基于微流控的外泌体分离技术也于近些年来不断涌现
基于微流控的外泌体分离技术也于近些年来不断涌现
?外泌体是多数细胞都会分泌的胞外小囊泡（Extracellular vesicles或EV），直径为20-140 nm。它含有来源细胞丰富的核酸和蛋白质，并广泛存在于各种体液之中（在血液中的浓度大于10/mL）。它们是来源癌细胞遗传物质和蛋白质的稳定载体，能够实时地反映癌症肿瘤的发展状况，在早期癌症诊断方面具有巨大的潜力。
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?同时外泌体在很多病理生理过程中也发挥着重要作用，如免疫应答中的抗原呈递、肿瘤细胞的生长与迁移、组织损伤修复等。另外外泌体的脂质双层膜结构不仅能很好的保护其包被物质，而且能靶向特定细胞或组织，有潜力成为新的高效靶向给药载体。
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?然而，目前已有的外泌体分离方法，例如超速离心和免疫磁珠法等仍存在着如耗费时间长、操作步骤繁琐复杂、设备昂贵和分离纯度低等局限性，尚无法完全满足科研及临床对高纯度外泌体的需求。所以对快速，高纯度外泌体分离的研究已经成为目前世界上相关领域的研究热点和当务之急。
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?微流控指的是使用微管道（尺寸为数微米到数百微米）处理或操纵微小流体（体积为纳升到阿升）的系统所涉及的科学和技术，是一门涉及化学、流
微流控技术平台在IVD中的运用
一、微流控平台的定义和特点 微流控是一项融合了微电子学、材料科学、生物科学、制药以及临床医学等众多领域的综合性技术，需要跨领域跨学科的深入交流和合作。什么是微流控芯片?微型+集成+自动化。微流控芯片顺应分析仪器的发展趋势(微型化/集成化与便携化),很大程度缩短样本处理时间,并通过精密控制液体流动,实现试剂耗材的最大利用效率,把整个化验室的功能,包括采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等集成在微芯片上,且可以多次使用。 微流控芯片的发展正呈现三个基本特征：1）平台研究多学科交叉，2）应用研究多领域渗透，3）产业迅速崛起将成为新一代即时诊断（POCT）的主流技术；微流控反应筛选芯片在高通量药物筛选、材料合成、模拟和单细胞测序等领域显示了巨大潜力；而微流控细胞/器官芯片则有望应用于药物毒理和药理作用研究，部分替代医药研究试验动物，是细胞及微环境操控最重要的技术平台。 微流控芯片的最大特点是在一个芯片上可以形成多功能集成体系和数目众多的复合体系的微全分析系统。微流控芯片内部集成的单元部件越来越多，且集成的规模也归来越大，使着微流控芯片有着强大的集成性。同时可以大量平行处理样品，具有高通量的特点，分析速度快、耗低，物耗少，污染小，分析样品所需要的试剂量仅几微升至几十个微升，被分析的物质的体积甚至在纳升级或皮升级。 原则上，微流控芯片作为一种“微全分析技术平台可以应用于各个分析领域，如生化医疗诊断、食品和商品检验、环境监测、刑事科学、军事科学和航天科学等重要应用领域，其中生物医学分析是热点。目前来看，体外诊断是微流控技术的最大的应用场景，而在体外诊断中，微流控技术应用的重点在于化学发光（免疫诊断）和分子诊断中。 二、微流控的研究及产业化 微流控的理论研究兴起于20多年前，目前，理论研究准备已经非常成熟，在此，不再赘述。下面我们主要看看产业化之路 对比国内外商业化的微流控产品,国外在生化免疫、分子领域均有相对成熟的产品,其中不乏重磅级代表品种(雅培的i-STAT、Illumina的测序仪系列等);国内微流控产品的商业化相对落后,最早上市的微点生物mlabs系列等。 在产业化中，微流控一般分为以下几大类型：气压推动式微流控，离心力推动式微流控，液滴微流控，数字化微流控，纸质微流控等。 气压推动式微流控主要利用气压来推动流体在芯片中的运动，在微流控产业化中出现的最多，像生物梅里埃的filmarray, 罗氏诊断的cobas Liat PCR System，Atlas Genetics的io，博晖创新的HPV分子诊断全自动分析仪，华迈兴微的M2微型化学发光分析系统等等都是。 离心微流控是利用离心力来实现微流控芯片中的芯片的推动，在微流控产业中也占据着重要地位，比如美国爱贝斯（Abaxis）Piccolo Xpress?即时生化检测仪，天津微纳芯科技的pointcare M，杭州霆科生物的微流控芯片农残速测仪等等。
细胞外泌体提取方法
外泌体提取详细步骤及方法 1、差速离心 差速离心仍然是最常见的外泌体分离技术之一。该方法包括几个步骤，包括低速离心去除细胞和凋亡碎片；更高速离心以消除更大的囊泡；最后高速离心沉淀外泌体： 300×g离心10分钟，取上清。 2000×g离心10分钟，取上清。 10，000×g离心30分钟，取上清。100，000×g，在4℃下持续离心90分钟，去掉上清，留下的沉淀PBS重悬后，再次以100，000×g离心90分钟。 2、密度梯度离心 该方法将超速离心与蔗糖密度梯度相结合，实现外泌体与非囊泡颗粒分离，例如蛋白质和蛋白质/RNA聚集体。因此，该方法将囊泡与不同密度的颗粒分开，能够提取含量低的外泌体。但是，合适的离心时间非常重要，否则如果它们具有相似的密度，则仍可在外泌体中发现污染颗粒。 3、尺寸排阻色谱 尺寸排阻色谱（Size-exclusion chromatography，SEC）是基于大小而非分子量实现分离大分子。该技术应用填充多孔聚合物微球的柱子，分子根据其直径通过微球，半径小的分子需要更长的时间才能通过色谱柱的孔隙迁移，而大分子则从色谱柱中更早地洗脱。尺寸排阻色谱可以精确分离大小分子。此外，可以将不同的洗脱溶液应用于该方法。与离心方法相比，色谱分离已被证明具有更多优势，因为通过色谱分离的外泌体不受剪切力的影响，这可能会改变囊泡的结构。目前，SEC是一种广泛接受的分离血液和尿液中外泌体的技术。不过，该方法耗时较长，不适合大量样本处理。 4、过滤 超滤膜也可用于分离外泌体。根据外泌体的大小，从蛋白质和其他大分子中分离外泌体。最常见的过滤膜具有0.8μm、0.45μm或0.22μm的孔径，可用于收集大于800nm、400nm或200nm的外泌体，也有设计成微柱多孔硅纤毛结构以分离40-100nm外泌体：不过，该方法由于过滤膜的粘附，可能会损失外泌体，并且过滤时的压力和剪切力，可能会使外泌体变形受损。 5、基于聚合物的沉淀技术 基于聚合物的沉淀技术通常包括将样本与含聚合物的沉淀溶液混合，在4℃温育并低速离心。用于聚合物沉淀的最常见聚合物之一是聚乙二醇（PEG）。用
微流控技术
