如何分离纯化、鉴定外泌体(借鉴材料)
外泌体提取的方法
外泌体提取的方法外泌体是一种小型的胞外囊泡，它们由细胞释放出来，带有许多生物分子，如蛋白质、RNA和DNA等。
这些外泌体在很多生物体中都被发现，包括植物、动物和微生物等，而研究它们已经成为了一个热门课题。
因此，外泌体提取方法的研究也愈发重要。
1. 已有的外泌体提取方法目前已经开发出了几种外泌体提取方法，包括差速离心、密度梯度离心和超滤等。
这些方法每一种都有其优点和限制。
下面将分别介绍这三种方法。
差速离心法这是当前最常用的外泌体提取方法。
差速离心法利用一个多步骤的过滤和离心过程来提取外泌体。
此方法通过圆盘刷子离心除去大的细胞残留和细胞碎片，然后再通过速度梯度离心 Pellet 小径的微粒（包括外泌体）。
最终，被Pellet收集的微粒经过洗涤和再次离心以获得纯化的外泌体。
但这种方法也存在一些问题。
例如：外泌体含量极小，容易堵塞过滤器，处理时间也较长等。
密度梯度离心法这种方法是通过使用梯度浓度离心的离心管来纯化和分离外泌体。
这种方法可以强制微粒沉降到其密度梯度离心中与之匹配的密度位置。
密度高的梯度位置收集纯化的外泌体。
但是，密度梯度离心法也存在一些限制，由于梯度的浓度特性，产生相当多的上清液需要处理。
超滤法超滤法可以使用聚酰胺膜筛，把自然和添加的物质、基质等从水或反向微乳液中移除。
超滤法是一种最新的外泌体提取方法。
此方法是通过微孔膜以外泌体大小排除液体中的大分子物质，而留下外泌体和其他小分子在膜上。
最后，外泌体可以从膜上收集。
但是此方法也存在缺陷，需要更昂贵的设备，如超滤膜和超滤器等。
2. 未来发展方向虽然以上方法都有其优点和缺陷，但随着技术的发展和研究的深入，可能会出现新的外泌体提取方法，以更快捷、更准确、更方便的方式提取外泌体。
例如，利用氮氧化物处理方法，可以在不使用离心机和过滤器的情况下，快速提取外泌体。
这种方法可以在较少的研究时间内提取足够数量的外泌体。
随着技术的不断发展，人们希望设计出更加高效的方法，以便更好地应用于外泌体的研究中，更广泛地使用这些方法，并更好地理解外泌体的分子机制。
外泌体提取和鉴定介绍
外泌体提取和鉴定介绍
外泌体是细胞分泌的一种小囊泡，直径在30-150 纳米之间，含有多种生物分子，如蛋白质、核酸、脂质等。
它们在细胞间通讯、疾病诊断和治疗等方面具有重要的作用。
外泌体的提取通常需要使用特殊的方法，以确保其纯度和完整性。
常见的提取方法包括超速离心、超滤、免疫亲和层析等。
这些方法可以根据外泌体的大小、表面标志物或其他特性进行分离和纯化。
鉴定外泌体的方法也有很多种。
其中一些常见的方法包括：
- 电子显微镜：观察外泌体的形态和大小。
- Western blot：检测外泌体表面标志物或内含物的蛋白质。
- 纳米颗粒跟踪分析：测量外泌体的粒径分布和浓度。
- 流式细胞术：根据外泌体的表面标志物进行分选和定量。
此外，还可以通过检测外泌体中的RNA 或DNA 来进一步分析其内容和功能。
这些鉴定方法可以帮助确定所提取的物质是否为真正的外泌体，并提供有关其特性和功能的信息。
需要注意的是，外泌体的研究仍然是一个相对较新的领域，不同的实验方法和技术可能会有所差异。
在进行外泌体提取和鉴定时，最好根
据具体的研究目的和实验条件选择合适的方法，并结合多种技术进行综合分析。
外泌体提取方法
外泌体提取方法外泌体是一类细胞外囊泡，其直径一般在30-1000纳米之间，可以带有脂质、蛋白质、核酸等多种生物分子，是细胞间物质交换的重要载体。
外泌体的提取方法对于研究其功能和应用具有重要意义。
