图 $ ） 。 进行 单细胞分析研究就 是 进 行 细 胞 的 生 长 与 分 化、 代谢 与繁殖、 运动与联 络、 衰 老 与 死 亡、 遗传与进化等生 命过程中的分析化学研究。 - - 细胞极小 （ 直径 . & $% ! . ） ， 样品量很少 （ FI & BI ） ， 被测组分含量很低 （ B.() & J.() ） 。 因 此， 长期 以来由于检测方法 的 灵 敏 度 不 够， 只能进行细胞群 体分析， 从中获 得 细 胞 中 的 化 学 信 息。 通 过 细 胞 群
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第18卷 第4期大学化学2003年8月今日化学21世纪单细胞分析发展程介克X 庞代文XX 黄卫华X X X 鲁馨X X X X(武汉大学化学与分子科学学院 武汉430072)细胞是生物体的形态结构和生命活动的基本单位。
了解生物体生命活动的规律,必须以研究细胞为基础,探索细胞的生命活动,掌握和控制生、老、病、死的规律,造福于人。
目前细胞研究已经从细胞整体(单细胞)深入到亚细胞(局部细胞质、细胞膜、囊泡)和分子水平(DNA 等生物大分子及单分子)。
因此,单细胞分析向分析化学提出了严峻的挑战,也带来众多机遇。
由于细胞极小(一般直径7~100L m),样品量很少(体积fL~pL),胞内组分十分复杂(最简单的红血球细胞含蛋白质上千种),胞内生化反应速度快(ms~s 级),因此,单细胞分析要求超小体积、灵敏度高(amol~zmol,10-15~10-21mol/L)、选择性好、响应速度快的分析技术。
由于毛细管电泳能满足上述要求,在单细胞分析中研究及应用最为广泛。
国外在单细胞分析领域较著名的研究组均集中在美国,如北卡罗来纳大学J.W.Jorgen -son,R.M.Wightm an,宾州州立大学A.G.Ew ing,衣阿华州立大学E.S.Yeung,伊利诺大学J.V.Sw eedler,密西根大学R.T.Kennedy 及华盛顿大学N.J.Dovichi 等。
国内在单细胞分析方面起步较晚,力量分散,发展较缓慢。
目前承担国家自然科学基金资助课题的单位(按资助年代先后为序)有武汉大学、山东大学、中国科技大学北京研究生院、中国科学院化学研究所、北京大学、中国科学院大连化学物理研究所、南京大学、广西师范大学等。
近10年来,国家自然科学基金委对单细胞分析研究课题给予了大力支持和积极赞助。
由于单细胞分析领域的迅速发展,2002年批准资助课题大幅度上升到6项(/十五0重大项目中子课题1项、重点项目1项、面上项目4项),标志着我国单细胞分析进入一个蓬勃发展时期。
武汉大学在单细胞分析领域是承担基金委资助课题最早和最多的单位(1992年以来承担6项),已经开展了毛细管电泳、微流控芯片、电化学、阿达玛变换图像、动力学、微透析及荧光探针分析单细胞的研究,逐步形成一个单细胞分析的研究群体。
单细胞分析发展与毛细管电泳的兴起紧密相关。
因此,这一领域的综述均以毛细管电泳为主,结合电化学、激光诱导荧光、质谱等检测方法[1]。
近几年,微流控芯片[2]、图像分析[3]、实时动态监测[4]单细胞的研究迅速增长。
单细胞分析的应用在不断拓宽和深入,在疾病的早期诊断方面出现了可喜的前景[5]。
1X XX XXX XXXX 鲁馨:武汉大学博士研究生。
黄卫华:武汉大学博士,讲师。
庞代文:武汉大学教授,博士生导师。
程介克:武汉大学教授,博士生导师。
本文根据近几年单细胞分析的发展情况,突破了过去仅从毛细管电泳论述单细胞分析,而从单细胞操纵、进样和溶胞,图像分析,实时动态监测,应用4个方面,论述进入21世纪以来单细胞分析的发展。
并根据我国国情和单细胞分析现状,提出在我国发展单细胞分析的战略和对策。