微流控技术及其应用 摘要：微流控技术广泛应用于生化分析、疾病诊断、微创外科手术、环境检测等领域。微通道结构设计与制造、微纳尺度流体的驱动与控制、微流控器件及系统的集成与封装是该领域的3大关键技术。本文综述了微流控技术在这3个方面的发展现状及在不同领域中的应用，展望了微流控技术的发展前景，指出多相微流体的介观传输理论及跨尺度流体的性质将是今后研究的重点与热点。 1、微流控技术简介： 微流控技术是指在至少有一维为微米甚至纳米尺度的低维通道结构中控制体积为皮升至纳升的流体进行流动并传质、传热的技术，可广泛应用于生化分析、免疫分析、微创外科手术、环境监测等众多领域。根据美国两院院士、哈佛大学乔治·怀特塞兹（George Whitesides）教授2006年刊登在国际顶级科学期刊《科学》上的文章中的定义，微流控（Microfluidics）是指针对极微量体积流体（10-9L~10-18L）进行操控的科学与技术。实现微流体操控的主要方法就是将流体限制在一个微米甚至纳米尺度的通道中，而这些通道的制作手段起源于制作微电子处理芯片的半导体工艺流程。最早提出微流控这个概念的是1990年在瑞士Ciba-Geigy公司做研究的Andreas Manz教授，他最初的设想是将微机电（MEMS）与分析化学相结合，从而做出一个类似芯片能将各种功能集成在一起的微型分析仪器。当时，这样的系统被称为微全分析系统，英文是Miniaturized totalanalysis systems，简称为MicroTAS或μTAS。1998年，微流控技术被评为世界十大科技进展之一，发展至今，微流控已经演变成一个十分独特的前沿科学领域。微流控技术还有另一个十分形象化的名字，芯片实验室（Labonachip），就好比将实验室里对样品的各种操作流程都集成在一块小芯片上。 2001年，英国皇家化学学会为此专门推出了《芯片实验室》（LabonChip）期刊，如今该期刊已经成为国际微流控领域的顶级期刊。 2、微流控技术应用 微流控芯片的显著特点：所需样品试剂量很小，分析速度快，易于阵列化从而能够实现高通量检测、系统集成化、微型化、自动化和便携式；在单细胞或单分子研究领域，微流控芯片有着明显的优势。此外，由于样品在微纳尺度下的特殊效应，使用微流控芯片也能够开展一些独特的前沿研究。其被用于航空航天、医学、农业、生物工程、材料加工、化工工业等众多领域。 2.1 生物医学领域的应用 微纳尺度下，流体间的传质、传热和反应过程高效、易控，主要是因为： 1)短程分子扩散有利于控制化学反应进程并且能够快速达到平衡状态； 2)相对较大的界面有利于促进界面反应； 3)反应发生时只需要少量热能，散热和加热过程都容易实现，能精确控制反应温度； 4)待分析的溶液或物质需求量极微小，可以节省贵重药品消耗或有毒物质的挥发。这些特点使微流控技术应用于萃取提纯口“、病毒及细胞或大分子的分离与检测以及疾病的快速诊断口方面具有显著的优势。 2.2层流微加工技术 层流微加工是利用微流体的层流特性，通过精确地控制化学反应试剂在微通道中的传输过程，在微通道中特定区域加工或合成化学物质的新型微加工技术。
外泌体提取方法总结
1、细胞培养上清：即在4℃下，首先300×g离心10 min，吸取 上清液，然后2 000×g离心10 min；吸取上清液后，10 000×g 高速离心30 min，吸取上清液；140000×g超速离心90 min；除去上清液，所获得的沉淀即为外泌体。用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬后，140 000×g 再次离心90 min，100 μL PBS缓冲液重悬沉淀，冻存于-80℃备用。 2、将小鼠或人血收集在1.5mL管中，并使其在37℃下凝结1小 时而不进行抗凝。此后，将其以2,000×g离心持续10分钟获得血清。接着将血清以3,000×g离心10分钟。将上清液以无菌PBS 以1：1的比例稀释并离心再次以10,000×g保持30分钟，然后以200,000×g进行2小时超速离心。将颗粒在a中洗涤大量PBS，通过0.2-μm注射器过滤器过滤，并以200,000×g离心1小时，然后收集沉淀并重悬于PBS或PBS中用于后期功能或生化测定的培养基。 3、 为了从体液（例如尿液，支气管肺泡灌洗液，血清，血浆，肿瘤腹水）中纯化外泌体，只需通过常规方法收集液体即可。血浆用紫色的管子，EDTA抗凝，血清的话不抗凝直接离心。在4°C下在玻璃瓶中储存长达5天，直至进行外泌体纯化。 外泌体纯化的原理与从组织培养条件培养基开始时的原理相同，但由于某些流体的粘度，必须稀释它们，并增加离心的速度和长度。该方案已在作者的实验室中用于从人血浆中纯化外泌体（Caby等，2005）。
基本方案1中指出的所有预处理也适用于该方案。材料液体（例如，血浆：通过Ficoll离心与血细胞分离;淋巴，血清，尿液，细支气管灌洗或肿瘤腹水）磷酸盐缓冲盐水（PBS;附录） 2A）冷冻离心机 50毫升聚丙烯离心管0.22微米过滤装置（如Steritop，Millipore）超速离心机和固定角度或摆动式转子（见表 3.22.1）适用于超速离心机转子的聚合物管或聚碳酸酯瓶（见表3.22） 0.1） 注意：所有离心均应在4℃下进行。 1.用等体积的PBS稀释液体。将稀释的液体转移到50毫升管中。在2,000×g，4℃下离心30分钟。 2.将上清液转移到超速离心管或瓶中，没有颗粒污染（参见基本方案1，步骤3注释）。在12,000×g，4℃下离心45分钟。 3.小心地将上清液转移到超速离心管或瓶中（根据处理的液体体积，可参见表3.22.1中的管）。在110,000×g，4℃下离心2小时。 4.将沉淀重悬于1ml PBS中，并将其在其中一个管中汇集。用PBS填充管以大量稀释再悬浮液。 5.通过0.22-μm过滤器过滤悬浮液，并收集在新鲜的超速离心管或瓶中。 6.在110,000×g，4℃下离心70分钟。倒出上清液。 7.将沉淀重悬于1ml PBS中，然后用PBS填充管。在110,000×g，4℃下离心70分钟。倒出上清液。 8.将沉淀重悬于50至200μlPBS中。在-80℃下储存长达1年。
外泌体捕获分离
外泌体，带来革命变革的小不点（三）——外泌体捕获分离 外泌体天然存在于体液中，在包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等体液中广泛分布，而且，所有培养的细胞类型均可分泌外泌体；但是，想要研究这个分布广泛的小不点可不是一件容易的事情，其中，最为困难的就是从体液或者细胞培养基中分离出高纯度的外泌体。今天，小优专题给您带来的就是外泌体研究的最关键步骤——外泌体捕获与分离这一部分的技术讲解与解决方案。 外泌体分离的传统方法为差速超速离心法和密度梯度超速离心法等，差速超速离心法是目前外泌体提取最常用的方法。简单来说是将细胞培养液或体液等样本依次在300 g、2 000 g、10 000 g离心去除细胞碎片和大分子蛋白质，最后100 000 g离心得到外泌体。此种方法得到的外泌体量多，但是纯度不足，电镜鉴定时发现外泌体聚集成块，质量不好，由于微泡和外泌体没有非常统一的鉴定标准，也有一些研究认为此种方法得到的是微泡不是外泌体。另一种常用的外泌体分离方法为密度梯度离心法，将样本和梯度材料一起超速离心，样品中的不同组分沉降到各自的等密度区，分为连续和不连续梯度离心法。