本文将介绍几种常用的外泌体提取方法，供大家参考。
一、超速离心法。
超速离心法是目前最常用的外泌体提取方法之一。
首先，将细胞培养液离心，去除细胞残渣和大颗粒物质，得到上清液。
然后，将上清液进行超速离心，沉淀出外泌体。
最后，去除上清液，留下外泌体沉淀，即可得到外泌体。
二、超滤法。
超滤法是另一种常用的外泌体提取方法。
首先，将细胞培养液经过低速离心，去除细胞残渣和大颗粒物质，得到上清液。
然后，将上清液通过超滤膜进行过滤，截留外泌体。
最后，用PBS等缓冲液洗涤超滤膜上的外泌体，即可得到外泌体。
三、沉淀法。
沉淀法是一种简单易行的外泌体提取方法。
首先，将细胞培养液离心，去除细胞残渣和大颗粒物质，得到上清液。
然后，向上清液中加入聚乙二醇或其他沉淀剂，使外泌体沉淀出来。
最后，用PBS等缓冲液洗涤外泌体沉淀，即可得到外泌体。
四、免疫磁珠法。
免疫磁珠法是一种特异性较强的外泌体提取方法。
首先，将细胞培养液经过低速离心，去除细胞残渣和大颗粒物质，得到上清液。
然后，向上清液中加入特异性抗体修饰的磁珠，使外泌体与磁珠结合。
最后，利用磁场将外泌体结合的磁珠吸附在管壁上，去除上清液，再用缓冲液洗涤磁珠，即可得到外泌体。
以上介绍了几种常用的外泌体提取方法，每种方法都有其特点和适用范围。
在实际操作中，可以根据研究需求和实验条件选择合适的提取方法。
希望本文的介绍能够对外泌体的研究工作有所帮助。
一种外泌体的提取方法及其应用与流程
一种外泌体的提取方法及其应用与流程一、引言外泌体是一种存在于细胞外液中的小颗粒，其直径一般在30-150纳米之间。
外泌体中富含蛋白质、核酸、脂质等生物分子，具有广泛的生物学功能。
近年来，外泌体的提取方法及其应用得到了广泛关注。
本文将介绍一种常用的外泌体提取方法，并探讨其在生物医学研究中的应用与流程。
二、外泌体提取方法目前常用的外泌体提取方法主要包括超速离心法、滤膜法、沉淀法和免疫亲和法等。
其中，超速离心法是最常用的方法之一。
其主要步骤如下：1. 收集细胞培养上清液或生物体体液，如血浆、尿液等。
2. 进行一系列离心步骤，以去除细胞碎片和大颗粒物质。
一般先进行低速离心，去除大颗粒物质，然后再进行高速离心，沉淀外泌体。
3. 分离外泌体。
将高速离心上清液转移到新离心管中，再次进行超高速离心，将外泌体沉淀下来。
4. 去除上清液，将外泌体沉淀悬浮于适当的缓冲液中。
三、外泌体的应用与流程外泌体作为一种新型的细胞间通讯介质，具有广泛的应用前景。
下面将介绍其在生物医学研究中的应用与流程。
1. 生物标志物的发现与应用外泌体中含有丰富的蛋白质和核酸等生物分子，这些分子的组成和含量可以反映细胞的生理状态和病理变化。
因此，外泌体被广泛应用于生物标志物的发现与应用。
研究人员可以通过分析外泌体中的蛋白质和核酸的组成，来寻找与特定疾病相关的生物标志物，从而实现早期诊断和治疗监测。
2. 药物传递系统的研究与应用外泌体具有天然的包裹和传递生物分子的能力，因此被广泛应用于药物传递系统的研究。
研究人员可以将药物封装在外泌体中，并通过改变外泌体的表面性质，实现药物的靶向输送和释放。
这种外泌体作为药物传递系统的方法具有较高的稳定性和生物相容性，对于治疗肿瘤等疾病具有潜在的应用价值。
3. 疾病机制的研究与探索外泌体中富含的生物分子可以提供重要的疾病机制信息。
通过分析外泌体中的蛋白质和核酸的组成，研究人员可以了解疾病发生发展的分子机制，从而为疾病的治疗和预防提供新的思路和靶点。
外泌体分离及纯化方法
外泌体分离及纯化方法我折腾了好久外泌体分离及纯化方法，总算找到点门道。
我一开始纯粹是瞎摸索。
