血清中外泌体的提取方法
(完整版)外泌体提取方法总结
1、细胞培养上清：即在4℃下，首先300×g离心10 min，吸取上清液，然后2 000×g离心10 min；吸取上清液后，10 000×g 高速离心30 min，吸取上清液；140000×g超速离心90 min；除去上清液，所获得的沉淀即为外泌体。
用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬后，140 000×g 再次离心90 min，100 μL PBS缓冲液重悬沉淀，冻存于-80℃备用。
2、将小鼠或人血收集在1.5mL管中，并使其在37℃下凝结1小时而不进行抗凝。
此后，将其以2,000×g离心持续10分钟获得血清。
接着将血清以3,000×g离心10分钟。
将上清液以无菌PBS 以1：1的比例稀释并离心再次以10,000×g保持30分钟，然后以200,000×g进行2小时超速离心。
将颗粒在a中洗涤大量PBS，通过0.2-μm注射器过滤器过滤，并以200,000×g离心1小时，然后收集沉淀并重悬于PBS或PBS中用于后期功能或生化测定的培养基。
3、为了从体液（例如尿液，支气管肺泡灌洗液，血清，血浆，肿瘤腹水）中纯化外泌体，只需通过常规方法收集液体即可。
血浆用紫色的管子，EDTA抗凝，血清的话不抗凝直接离心。
在4°C下在玻璃瓶中储存长达5天，直至进行外泌体纯化。
外泌体纯化的原理与从组织培养条件培养基开始时的原理相同，但由于某些流体的粘度，必须稀释它们，并增加离心的速度和长度。
该方案已在作者的实验室中用于从人血浆中纯化外泌体（Caby等，2005）。
基本方案1中指出的所有预处理也适用于该方案。
材料液体（例如，血浆：通过Ficoll离心与血细胞分离;淋巴，血清，尿液，细支气管灌洗或肿瘤腹水）磷酸盐缓冲盐水（PBS;附录） 2A）冷冻离心机50毫升聚丙烯离心管0.22微米过滤装置（如Steritop，Millipore）超速离心机和固定角度或摆动式转子（见表3.22.1）适用于超速离心机转子的聚合物管或聚碳酸酯瓶（见表3.22） 0.1）注意：所有离心均应在4℃下进行。
外泌体提取步骤
外泌体提取步骤外泌体提取是一种从细胞外分泌物中分离和纯化外泌体的方法，它可以帮助研究人员获取纯净的外泌体样品，并对其进行进一步的分析和研究。
本文将介绍外泌体提取的步骤。
1. 细胞培养需要选择感兴趣的细胞系进行培养。
将细胞种植在培养皿中，并提供适当的培养基和条件，使细胞能够正常生长和分裂。
2. 收集细胞上清液当细胞生长到一定程度时，收集细胞上清液。
将培养皿中的培养基转移至离心管中，并使用低速离心（约300-500×g）离心10-20分钟，以去除细胞和细胞碎片。
3. 高速离心将离心后的上清液转移到新的离心管中，并使用高速离心（约10,000-20,000×g）离心30-60分钟，以沉淀外泌体。
4. 洗涤外泌体将外泌体沉淀用冷PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤，以去除杂质和未结合的蛋白质。
洗涤过程中可以进行多次离心和上清液的去除。
5. 再次离心将洗涤后的外泌体沉淀用PBS再次离心，以获得更纯净的外泌体样品。
6. 纯化外泌体为了进一步提高外泌体的纯度，可以使用浓缩、超滤等方法对外泌体进行纯化处理。
这些方法可以去除残余的蛋白质和其他杂质，提高外泌体的纯度和浓度。
7. 确认外泌体使用电子显微镜观察外泌体的形态和结构，确认提取到的颗粒为外泌体。
此外，还可以使用Western blot、质谱等技术对外泌体进行进一步的鉴定和验证。
8. 外泌体的应用提取到的外泌体可以用于进一步的研究和应用。
外泌体中包含了丰富的蛋白质、核酸、脂质等生物分子，可以用于疾病诊断、药物传递、基因治疗等领域。
总结：外泌体提取是一种重要的实验操作，可以帮助研究人员获取纯净的外泌体样品。