用于密度梯度离心法的介质要求对细胞无毒，在高浓度时粘度不高且易将pH调至中性。实验中常用蔗糖密度梯度离心法，在离心法的基础上，预先将两种浓度蔗糖溶液(如2.5 M 和0.25 M)配成连续梯度体系置于超速离心管中，样本铺在蔗糖溶液上，100 000 g离心16 h，外泌体会沉降到等密度区(1.10~1.18 g/ml)。用此种方法分离到的外泌体纯度高，但是前期准备工作繁杂，耗时，产量少。而且，这两种传统方法都需要用到超速离心机，设备昂贵，耗时长，一次最多只能做6个样品，效率低，并且需要大量的样品才能得到足够多的外泌体。 接下来小优就为您带来优宁维为您提供的高效外泌体捕获与分离技术，帮您远离枯燥乏味的超速离心，快速高效制备高质量的外泌体。话不多说，亮技术，上产品：首先闪亮登场的是简单的一步法分离外泌体，实验原理如下图： 一步法分离外泌体原理示意图 该技术的优势有节省时间，小体积样本适用（可从100 μl血浆中分离出足量外泌体），无需超速离心和其他预富集方式，试剂方便储存于运输（4℃保存）等。 除了一步法分离外泌体的技术外，小优还为您提供免疫捕获法，包括免疫微球产品与免疫预制板产品。首先我们来看免疫微球捕获分离外泌体的技术原理：
一文解析微流控技术原理及起源
一文解析微流控技术原理及起源 微流控技术的起源微型化、集成化和智能化，是现代科技发展的一个重要趋势。伴随着微机电加工系统（MEMS ）技术的发展，电子计算机已由当年的”庞然大物”演变成由一个个微小的电路集成芯片组成的便携系统，甚至是一部微型的智能手机。MEMS技术全称Micro Electromechanical System ，MEMS设想是由诺贝尔物理学奖获得者Richard Feynman教授于1959年提出，其基本概念是用半导体技术，将现实生活中的机械系统微型化，形成微型电子机械系统，简称微机电系统。 1962年全球第一款微型压力传感器面世，这一创新产品后来被应用于汽车安全（轮胎压力检测）和医疗（有创血压计），开启了MEMS时代。今天MEMS技术在军事、航天航空，生物医药、工业交通及消费领域扮演核心技术的角色，智能手机中就嵌入了多个MEMS 芯片，如麦克风，加速度计，GPS定位等。 微流控技术原理微流控（microfluidics ）是一种精确控制和操控微尺度流体，以在微纳米尺度空间中对流体进行操控为主要特征的科学技术，具有将生物、化学等实验室的基本功能诸如样品制备、反应、分离和检测等缩微到一个几平方厘米芯片上的能力，其基本特征和最大优势是多种单元技术在整体可控的微小平台上灵活组合、规模集成。是一个涉及了工程学、物理学、化学、微加工和生物工程等领域的交叉学科。 微流控是系统的科学技术，它使用几十到几百微米尺度的管道，处理或操控很少量的（10*至10~18升，1立方毫米至1立方微米）流体。最初的微流控技术被用于分析。微流控为分析提供了许多有用的功能：使用非常少的样本和试剂做出高精度和高敏感度的分离和检测，费用低，分析时间短，分析设备的印记小。微流控既利用了它最明显的特征一一尺寸小，也利用了不太明显的微通道流体的特点，比如层流。它本质上提供了在空间和时间上集中控制分子的能力。 基于微流控芯片的代表性关键技术1、微流控分析芯片是新一代床旁诊断（Point of care
提取锂的方法总结
提取锂的方法总结 矿石提锂的方法主要有硫酸法、硫酸盐法、石灰烧结法、氯化焙烧法，纯碱压煮法等，现综述如下： （一）、硫酸法 硫酸法从锂辉石中提取碳酸锂是当前比较成熟的矿石提锂工艺，其工艺流程如图1-1所示。此方法先将天然锂辉石在950-1100℃焙烧，使其由单斜晶系的α-锂辉石转变成四方晶系的β-锂辉石，由于晶型转变，矿物的物理化学性质也随着晶体结构的变化而产生明显变化，化学活性增加,能与酸碱发生各种反应。然后将硫酸与β-锂辉石在250-300℃下焙烧，通过硫酸化焙烧发生置换反应，即可生成可溶性硫酸锂和不溶性脉石，反应方程式如下： β-Li2O·Al2O3·4SiO2+H2SO4=Li2SO4+H2O·Al2O3·4SiO2 以上即为硫酸法从锂辉石中提取碳酸锂的工艺原理。 由文献：田千秋，陈白珍，陈亚，马立文，石西昌.锂辉石硫酸焙烧及浸出工艺研究. 稀有金属，2011，35(1)：118-123.得到具体操作步骤如下： ①焙烧，称取一定质量的锂辉石放于回转窑中1000-1100℃焙烧30min； ②冷却磨细，将其磨细到200目以下； ③酸化焙烧，硫酸（93%-98%）用量为理论用量的140%，焙烧温度250℃，焙烧时间为30min； ④水浸，将酸化熟料用去离子水进行搅拌浸出，浸出最佳条件为：常
温反应15min，液固比为； ⑤分离，浸出结束后加入C aCO3迅速中和至pH 左右，使部分铁铝进入渣中，过滤得到浸出液；浸出液通过净化后即可用于碳酸锂的提取。 图1-1 （二）硫酸盐法 硫酸盐法是用硫酸钾与天然锂辉石烧结，使矿石中的锂转变为硫
酸锂，通过熟料溶出即可使锂从矿石中进入溶液。在处理锂辉石时，烧结过程中不仅伴随着α-锂辉石的晶型转变，同时也存在着离子交换反应。实际上，该反应是α-锂辉石先转换成结构较疏松且易于反应的β-锂辉石,然后发生离子交换反应的。在加热烧结过程中，总的化学反应是： α-Li2O·Al2O3·4SiO2+K2SO4=Li2SO4+K2O·Al2O3·4SiO2 该反应是可逆的，为了使反应更加充分地向右进行，在工艺上需加入过量的K2SO4，然而由于K2SO4价格贵，故常常采用以Na2SO4部分替代K2SO4。但如果全部用Na2SO4代替K2SO4，可能生成“锂辉石玻璃”严重影响后续浸出工序，所以只能以Na2SO4部分替代K2SO4。硫酸盐法不仅可以处理硅酸盐矿，而且也可以处理憐酸盐矿。 此方法的优点是它具有通用性，几乎能分解所有的含锂矿石。缺点是若不用Na2SO4替代部分K2SO4，即消耗大量的钾盐，最终导致生产成本较高、产品也常被钾污染。 由文献：张婉思，王远明，李擎.硫酸盐法从锂云母中制取碳酸锂的工艺路线研究. 化学世界，2010，34-36.得到具体操作步骤如下：①焙烧，焙烧阶段的优化条件为：温度940℃，时间120 min，配比 锂云母：K2SO4：Na2SO4：CaO=20：：:； ②浸出，第一步：水浸。将焙烧产物按液固比3：1溶于水中，搅拌 半小时，然后静置抽滤。对滤渣进行三级浸取，将滤液合并； 第二步：酸浸。由于水浸使得80%的Li、80%的Na、30%的钾进入溶液中，需要进一步酸浸，以提高Li的浸出率，浸出操作同上，
微流控技术的起源和展望