最开始尝试的是超速离心法。
这就像是一场速度的竞赛，你得让那些外泌体在高速旋转下和其他物质分离开。
我当时设置离心机转速的时候可谨慎了，一边看着说明书，一边还担心会不会出啥差错。
这过程中，转速不能太快也不能太慢，就好像你在走钢丝一样，得找到那个平衡点。
我刚开始就弄错了转速，按照自己的想当然来了一次，结果嘛，根本没分离出啥有效东西，那一次算是彻底失败了。
后来仔细研究了好多文献资料，就像翻老祖宗的宝贝箱子一样，一个一个查看，才又重新尝试，成功分离出来一部分外泌体，但这个方法操作起来真的超级麻烦，稍微有个数据没调好，就可能功亏一篑。
我也试过沉淀法。
这个就像把水里的沙子和泥土沉淀下去一样，通过加一些特定的试剂，让外泌体沉淀。
但是这里头学问也大。
我记得刚开始没选对合适的试剂量，加得太多或者太少，得到的外泌体要么纯度不行，要么量少得可怜。
而且试剂和样本的混合我当时也没掌握好技巧，就直接倒进去搅和了一下，现在想想真是太草率了。
后来还试着从试剂盒里找办法。
那些试剂盒号称操作简单，就像组合玩具一样，只要按照步骤来就可以。
可是实际用起来发现也不是想象中的那么顺利。
有时候试剂盒的配套仪器没能校准好，又得重新开始，浪费不少样本。
说起来还有超滤法。
这就像是通过一道一道筛子，把外泌体筛出来。
但是这个筛子的孔径啥的得选好。
我有次选错了孔径的超滤膜，根本就没办法把杂质和外泌体有效分开。
而且在不同样本里面，这个孔径的选择可能还得有点小调整。
我觉得要是想做好外泌体的分离和纯化得小心再小心。
要是没有经验的话，像我最开始那样，得做好多次尝试失败的准备。
每一次失败其实都是在积累经验，你在分析为啥失败的时候，肯定能学到不少东西。
而且不管用啥方法，都得严格按照操作步骤来，千万别学我刚开始那样自己瞎搞。
外泌体提取步骤
外泌体提取步骤外泌体提取是一种从细胞外分泌物中分离和纯化外泌体的方法，它可以帮助研究人员获取纯净的外泌体样品，并对其进行进一步的分析和研究。
本文将介绍外泌体提取的步骤。
1. 细胞培养需要选择感兴趣的细胞系进行培养。
将细胞种植在培养皿中，并提供适当的培养基和条件，使细胞能够正常生长和分裂。
2. 收集细胞上清液当细胞生长到一定程度时，收集细胞上清液。
将培养皿中的培养基转移至离心管中，并使用低速离心（约300-500×g）离心10-20分钟，以去除细胞和细胞碎片。
3. 高速离心将离心后的上清液转移到新的离心管中，并使用高速离心（约10,000-20,000×g）离心30-60分钟，以沉淀外泌体。
4. 洗涤外泌体将外泌体沉淀用冷PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤，以去除杂质和未结合的蛋白质。
洗涤过程中可以进行多次离心和上清液的去除。
5. 再次离心将洗涤后的外泌体沉淀用PBS再次离心，以获得更纯净的外泌体样品。
6. 纯化外泌体为了进一步提高外泌体的纯度，可以使用浓缩、超滤等方法对外泌体进行纯化处理。
这些方法可以去除残余的蛋白质和其他杂质，提高外泌体的纯度和浓度。
7. 确认外泌体使用电子显微镜观察外泌体的形态和结构，确认提取到的颗粒为外泌体。
此外，还可以使用Western blot、质谱等技术对外泌体进行进一步的鉴定和验证。
8. 外泌体的应用提取到的外泌体可以用于进一步的研究和应用。
外泌体中包含了丰富的蛋白质、核酸、脂质等生物分子，可以用于疾病诊断、药物传递、基因治疗等领域。
总结：外泌体提取是一种重要的实验操作，可以帮助研究人员获取纯净的外泌体样品。
通过细胞培养、离心、洗涤和纯化等步骤，可以从细胞上清液中分离和纯化外泌体。