通过细胞培养、离心、洗涤和纯化等步骤，可以从细胞上清液中分离和纯化外泌体。
外泌体提取的纯度和质量对于后续的研究和应用至关重要。
外泌体的提取和研究有望在生物医学研究中发挥重要作用，为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。
一种分离和纯化外泌体的方法
一种分离和纯化外泌体的方法分离和纯化外泌体是一项重要的生物学技术，用于从生物样本中获取纯净的外泌体颗粒。
外泌体是一类小型细胞分泌泡，内含有丰富的生物活性分子，如蛋白质、核酸和脂质。
它们在细胞间传递信号、调节细胞功能以及参与疾病的发生和发展过程中起着重要的作用。
因此，研究外泌体对于了解细胞通讯机制和疾病生理过程具有重要意义。
常用的外泌体分离和纯化方法包括超速离心、滤膜法、密度梯度离心、免疫亲和法和尺寸排除层析法等。
下面将逐一介绍这些方法的原理和步骤。
超速离心法是最常用的外泌体分离方法之一。
首先，将细胞培养液或生物体液进行低速离心，去除细胞碎片和大颗粒物质。
然后，将上清液进行高速离心，使外泌体沉淀于离心管底部。
最后，将上清液弃去，用适当缓冲液悬浮沉淀物，即可获得外泌体。
滤膜法是一种简单而高效的外泌体分离方法。
将细胞培养液或生物体液通过一系列孔径大小不同的滤膜，通过筛选的方式分离外泌体颗粒。
常用的滤膜孔径为0.1-0.8微米，可以选择不同孔径的滤膜进行连续过滤，以获得更纯净的外泌体。
密度梯度离心法基于外泌体与溶液密度不同的原理进行分离。
首先，制备一系列密度逐渐增大的梯度离心液。
然后，将细胞培养液或生物体液加入离心管中，通过离心使外泌体在不同密度梯度处分层。
最后，根据外泌体沉淀的位置，分离出目标外泌体。
免疫亲和法利用外泌体表面特定分子与抗体的特异性结合进行分离。
首先，将细胞培养液或生物体液与特定抗体结合，形成免疫复合物。
然后，使用磁珠或琼脂糖等材料将免疫复合物捕获，再通过磁力或离心将目标外泌体分离出来。
尺寸排除层析法是一种基于外泌体颗粒尺寸差异的分离方法。
将细胞培养液或生物体液通过一列具有特定孔径的柱子，较大的细胞碎片和颗粒物质会被柱子内部的填料所阻挡，而较小的外泌体则能够通过填料，被分离出来。
在进行外泌体分离和纯化的过程中，为了提高纯度和产量，常常需要采用多种方法的组合。
例如，可以先利用超速离心法去除大颗粒物质，然后再使用滤膜法或密度梯度离心法进一步纯化外泌体。
外泌体提取方法
外泌体提取方法外泌体是一种细胞外囊泡，其在细胞间传递信号、调节免疫应答、参与细胞间通讯等方面发挥着重要作用。
因此，外泌体的提取方法对于研究细胞间通讯、疾病诊断和治疗等具有重要意义。
本文将介绍几种常用的外泌体提取方法，希望能够对相关研究工作提供一定的参考价值。
1. 超速离心法。
超速离心法是目前常用的外泌体提取方法之一。
首先，将细胞培养上清液收集起来，并经过一系列离心步骤，逐渐提取出外泌体。
这种方法操作简单，提取效率较高，适用于大量样本的处理。
但是，超速离心法需要专业的离心设备，并且在操作过程中需要严格控制离心参数，以确保外泌体的完整性和纯度。
2. 超滤法。
超滤法是利用超滤膜的选择性透过性，将外泌体从细胞培养上清液中分离出来的方法。
这种方法操作简便，无需离心设备，适用于小样本的处理。
但是，超滤法对超滤膜的选择和使用要求较高，需要根据外泌体的大小和特性选择合适的超滤膜，以确保提取的外泌体具有较高的纯度和完整性。
3. 免疫磁珠法。
免疫磁珠法是利用特定抗体与外泌体表面标记物的结合，通过磁珠的作用将外泌体从细胞培养上清液中提取出来的方法。
这种方法操作简便，提取效率高，适用于特定标记物的外泌体的提取。
但是，免疫磁珠法需要具有高特异性和亲和性的抗体，且对于不同类型的外泌体需要选择不同的抗体，因此在实际操作中需要进行充分的前期筛选和验证工作。
4. 超声法。
超声法是利用超声波对细胞培养上清液进行处理，破碎细胞膜，将外泌体释放出来的方法。
这种方法操作简便，无需昂贵的设备，适用于小样本的处理。