微流控技术的起源和展望 George M. Whitesides 摘要：微流控技术用在几十微米尺度的管道中操控流体。它已逐渐发展成为全新的领域，其影响延伸到化学合成、生物分析、光学、甚至信息技术。但是，微流控领域依然处在早期发展阶段。即使作为基础科学和技术示范，有些问题也必须得到解决：选择和关注最初的应用，制定循环发展的策略，也包括商业化。这些问题的解决还需要想象和创新。 什么是微流控？微流控是系统的科学技术，它使用几十到几百微米尺度的管道，处理或操控很少量的（10-9至10-18升，1立方毫米至l立方微米）流体。最初的微流控技术被用于分析。微流控为分析提供了许多有用的功能：使用非常少的样本和试剂做出高精度和高敏感度的分离和检测，费用低，分析时间短，分析设备的印记小[1]。微流控既利用了它最明显的特征——尺寸小，也利用了不太明显的微通道流体的特点，比如层流。它本质上提供了在空间和时间上集中控制分子的能力。 作为一项技术，微流控似乎好的不真实：至少在分析领域的主要应用中，它表现出太多的优点和太少的缺点。但是微流控还没有发展成为广泛使用的技术。为什么呢？为什么不是每个生物化学实验室都贴上“芯片实验室”的标签呢？为什么不是每个病人都用微流控家用检测系统监测自己的病情呢？答案还不明确。微流控的优势令人信服难以错过，我相信微流控技术将成为分子分析的主流方式，也许分子合成也是这样。话虽如此，微流控发展成为一项主流的新技术还需要时间和大环境的支持，这个问题的解答不仅对微流控领域是重要的，对那些正在努力去争取成功的新技术也同样重要。 微流控技术从四个领域发展而来：分子分析、生物防御、分子生物学和微电子学。首先来看分子分析。微流控技术最早起源于微量分析方法——气相色谱法，高压液相色谱法，以及用毛细管形式彻底革新了化学分析的毛细电泳法。这些方
外泌体的生物特点及在肿瘤诊断中的应用
外泌体的生物特性及在肿瘤临床诊断中的应用 陈利鹏 摘要：外泌体是生物体内广泛存在的由各类细胞释放的囊泡小体，被磷脂双分子层包裹。 里面含有蛋白和RNA等多种成分，在细胞间信息传递中扮演重要角色。具有抗肿瘤免疫、促血管新生等生理功能。在肿瘤的发生发展中起着重要的作用，特别是有携带肿瘤遗传信息、调节肿瘤微环境、促进肿瘤血管生成等效应。越来越多的研究将目光投向了利用外泌体进行疾病的诊断、预后及治疗临床应用。本文就其研究现状和在肿瘤临床诊断中的应用做简要综述。 关键词：外泌体，肿瘤，诊断，临床应用 1 外泌体简介 外泌体（exosome）是细胞向外分泌的一种囊状小泡，直径大约40-140 nm。具有脂质双层膜结构[1]。Johnstone在网织红细胞培养液中分离得到一种囊泡状的结构物质，并将其命名为外泌体（exosome）[2]。但当时研究人员认为它只是一种细胞的废弃物。 最近几年研究发现，外泌体广泛存在并分布于各种体液中，携带和传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生和进程密切相关。2013年，诺贝尔生理或医学奖颁发给了外泌体领域的三位科学家，使得外泌体成为医学领域研究的热点。目前外泌体研究主要集中在细胞通讯介导细胞行为、生物标志物筛选、药物载体研发三大方向[3]。 1.1外泌体的形成 真核细胞和原核细胞都能分泌细胞外小囊泡（extracellular vesicles，EVs）。在哺乳动物中，血液、淋巴液、组织液、尿液都能分离到EVs[4]。细胞向外分泌的膜性小囊泡有多种，包括微泡（microvesicle）、凋亡小体和外泌体。微泡是细胞胞体直接出芽，脱落后形成的细胞外囊泡，直径约50-1000 nm。凋亡小体则是细胞凋亡时产生的囊泡，一般直径在500-2000 nm。外泌体是通过细胞内体途径生成，首先是细胞内内溶酶体微粒体内陷，形成多囊泡小体（multi-vesicle body ，MVBs），在刺激作用下，多囊泡小体与细胞膜融合，然后将小体内的囊泡释放到细胞外，即为外泌体。外泌体大小均一，直径一般在40-140 nm[5]。
干细胞源外泌体在治疗心肌梗死中的作用机制研究进展_李玲
综 述 干细胞源外泌体在治疗心肌梗死中的作用机制 研究进展 李 玲综述，石 蓓审校 ［摘要］干细胞移植为心肌梗死后受损心肌的修复带来曙光， 然而移植的干细胞群在缺血缺氧环境中的存活率、有效性及相关作用机制仍备受争议。近年来，干细胞旁分泌效应对心肌细胞的保护作用逐渐受到重视。外泌体作为干细胞旁分泌效应的典型代表，是在不同应激反应中所产生的直径介于30 100nm 的膜状小体，富含大量与其母体干细胞相关的miＲNA ，mＲNA 及蛋白质，作为一种新型替代疗法在治疗心血管疾病中具备巨大潜力。不同干细胞来源的外泌体可通过促进受体细胞存活、增殖及血管生成等多种方式改善心梗后心脏功能。文中主要针对不同干细胞来源的外泌体在心肌梗死后通过促进心肌细胞存活、增殖及新生血管形成；抑制炎症反应及心脏纤维化等方式修复受损心肌的潜在机制进行综述。 ［关键词］外泌体；干细胞移植；心肌梗死；microＲNA ［中图分类号］Ｒ542．2 ［文献标志码］A ［文章编号］1008-8199（2016）09-0987-06［DOI ］10．16571/j．cnki．1008-8199．2016．09．021 基金项目：国家自然科学基金（81560041） 作者单位：563003遵义，遵义医学院附属医院心血管内科［李 玲 （医学硕士研究生）、石 蓓］ 通讯作者：石 蓓， E －mail ：shibei2147@163．com Advances in Ｒesearch on Stem cell-derived exosomes in Ischemic heart disease LI Ling reviewing ，SHI Bei checking （Deparment of Cardiology ，the First Affiliated Hospital ，Zunyi Medical College ，Zunyi 563003，Guizhou ，China ） ［Abstract ］Stem cell therapy provides immense hope for restoring the impaired cardiomyocytes．However ，it has been debated on the effectiveness ，mechanisms ，and survival of the donated cell population in the ischemic myocardial milieu．Protective paracrine effect of stem cells on cardiomyocytes gradually arose great attentions．Exosomes ，as typical representative of paracrine effect of stem cells ，are 30－100nm in size and tiny microvesicles released by cells in response to different physiological states ，and enriched in pro-teins ，messenger ＲNAs ，and miＲs characteristic of parental stem cells ，represent great potential for treating cardiovascular diseases．