外泌体提取的纯度和质量对于后续的研究和应用至关重要。
外泌体的提取和研究有望在生物医学研究中发挥重要作用，为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。
一种分离和纯化外泌体的方法
一种分离和纯化外泌体的方法分离和纯化外泌体是一项重要的生物学技术，用于从生物样本中获取纯净的外泌体颗粒。
外泌体是一类小型细胞分泌泡，内含有丰富的生物活性分子，如蛋白质、核酸和脂质。
它们在细胞间传递信号、调节细胞功能以及参与疾病的发生和发展过程中起着重要的作用。
因此，研究外泌体对于了解细胞通讯机制和疾病生理过程具有重要意义。
常用的外泌体分离和纯化方法包括超速离心、滤膜法、密度梯度离心、免疫亲和法和尺寸排除层析法等。
下面将逐一介绍这些方法的原理和步骤。
超速离心法是最常用的外泌体分离方法之一。
首先，将细胞培养液或生物体液进行低速离心，去除细胞碎片和大颗粒物质。
然后，将上清液进行高速离心，使外泌体沉淀于离心管底部。
最后，将上清液弃去，用适当缓冲液悬浮沉淀物，即可获得外泌体。
滤膜法是一种简单而高效的外泌体分离方法。
将细胞培养液或生物体液通过一系列孔径大小不同的滤膜，通过筛选的方式分离外泌体颗粒。
常用的滤膜孔径为0.1-0.8微米，可以选择不同孔径的滤膜进行连续过滤，以获得更纯净的外泌体。
密度梯度离心法基于外泌体与溶液密度不同的原理进行分离。
首先，制备一系列密度逐渐增大的梯度离心液。
然后，将细胞培养液或生物体液加入离心管中，通过离心使外泌体在不同密度梯度处分层。
最后，根据外泌体沉淀的位置，分离出目标外泌体。
免疫亲和法利用外泌体表面特定分子与抗体的特异性结合进行分离。
首先，将细胞培养液或生物体液与特定抗体结合，形成免疫复合物。
然后，使用磁珠或琼脂糖等材料将免疫复合物捕获，再通过磁力或离心将目标外泌体分离出来。
尺寸排除层析法是一种基于外泌体颗粒尺寸差异的分离方法。
将细胞培养液或生物体液通过一列具有特定孔径的柱子，较大的细胞碎片和颗粒物质会被柱子内部的填料所阻挡，而较小的外泌体则能够通过填料，被分离出来。
在进行外泌体分离和纯化的过程中，为了提高纯度和产量，常常需要采用多种方法的组合。
例如，可以先利用超速离心法去除大颗粒物质，然后再使用滤膜法或密度梯度离心法进一步纯化外泌体。
外泌体分离鉴定实验技术介绍及选用策略
如果使用国产的生工出品PEG6000，生 工官网报价 500g 不足百元。
外泌体的不同分离方法对比
免疫沉淀
抗体或适配体
囊泡表面CD63、PS、 其他特殊蛋白等
外泌体下游研究技术 高通量分析——RNA高通量分析、蛋白质谱分析 过表达或敲低外泌体中的RNA或蛋白 靶细胞对外泌体的摄取 抑制外泌体的释放或摄取
外泌体研究——论文的套路
外泌体的不同分离方法对比
超速离心 起始量要大！一般 40~100mL培液起
水平转最好！ 不要倒！ 不要倒！ 不要倒！
外泌体miRNA测序案例
Li L, Li C, Wang S, et al. Exosomes Derived from Hypoxic Oral Squamous Cell Carcinoma Cells Deliver miR-21 to Normoxic Cells to Elicit a Prometastatic Phenotype. Cancer Res. 2016;76(7):1770-80
电镜检测外泌体形态