但是，超声法对超声处理的参数和时间需要进行严格控制，以避免外泌体的损伤和降解。
综上所述，外泌体提取方法各有特点，选择合适的方法需要根据具体实验要求和条件来确定。
在实际操作中，需要根据样本的特性和实验的目的，选择合适的外泌体提取方法，并进行充分的验证和优化工作，以确保提取的外泌体具有较高的纯度和完整性。
希望本文介绍的外泌体提取方法能够对相关研究工作提供一定的帮助和参考价值。
最常用的外泌体提取方法
最常用的外泌体提取方法外泌体作为近几年来的研究热点，受到了科研工作者的青睐及追捧。
由于外泌体内携带有大量的miRNA, 少量lncRNA,Mrna 以及DNA蛋白质成为液体活检的潜力无限的研究对相。
所以，获得纯度高、内容物完整的外泌体非常之重要，那么，外泌体的提取方法也显得尤为重要。
一、差速离心法差速离心法可以说是最传统最普遍的外泌体提取方法。
原理是：首先低速离心以除去细胞和细胞凋亡碎片；随后，高速离心以去除大囊泡；最后高速离心以沉淀外泌体。
具体步骤是: 以下所有步骤都在4℃下进行，1、300×g 10min，弃沉淀，去除细胞2、2000×g 20min，弃沉淀，去除死细胞3、10,000×g 30min ，弃沉淀，去除细胞碎片等亚细胞成分4、10,000×g 70min，弃上清，沉淀即为外泌体5、PBS（每10ml细胞培养液用30mlPBS重悬）清洗沉淀物，混匀， 10,000×g 70min6、l ml PBS溶解沉淀（外泌体），立即使用或置于-80℃备用。
7、一般超速离心法会结合密度梯度离心，这样得到的外泌体更纯，具体做法第4步后蔗糖梯度离心，10,000×g 70min，以去除密度大于1.21g/ml的颗粒。
优点是：成本低，操作简单，获得的囊泡数较多。
缺点是：耗时耗力（需用时8-30h，并且每次只能处理6个样本），获得的外泌体纯度不是很高，高速及重复离心也会对外泌体产生很大的伤害，并且不适用于如血浆和血清等粘性液体生物样本。
二、密度梯度离心法该方法由于比较繁琐，用的较少。
原理是：像所有的脂质小囊泡一样，外泌体可以悬浮于特定密度梯度的蔗糖中，其密度范围1.13g/ml-1.21g/ml，将要分离外泌体的样本液体置于梯度蔗糖介质上，随后通过离心将外泌体分离。
此法获得的外泌体纯度较高，但步骤繁琐，耗时，对离心时间极为敏感。
具体步骤是：收集培养2d的上清液。
外泌体提取方法及鉴定分析研究进展
外泌体提取方法及鉴定分析研究进展外泌体是细胞分泌的一种微小膜泡，包含了多种生物活性分子，如蛋白质、核酸和脂质等。
近年来，随着生物技术的不断发展，外泌体提取方法和鉴定分析研究取得了显著的进展。
本文将对外泌体提取方法及鉴定分析研究进展进行简要综述。
外泌体是由细胞分泌的一种直径约30-100nm的膜泡，由细胞内吞摄取并加工处理形成。
外泌体在细胞间通讯、物质运输以及疾病诊断等方面具有重要作用。
化学法是一种常用的外泌体提取方法，主要采用离心和沉淀相结合的方法。
首先将细胞培养液进行高速离心，去除细胞和较大的膜泡，然后加入沉淀剂沉淀获得外泌体。
该方法的优点是操作简单、提取量较大，适合大量样本的处理。
但是，该方法纯度较低，可能会影响后续的鉴定和分析。
生物法是一种利用细胞表面标志物进行免疫吸附的外泌体提取方法。
将外泌体进行免疫吸附，再通过洗脱得到纯度较高的外泌体。
该方法的优点是纯度高、对细胞损伤小，适用于珍贵样本的提取。
但是，该方法操作复杂，提取量较小，需要大量的抗体。
基因工程法是一种利用细胞表达特定基因的外泌体提取方法。
将目的基因转染到细胞中，通过表达特定膜蛋白，诱导细胞分泌出外泌体，再对其进行纯化和提取。
该方法的优点是纯度高、提取量较大，适用于具有特定功能的外泌体提取。
但是，该方法需要特定的基因工程技术和细胞系，操作较为复杂。
蛋白质组学在外泌体研究中的应用不断深入。
通过蛋白质组学技术，可以鉴定外泌体中的蛋白质种类、相对丰度以及修饰情况等。