Ｒecent studies show that exosomes from different kinds of stem cells can effectively promote cardiac function by means of promoting the donated cell survival ，proliferation and angiogenesis in the ischemia heart．The aim of this review is to summarize current research ef-forts on exosomes from different kinds of stem cells ，including their potential mechanism to develop a potentially viable therapy for the treatment of impaired cardiomyocytes via promoting cardiomyocytes survival ，proliferation and angiogenesis ；inhibiting inflammatory re-sponse and cardiac fibrosis after myocardial infarction． ［Key words ］Exosomes ；Stem cell tansplantion ；Myocardial infarction ；microＲNA 0引言 冠状动脉疾病是最常见的心血管病症，其中，心肌梗死的发病率和死亡率位居全球首位。目前，干细胞移植治疗心肌梗死被认为是修复受损心肌，促进心肌细胞再生最具前景的方法 ［1］ 。胚胎干细 胞、诱导多能干细胞、骨髓源干细胞/祖细胞（如间 充质干细胞、内皮祖细胞、单个核细胞、CD34+ 细胞、CD133+细胞）和心脏干细胞等均具备向心脏系细胞分化的潜能。其中， c-kit +心脏干细胞（cardiac stem cells ，CSCs ）因其具有与心脏细胞相似的遗传背景；
微流控光学及其应用_梁忠诚
微流控光学及其应用 ＯｐｔｏｆｌｕｉｄｉｃｓａｎｄＩｔｓＰｏｔｅｎｔｉａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ 梁忠诚赵瑞 （南京邮电大学微流控光学技术研究中心，江苏南京２１０００３） ＬｉａｎｇＺｈｏｎｇｃｈｅｎｇＺｈａｏＲｕｉ （ＣｅｎｔｅｒｏｆＯｐｔｏｆｌｕｉｄｉｃＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＮａｎｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｏｓｔｓ＆Ｔｅｌｅｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，ＮａｎｊｉｎｇＪｉａｎｇｓｕ２１０００３，Ｃｈｉｎａ） １引言 采用液体作为光学器件结构元素的概念可以追溯到１８世纪，那时人们曾将旋转汞池产生的球面反射镜用于天文观察［１］，至今液体材料光学器件在光学技术中仍占有一席之地，例如油浸透镜、液晶显示等。但是，由于液体材料外型不定，难以操控，传统光学系统主要采用玻璃、金属和半导体等固体材料。随着光学技术的蓬勃发展，光学器件的微型化、集成化、可调化已成为光技术的重要发展方向，这时固态器件体积大、成本高、可调性差等问题日显突出，液体光学器件重又引起了研究者的兴趣［２］。现今，随着微流控光学（ｏｐｔｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）这一新学科的诞生和新技术的发展，流体器件将会在未来的光学技术领域扮演更加重要的角色。 微流控光学是现代光学、光电子学与微流控技术相结合而形成的新型交叉前沿学科与技术［３］。不同于２０世纪６０年代的射流技术（ｆｌｕｉｄｉｃｓ）以宏观机械控制为目标，微流控技术（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）意图实现微量化学或生物样品的合成与分析［４］，而微流控光学技术则是在微观尺度上通过操控流体达到调节系统的光学 摘要微流控光学（ｏｐｔｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）通过融合微流控学和光学、光电子学技术合成新颖的功能器件和系统，微流控光学系统的主要特点在于结构的可调化、功能的集成化和系统的微型化。结构可调性为自适应光学提供 了新的技术途径，光学检测与微流分析功能的集成将促进微型全分析系统技术的应用和发展，光学与微 流控技术的融合则为传统光学器件的可调化和微型化提供了可能。介绍微流控光学这一前沿交叉学科 的基本概念和应用前景。叙述了微流控自适应光学、微流控光学检测、微流控激光器以及微流控光学集 成器件的近期研究成果和应用前景。 关键词微流控光学；微流控技术；自适应光学；微型激光器；光学集成器件 ＡｂｓｔｒａｃｔＯｐｔｏｆｌｕｉｄｉｃｓｉｓａｎｅｗｆｒｏｎｔｉｅｒａｎｄｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙｆｉｅｌｄｗｈｉｃｈｄｅｖｅｌｏｐｓｄｅｖｉｃｅｓａｎｄｓｙｓｔｅｍｓｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｆｕｓｉｏｎｏｆｏｐｔｉｃｓ，ｏｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓａｎｄｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ．Ｔｈｅｒｅｃｏｎｆｉｇｕｒａｂｉｌｉｔｙ，ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎａｎｄ ｍｉｎａｔｕｒｉｚａｔｉｏｎａｒｅｔｈｒｅｅｍａｊｏｒａｄｖａｎｔａｇｅｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｏｐｔｏｆｌｕｉｄｉｃｓｙｓｔｅｍｓ．Ｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｒｅｃｏｎｆｉｇｕｒａｂｉｌｉｔｙｐｒｏｖｉｄｅｓａｎｅｗｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｏｌｕｔｉｏｎｔｏａｄａｐｔｉｖｅｏｐｔｉｃｓ．Ｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｏｆ ｏｐｔｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃａｎａｌｙｓｉｓｐｒｏｍｏｔｅｓｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｍｉｃｒｏｔｏｔａｌａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍ （ＭＴＡＳ）．