制样： • 40ml 培液超速离心分离得到的外泌体，重悬于20-30ul PBS中。 • 吸取样品10ul 滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液。 • 吸取2%的醋酸双氧铀10ul滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液。 • 常温干燥十五分钟。上机。 80kv-120kv 成像
Tip：如果使用聚合物沉淀分离的样品打电镜。在电镜 实验前可以使用100KD的超滤管反复洗涤样品数次。去 除杂蛋白后再进行电镜检测，会得到意想不到的效果哦。
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如何分离纯化、鉴定外泌体
外泌体相关研究逐渐从小众走向大众，受到越来越多的关注，涌现了一大批的外泌体课题。
但大家还是感觉外泌体研究好难啊！为什么呢？首要原因就在于该领域里还木有统一的、简单可行且纯度很高的分离方法。
今天就来给大家聊一聊如何搞定外泌体研究中的第一步。
一、分离
超速离心法:
超速离心法是外泌体分离最常见的技术之一。
据不完全统计，约有1/2的研究者会选择该种方式分离外泌体。
该方法由几个离心步骤组成，可分步去除细胞、细胞碎片和大囊泡，沉淀外泌体（如图所示）。
但该种方法用于血浆和血清等粘性生物液体时效率较低，且重复离心操作有可能对外泌体造成损害，从而降低其质量。
如将超速离心配合蔗糖溶液进行梯度密度离心可得到纯度更高的外泌体，是公认可以得到最高纯度的分离方法。
但此法对离心时间非常敏感，一般需要8-30h，产率较低，同样不适用于血浆和血清等粘性生物液体中外泌体的分离，因此难以广泛普及。
聚合物沉淀法:
第二大主流的外泌体分离技术就是基于聚合物的沉淀法了，最常见的聚合物是聚乙二醇（PEG）。
通常将含有聚合物的沉淀溶液与生物体液混合，4℃温育，低速离心，沉淀外泌体（如图所示）。
目前已有成熟的PEG-base商业试剂盒，比如图中的ExoQuick™（System Biosciences）。
这类试剂盒使用容易和快速，不需要额外的设备，且随着产品不断更新换代，提取效率和纯化效果逐渐提高，因而逐渐取代超速离心法并推广开来。
沉淀法的主要缺点是分离物中会有少量的聚合物存在。
不过大家不用担心，一般来说这些物质不会干扰下游分析，使用商业试剂盒提取外泌体也受到越来越多杂志的认可。
二、鉴定
外泌体的鉴定是继分离后又一个困扰研究者的问题。
如果大家看过外泌体研究相关的文献，就肯定对一张图印象深刻。
不错，想发外泌体文章，光找到高效率的分离方法还不够，要过的第二关就是证明你分离得到的就是外泌体。
鉴定方式不外乎就是下面这三种：1. 形态学（电镜）；2. 粒子大小（径粒分析）；以及3. 标志蛋白（WB）。
综合来说，透射电镜可以清楚的看到外泌体的大小、形态等，属于鉴定方法中的金标准，其他两种方式则常常作为辅助使用。
三、得到了外泌体之后如何做
外泌体携带大量功能性的miRNA，少量的mRNA、lncRNA，以及特异性的蛋白质（如细胞因子、生长因子）等生物活性物质，在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程，与多种疾病的发生和进程密切相关。
对外泌体验明正身之后，就可以在蛋白水平和核酸水平对其进行检测和深入分析了。
由于外泌体中含有较多降解的短RNA片段，测序时会成为背景干扰有效数据，通常都建议使用芯片的方法检测外泌体miRNA。
而对于lncRNA来说，大部分在细胞内低表达，在外泌体中丰度就更低了，对于低丰度基因，芯片检测的准确性远远大于测序，因此也建议使用基因芯片的方法检测外泌体lncRNA。