1 单细胞操纵、进样及溶胞1.1 操纵单细胞操纵是单细胞分析的基础,操纵单细胞的方法主要有接触法和非接触法两种。
接触法以微操纵系统控制微型吸管,并采用微吸取装置对微吸管施加负压,将细胞吸在尖端,完成单个细胞操纵、转移等操作。
该法直接操纵单个细胞,是目前应用最广泛的方法,其缺点在于需要精密微操纵系统及熟练操作技巧。
非接触法操纵可不直接接触细胞,其中应用最多的是激光捕集方法,又称光钳(optical trap)法,利用激光对细胞产生的作用力来完成单个细胞操纵及定位[6]。
非接触法对细胞伤害较小,但操纵力度不大,且操纵难度较大。
Zare 研究组[7]发展了一种以激光捕集法将单个细胞定位于微型管端,在压力控制下完成单个细胞停留和转移操作,该法综合了接触法与非接触法的优点,操作简便有效。
近年来,随着芯片技术发展,微流控芯片为细胞的传输及定位等操纵提供了一种优良的平台,操纵细胞主要基于电动及流体动力两大类。
D.J.H arrison 采用电渗驱动方式最早实现了群体细胞在芯片通道中的传输。
我们首次运用流体动力为驱动力控制单个细胞在芯片上的操纵、传输,利用芯片上的微室对单个细胞进行定位,并对定位后细胞的量子释放进行了实时监测[8]。
可以预见,微流控芯片技术必将在单细胞的操纵中发挥越来越重要的作用。
1.2 进样单细胞进样指单个细胞进入毛细管或芯片通道。
常用方法是在倒置显微镜下,将氢氟酸腐蚀的毛细管尖端靠近单个细胞,采取电动或压力差的方法将单个细胞吸入毛细管中。
该法需对毛细管尖端进行腐蚀,还需精密微操纵系统,操作较为复杂。
Dovichi 研究组[9]设计了自动化透明细胞进样器,无须刻蚀毛细管,进样端垂直接触细胞悬浮溶液,控制进样时间,电迁移或压力控制单个细胞进入毛细管。
图1 单细胞连续进样毛细管电泳分析装置为了提高单细胞进样效率,Lillard 等[10]设计了一种单细胞连续进样装置(图1),将进样毛细管与电泳分离毛细管连接。
进样毛细管浸入流动缓冲内,加高电场于毛细管两端时,细胞通过电渗流驱动连续不断进入进样毛细管中,细胞在接口处破膜,进入分离毛细管电泳分离。
该法不需要显微镜和微操纵器,分析时间短,可以方便、快速地进行单个红血球细胞连续测定。
但存在细胞连续进样时间不易控制,前后两个细胞电泳分离组分出现互相交叉的现象,尚待改进。
Walt 等[11]采用芯片技术,设计了一种高密度的单细胞定位芯片,芯片上有直径为5L m 的阵列微室,将单个细胞随机分散于各个微室中,实现多个单细胞快速、同步检测。
Schm idt 等[12]也设计了类似的芯片2阵列单细胞定位及分析系统,可以测定多个细胞和单细胞的动态过程。
这种基于微阵列芯片的单细胞进样、定位及检测系统可以实现大量单个细胞的同时测定,大大提高了单细胞分析效率。
1.3溶胞单个细胞进入毛细管或微流控芯片通道后,一般情况下必须溶解细胞(溶胞)以便进行分离检测。
通常采用表面活性剂或低渗溶液引起细胞膜破裂达到溶胞目的。
该法操作简单,且效率较高,所需时间一般为几秒钟。
对于细胞中化学反应速度慢的分析物,如有机小分子、DNA、RNA及蛋白质等含量的分离检测,实为一种方便、高效的方法,因此已得到广泛应用[1]。
但胞内一些生化反应速度快,为秒级或更短时间。
如单细胞内酶活性,为了准确测量,就要求细胞在亚秒(subsecond)时间内快速溶解,终止生化反应。
Allbriton等[13]在快溶细胞方面做了一系列研究,首先提出激光快速溶胞方法,可在很短时间(n33ms)内溶胞,有效防止了胞内酶活性在溶胞时发生改变。
该法对贴壁细胞和悬浮细胞均可适用,缺点在于需昂贵的脉冲激光器,且操作有一定难度。
最近他们提出了一种快速电溶胞方法,电溶胞是基于电穿孔(electroporation)原理,当脉冲电压超过一定值时,造成细胞破裂。