Ｔｈｅｆｕｓｉｏｎｏｆｏｐｔｉｃｓａｎｄｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓｐｒｏｖｉｄｅｓｔｈｅｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙｏｆｍｉｎｉａｔｕｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｏｐｔｉｃａｌｄｅｖｉｃｅｓ．Ｔｈｅｂａｓｉｃｃｏｎｃｅｐｔａｎｄｓｏｍｅｐｏｔｅｎｔｉａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｏｐｔｏｆｌｕｉｄｉｃｓａｒｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ．Ｔｈｅｒｅｃｅｎｔｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｏｐｔｏｆｌｕｉｄｉｃｓａｒｅｄｅｓｃｒｉｂｅｄｉｎｔｈｅｃａｔｅｇｏｒｉｅｓｏｆ ａｄａｐｔｉｖｅｏｐｔｉｃｓ，ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｍｉｃｒｏ－ｌａｓｅｒａｎｄｏｐｔｉｃａｌｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｄｅｖｉｃｅｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓｏｐｔｏｆｌｕｉｄｉｃｓ；ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ；ａｄａｐｔｉｖｅｏｐｔｉｃｓ；ｍｉｃｒｏ－ｌａｓｅｒ；ｏｐｔｉｃａｌｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｄｅｖｉｃｅ 中图分类号ＴＮ２；Ｏ４３
如何分离纯化、鉴定外泌体(借鉴材料)
如何分离纯化、鉴定外泌体 外泌体相关研究逐渐从小众走向大众，受到越来越多的关注，涌现了一大批的外泌体课题。但大家还是感觉外泌体研究好难啊！为什么呢？首要原因就在于该领域里还木有统一的、简单可行且纯度很高的分离方法。今天就来给大家聊一聊如何搞定外泌体研究中的第一步。 一、分离 超速离心法: 超速离心法是外泌体分离最常见的技术之一。据不完全统计，约有1/2的研究者会选择该种方式分离外泌体。该方法由几个离心步骤组成，可分步去除细胞、细胞碎片和大囊泡，沉淀外泌体（如图所示）。但该种方法用于血浆和血清等粘性生物液体时效率较低，且重复离心操作有可能对外泌体造成损害，从而降低其质量。 如将超速离心配合蔗糖溶液进行梯度密度离心可得到纯度更高的外泌体，是公认可以得到最高纯度的分离方法。但此法对离心时间非常敏感，一般需要8-30h，产率较低，同样不适用于血浆和血清等粘性生物液体中外泌体的分离，因此难以广泛普及。 聚合物沉淀法: 第二大主流的外泌体分离技术就是基于聚合物的沉淀法了，最常见的聚合物是聚乙二醇（PEG）。通常将含有聚合物的沉淀溶液与生物体液混合，4℃温育，低速离心，沉淀外泌体（如图所示）。目前已有成熟的PEG-base商业试剂盒，比如图中的ExoQuick?（System Biosciences）。这类试剂盒使用容易和快速，不需要额外的设备，且随着产品不断更新换代，提取效率和纯化效果逐渐提高，因而逐渐取代超速离心法并推广开来。沉淀法的主要缺点是分离物中会有少量的聚合物存在。不过大家不用担心，一般来说这些物质不会干扰下游分析，使用商业试剂盒提取外泌体也受到越来越多杂志的认可。
二、鉴定 外泌体的鉴定是继分离后又一个困扰研究者的问题。如果大家看过外泌体研究相关的文献，就肯定对一张图印象深刻。 不错，想发外泌体文章，光找到高效率的分离方法还不够，要过的第二关就是证明你分离得到的就是外泌体。鉴定方式不外乎就是下面这三种：1. 形态学（电镜）；2. 粒子大小（径粒分析）；以及3. 标志蛋白（WB）。综合来说，透射电镜可以清楚的看到外泌体的大小、形态等，属于鉴定方法中的金标准，其他两种方式则常常作为辅助使用。
基于微流控技术的功能型量子点的合成及应用
目录 摘要 ABSTRACT 目录 第一章绪论 (1) 1.1微流控芯片的简介 (1) 1.2微流控芯片的国内外研究进展概述 (1) 1.3微流控芯片在纳米合成上的应用研究发展现状 (2) 1.4量子点纳米材料简介 (8) 1.5量子点在生物光子学中的应用 (11) 1.5.1 与生物分子连接 (11) 1.5.2 量子点生物标记应用 (13) 1.5.3 量子点生物成像应用 (14) 1.5.4 在免疫学中的应用 (15) 1.5.5 其他应用 (15) 1.5.6 前景展望 (16) 第二章量子点的相关理论 (18) 2.1量子点的常用制备方法 (18) 2.1.1 有机相合成 (18) 2.1.2 水相合成 (18) 2.2微流控制备量子点方法的相关理论 (19) 2.3量子点的表征 (21) 2.3.1 透射电子显微镜 (21) 2.3.2 吸收光谱 (22) 2.3.3 荧光光谱 (22) 2.3.4动态光散射粒径分析 (23) 2.4量子点物化特性 (23) 2.4.1量子点的物理效应 (23) 2.4.2量子点的光学特性 (25) 2.4.3量子点的发光原理 (26) 2.4.4量子点的能级结构 (27) 第三章应用于量子点合成的微流控芯片的设计与制作 (29) 3.1引言 (29) 3.2微流控芯片的制作技术概述 (29) 3.2.1 微流控芯片的结构及特点介绍 (29) 3.2.2 微流控芯片的材料选取 (30) 3.2.3微流控芯片的成型方法 (31) 3.3微流控芯片的模拟仿真理论概述 (32) 3.4应用于合成量子点的微流控芯片的制作 (35) I
外泌体对组织修复的作用及其机制研究
目录 中文摘要.......................................................................................V ABSTRACT.................................................................................VII 缩略词表.......................................................................................IX 第一章绪论 (1) 第二章SMSC-Exos预防骨坏死的作用及机制研究 (4) 2.1 前言 (4) 2.2 材料和方法 (5) 2.2.1 实验动物 (5) 2.2.2 主要试剂 (5) 2.2.3 主要实验溶液配制 (7) 2.2.4 主要实验仪器 (7) 2.2.5 SMSCs和BMSCs的分离培养和鉴定 (8) 2.2.5.1 SMSCs的分离培养 2.2.5.2 BMSCs的分离培养 2.2.5.3 SMSCs的鉴定 2.2.6 SMSC-Exos的提取和鉴定 (11) 2.2.6.1 SMSC-Exos的提取 2.2.6.2 SMSC-Exos的形态学鉴定 2.2.6.3 SMSC-Exos的粒径分布测定 2.2.6.4 SMSC-Exos的表面标志物鉴定 2.2.7 体外实验 (14) 2.2.7.1 BMSCs摄取外泌体实验 2.2.7.2 细胞增殖实验 2.2.7.3 细胞凋亡Annexin V 实验 2.2.8 骨坏死动物实验 (16) 2.2.8.1 实验动物模型制作和动物实验分组 2.2.8.2 实验动物的一般行为学观察 2.2.8.3 MicroCT观察
微流控技术在人体器官芯片的应用(上篇)
微流控技术在人体器官芯片的应用是一个比较前沿的的研究领域，上篇主要谈药物研发过程和面临的困难，微流控技术特点和人体芯片的基本概念，下篇主要聊人体芯片目前的研究成果。 药物研发的历史 人在一生中不可避免会生病。有些疾病不需要干涉便会自我恢复，而有些疾病则必须通过外界的治疗达到缓解或痊愈的目的。在各类外界治疗的手段中，服用药物进行治疗是最常见的一种。 使用药物的历史可以追溯到千年前人类早期的文明中。在那个时候，药物不单单是用来治病，更多的则是被宗教或部落用来进行心理上的治愈。这些药物的成分通常来自于植物。 由于当时缺少科学的研发步骤，药物的效用需要通过不停的试错和观察人和动物服用后的反应来决定。典型的例子就是我们熟知的，神农氏尝百草后写出的《神农本草经》。尽管在不同文化中传统药物具有很长的历史和很高的流传度，但这些药物很难被大规模开发出来，而且其真正的医疗价值尚值得商榷。 到了十九世纪末期，随着科学技术的提升，药物的发明开始从依靠口口相传的经验走向基于科学技术系统地研发。 第一次世界大战结束后，现代的制药产业开始形成，以规范的科学研究为指导进行的药物研发最终获得了广泛共识。 现代的药物研发过程 今天，每一款药物从实验室到用户手中都要经历长达数年之久且耗资巨大的研发过程。 一个标准的研发过程包括三个阶段： 基础研究（Basic Research & Drug Discovery）
临床前期试验（Preclinical Trials） 临床试验（Clinical Trials）。 基础研究包括对疾病和症状的研究，选择治疗目标和选择最优治疗方案。新药的研发成功与否取决于我们对目标疾病的了解程度。在具备了一定的背景知识后，实验人员会根据疾病的发生原理选择一个治疗目标（Drug target）。药物会和治疗目标发生反应，产生治疗效果。通常，研究人员会在体外细胞、组织或者动物身上进行研究，选择出最有希望的治疗目标进行下一步测试。在得到治疗目标之后，研究人员会使用不同的方式进行高通量的药物测试及筛选，选择出有潜力的候选药物。 临床前期试验是承前启后的一个阶段。其试验结果可以决定一款候选药物是否有价值进入之后的临床试验（概率为五千分之一）。 为了尽可能预测药物在人体内的各项指标，研究人员通常使用两种模型来模拟人体内的环境： 一）生物体模型，动物活体比如小白鼠； 二）生物体外模型，培养在玻璃试管中的活细胞。 一般来说，两种模型都会被使用。为了确保药物在人体实验中的安全性，药监局对临床前期试验这一步骤的要求是最严格的。研究人员需在此步骤评估和预测药物在人体中的多项指标，包括药物效应动力学（既药物对人体的作用），药物代谢动力学（既人体对药物的反作用）和毒性（包括短期和长期）。预测的结果可以帮助研究人员决定临床测试时使用的药物剂量。 临床试验是新药得到药监局批准前的最后一步，也是最艰难且最昂贵的一步（成功率为百分之五）。 临床试验分为三期，分别在不同类别和数量的人群中测试：
大鼠血清外泌体不同提取方法的比较
广东化工 https://www.360docs.net/doc/0a7810262.html, 2019年第2期第46卷总第388期 -23 - 大鼠血清外泌体不同提取方法的比较 罗哲斯，钟成勇，秦转，李艳文，毛建文* *［收稿日期］2018-11-28 ［基金项目］广东省高等学校“千百十工程”人才培养项目(2015cxqx214) ［作者简介］罗哲斯(1992-),女，广东清远人，硕士研究生，主要研究方向为分子药理学。 *为通讯作者：毛建文，男，湖南人，博士，教授，主要从事离子通道蛋白与疾病及外泌体功能的研究。 (广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东广州510006) ［摘 要］目的：比较大鼠血清外泌体的不同提取方法，优化PEG 聚沉法。方法：分别采用差速超速离心法、试剂盒法、PEG 聚沉法及优化 后的PEG 聚沉法提取分离血清外泌体。通过Western Blotting 检测外泌体标记蛋白：透射电镜观察形态。结果：Western Blotting 检测出外泌体 的标记蛋白：电镜下观察到差速超速离心法和优化后的PEG 聚沉法提取的外泌体粒径在100 nm 左右，呈双层膜结构，试剂盒法和PEG 聚沉法 提取的外泌体形态大小不一，杂质偏多。结论：优化后的PEG 聚沉法能成功提取血清外泌体，此方法操作简便、耗时短、成本低，是可靠且有 效的外泌体提取方法。 ［关键词］血清；外泌体；PEG ；差速超速离心；试剂盒［中图分类号］TQ ［文献标识码］A ［文章编号］1007-1865(2019)02-0023-02 Comparison and Optimization of Different Methods for the Extraction of Rat Serum-derived Exosomes Luo Zhesi, Zhong Chengyong, Qin Zhuan, Li Yanwen, Mao Jianwen * (School of Life Sciences and Biopharmaceuticals, GuangdongPharmaceuticalUniversity, Guangzhou 510006, China) Abstract: Objective: To compare different extraction methods of rat serum-derived exosomes and optimize PEG coagulation to obtain more efficient and practical extraction techniques. Methods: Serum exosomes were extracted and separated by differential ultracentrifugation method, kit method, PEG coagulation method and optimized PEG