电溶胞与激光溶胞时间相当[14],该法不需要昂贵的脉冲激光器,操作也较简便,是一种高效的快速溶胞技术。
2图像分析细胞的发现与显微镜密切相关,没有显微镜就没有细胞学。
因此,显微镜是生物学最普遍应用的仪器。
在细胞图像分析领域,生物学家有丰富的知识和经验值得学习。
但从细胞图像分析来看,生物学家主要观察细胞的形态和结构,现在商品光学显微镜为了适应生物学需要,重点均放在如何获得清晰的细胞形态图像;而化学家特别是分析化学家,除了要求获得清晰的细胞图像外,更注重细胞图像的鉴定及定量分析,目前的商品光学显微镜一般不能适应这一要求。
如荧光显微镜(Olympus,IX70,日本)在显微光路中有较大的孔隙漏光,在检测荧光强度时,导致背景高,影响信噪比,降低了检测灵敏度。
为了降低漏光产生的高背景,须将显微镜置于加工的暗箱中检测荧光[15]。
高档荧光显微镜(200M,Zeiss,德国)漏光现象少一些,但并未根除。
对光学显微镜进行研制及改进,以满足化学家研究生物的要求,为显微光学及显微镜制造厂商提出了新课题。
2.1光学显微镜单细胞图像分析已经开发出多种途径。
最近Stephens[16]对光学显微镜用于活细胞成像进行了详细评述。
荧光显微镜用于单细胞成像的报道最多,由于显微光学的发展,已有各种性能的荧光显微镜以适应单细胞图像分析的不同需求。
由于分析化学家在这方面接触较少,故作较详细论述。
2.1.1一般荧光显微镜一般荧光显微镜配备激光器及CCD摄像机,曾获得单个星形胶质神经细胞中神经递质5-羟色胺分布的天然荧光图像。
采用高密度微室芯片,将单个酵母细胞分别置于6L m微室中,用多种荧光染料标记,以汞灯倒置荧光显微镜/阵列光导纤维/CCD获得活细胞阵列图像,显著提高了单细胞图像分析的效率[11]。
由于数码相机的发展,最近在荧光显微镜中已配备高分辨数码相机,可获得更清晰的单细胞图像。
我们在配备高分辨数码相机(3900@3090像素, AxioCam HR,Zeiss)的新型倒置荧光显微镜(200M,Zeiss)上,用萘二甲醛(NDA)荧光染料标3记单个神经癌细胞(PC12)中神经递质多巴胺,获得了细胞中多巴胺分布图像,较增强型ICCD (1024@1024像素,Princeton,美国)所得图像更为清晰。
武汉大学陈观铨及唐宏武等[17]采用一般荧光显微镜通过阿达玛变换及CCD摄像,研制出高分辨率阿达玛变换显微图像分析系统,已成功用于人乳腺肿瘤细胞中DNA、花粉细胞中DNA及抗癌药物筛选研究。
一般荧光显微镜在单细胞成像方面仍在广泛应用。
2.1.2激光共聚焦荧光显微镜在光路中加光学滤波器(针孔)共聚焦成像,可得到细胞高分辨微结构荧光图像[18]。
Nie 等[19]用激光共聚焦显微镜探测人子宫颈癌细胞(H eLa)摄入转铁蛋白(甲基若丹明标记)单分子,细胞内荧光背景高,但较稳定,对单分子测量无明显干扰。
Zare等[20]在激光共聚焦显微镜下,用光钳操纵单个人工合成磷脂囊泡(直径1~5L m,体积fL~zL),在两个囊泡中,一个含钙荧光试剂(fluo-3),另一个含钙离子。
两囊泡用电脉冲融合后,产生荧光响应,在荧光显微镜下检测荧光强度提高40倍。
我们曾访问Zare实验室,目睹此实验过程精彩的电视录像。
当问及应用到真实囊泡研究,Zare表示正在探索中,但至今仍未见到有关报道。
表明单个囊泡的研究仍存在较大难度。
共聚焦荧光显微镜可用于细胞长时间图像分析。
Song[21]采用荧光染料标记及共聚焦荧光成像技术,发现新生鼠星形神经细胞能刺激成年鼠脑中干细胞产生新神经元,使神经元生长速度提高8倍,这一研究为治疗早期老年痴呆症显现出曙光,引起人们重视。
2.1.3多光子激发荧光显微镜多光子与单光子激发相比较,具有穿透深、自荧光影响小、活细胞的光损伤小、可长时间观测等优点。