coagulation method. The exosomal marker proteins were detected by Western blotting; the morphology was observed by transmission electron microscope.Results: The expression of exosome labeled protein HSP70, CD63 and TSG101 in exosomes protein obtained by all four extraction methods could detected by Western blotting. The exosomes extracted by differential ultracentrifugation method and optimized PEG coagulation method show a particle size of about 100 nm and a double-layer membrane structure under transmission electron microscope. The exosomes extracted by the kit method and PEG coagulation method were impurities and not uniform in size. Conclusion: The optimized PEG coagulation method was successfully used to extract and separate rat serum-derived exosomes. Compared with the existing methods, this method has the advantages of easy operation, short time-consuming, low-cost and effective. Keywords: Serum ； exosomes ； PEG ； differential ultracentrifugation ； Exo Quick 1前言 外泌体是指包含了多种mRNA 、miRNA 和蛋白质的微小囊 泡，直径在30?150nm 之间，呈茶托形或一侧凹陷的半球形结构。 1987年，Johnstone 将其命名为"exosome"⑴。其主要来源于细 胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜 融合后释放到胞外基质中［2】。Tucci M 等人研究发现，转移性黑素 瘤患者的血清中能提取到黑色素瘤细胞分泌的外泌体，并检测岀 所患转移性黑色素瘤是否对化疗药物敏感⑶。与此类似,Repiska G 等人发现，从孕妇血清中提取的外泌体能检测到胎儿的DNA 【4】。 由此可见，血清外泌体能够参与到病理生理过程中。 目前我们对血清外泌体的研究尚处于初级阶段，要想实现最 终的临床上的指导应用，还有许多亟待解决的难题。其中，从成 分复杂的血清中获得结构完整，形态大小均一，并保留其生物学 特性的外泌体，是目前的一个重难点⑸。现阶段外泌体的提取方 法主要有：超速离心法、密度梯度离心法、色谱法、过滤离心和 试剂盒提取法等。本文就将差速超速离心法、试剂盒法、PEG 聚 沉法和优化后的PEG 聚沉法用于血清外泌体的提取并进行比较， 期望获得简便快捷和性价比高的提取方式。 2实验材料与方法 2.1试剂及仪器 PEG 6000(E125BA0029)购自生工生物工程股份有限公司； Total Exosome Isolation (00520032)购自 Invitrogen 公司；CD63 抗 体(BA1584)和TSG101抗体(PB0550)购自武汉博士德生物工程有 限公司，HSP70抗体(AH728)购自上海碧云天生物技术有限公司； L-100XP 低温超速离心机购自美国Beckman 公司；透射电镜 (H7650)购自日本Hitachi 公司。2.2实验方法 2.2.1差速超速离心法提取外泌体 取1 mL 大鼠血清，加入19 mL PBS, 300 g, 4 °C 离心10 min 。 取上清转移到新的离心管中，2000 g, 4 °C 离心10 mine 取上清 转移至新的离心管，10000 g, 4 °C 离心30 min ；取上清置于超离 管中，100000 g, 4 °C 离心70 min,去上清，加入20 mL PBS 重 悬，100000 g, 4 °C 离心70 min,底部沉淀即外泌体。2.2.2试剂盒法提取外泌体 按照Total Exosome Isolation (00520032)试剂盒说明书进行提 取。 2.2.3 PEG 聚沉法提取外泌体 16 g PEG 6000+5.844 g NaCl+100 mL 超纯水配制成 8%PEG 6000(2X)溶液；10 g PEG 6000+5.844 g NaCl+100 mL 痼纯水配制 成 5%PEG6000(2X)溶液。 取ImL 大鼠血清,2000g,4 °C 离心30 min 。取上清于1.5 mL 离心管，按1 ： 1的比例，在血清中加入8%PEG6000(2X), 4 °C 静置孵育30 min 后，10000 g, 4 °C 离心1 h 。去除上清，用PBS 重悬后加入5%PEG6000(2X), 4匸静置孵育30 min 后，10000 g, 4 °C 离心1 h,底部沉淀即外泌体。 2.2.4 PEG 聚沉法经超速离心法优化提取外泌体 取1 mL 大鼠血清，2000 g,4 °C 离心30 min 。取上清于1.5 mL 离心管，按1 ： 1的比例，在血清中加入8%PEG6000(2X), 4 °C 静置孵育30 min 后，10000 g, 4 °C 离心1 h 。去除上清，用20 mL PBS 重悬，100000 g, 4 °C 离心70 min,底部沉淀即外泌体。 2.2.5提取外泌体总蛋白及免疫印迹 裂解上述外泌体并提取其总蛋白，以等样蛋白浓度跑10%丙 烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后转移至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭 2 h, 4 °C 孵育HSP70、CD63和TSG101 —抗过夜，加入相应二 抗室温孵育lh 后，于蛋白成像系统中进行曝光成像，拍摄图片。 2.2.6形态学分析 取上述外泌体于铜网上，负染后在透射电镜下观察其形态。 3结果 3.1外泌体标记蛋白HSP70、CD63、TSG101表达的检测 差速超速离心法、试剂盒法、PEG 聚沉法、经超速离心法优 化的PEG 聚沉法所提的外泌体中均检测到外泌体标记蛋白 HSP70、CD63和TSG101的表达，四种方法没有明显差别，见图 lo