通过比较不同条件下外泌体蛋白质组学的差异，可以研究外泌体的生物学特征和功能。
随着二代测序技术的不断发展，基因序列分析在外泌体研究中也得到广泛应用。
通过对外泌体中的核酸进行测序，可以鉴定其中的基因序列和表达水平。
通过比较不同条件下外泌体基因序列的差异，可以研究外泌体在细胞间通讯和疾病诊断等方面的作用。
转录组测序转录组测序可以分析外泌体中的mRNA、lncRNA和miRNA等转录本。
分离组织中外泌体的方法
分离组织中外泌体的方法外泌体是一类囊泡结构，存在于细胞外液中，具有重要的细胞间通讯功能。
研究外泌体的分离方法对于理解其生物学功能和临床应用具有重要意义。
本文将详细介绍分离组织中外泌体的一些常用方法。
1. 差速离心法差速离心法是最常用的外泌体分离方法之一。
其原理基于外泌体的大小和密度与其他细胞碎片的区别。
以下是具体的步骤：•收集细胞培养上清液或体液样本，去除细胞残留物和大颗粒物质。
•用低转速（300-500 × g）离心去除残留的细胞和细胞碎片，收集上清液。
•用高速离心（10,000-20,000 × g）去除大颗粒物质，收集上清液。
•最后，用超高速离心（100,000-200,000 × g）沉淀外泌体，洗涤并收集沉淀。
2. 密度梯度离心法密度梯度离心法是一种使用密度梯度剂将外泌体分离的方法。
此法适用于外泌体的分离和纯化。
•准备密度梯度剂，如葡聚糖、法尼斯氯化物等，根据所需的分离离心区分配不同浓度的密度梯度。
•将上清液加入离心管中，加入适量密度梯度剂制备离心液体。
•进行密度梯度离心，离心速度根据样品和梯度剂的特性进行调整。
•最后，收集外泌体沉淀，进行洗涤和纯化。
3. 尺寸排除色谱法尺寸排除色谱法是一种利用柱状凝胶分离方法。
根据外泌体的尺寸差异，将其与其他细胞碎片、蛋白质等分离。
•将样品注入尺寸排除色谱柱中，柱内具有大小分子孔的凝胶填料。
•样品中的大颗粒物质会进入凝胶孔隙中，而较小的外泌体则会通过凝胶柱流出。
•收集流出的外泌体，进行后续的洗涤和纯化步骤。
4. 免疫亲和法免疫亲和法是利用特定的抗体与外泌体表面的抗原相互结合实现分离的方法。
•将外泌体与标记有特定抗体的磁珠或纳米颗粒进行孵育反应。
•利用磁力或离心等手段将外泌体与磁珠或纳米颗粒结合物分离。
•洗涤分离后的复合物，去除杂质。
•最后，通过磁力或离心将复合物分离，得到纯化的外泌体。
5. 纳滤法纳滤法是一种利用滤膜分离外泌体的方法。
外泌体提取方法总结
外泌体提取方法总结外泌体（extracellular vesicles，EVs）是一种存在于细胞外环境中的脂质包裹的小泡，具有重要的生物学功能，参与了细胞间的信息传递、信号调节以及疾病发生发展等过程。
因此，外泌体的提取方法对于研究其功能和应用具有重要意义。
本文将总结目前常用的外泌体提取方法，并探讨其优缺点及适用范围。
1.超速离心法优点：简便快捷，适用于大样本体积。
缺点：提取物质多样性，包含有细胞碎片和蛋白质、RNA等其他成分，纯度较低。
适用范围：适用于初步提取外泌体，如外泌体的形态学研究等。
2.渗透梯度离心法渗透梯度离心法是在超速离心的基础上进一步提高外泌体纯度的方法。
该方法利用碘化金为基础的木糖密度梯度离心，根据外泌体与碘化金的密度差异，将外泌体进一步分离纯化。
优点：能够获得相对纯净的外泌体制备物。
缺点：操作复杂、耗时，不适用于大样本体积。
适用范围：适用于实验室规模的外泌体研究，如RNA测序、质谱分析等。
3.尺寸筛选法尺寸筛选法是通过纳滤膜或超滤膜的孔径来筛选外泌体。
通常使用孔径为0.1-0.22μm的滤膜将细胞碎片和大颗粒物质滤除，获得富含外泌体的滤液。
优点：操作简单方便、适用于大样本体积。
缺点：滤膜的孔径选择对于获得纯净的外泌体制备物有一定的影响。
适用范围：适用于外泌体的初步筛选和快速提取，如外泌体的蛋白质组学研究等。
4.免疫磁珠法免疫磁珠法是利用磁珠表面特异性抗体与外泌体上特定标志物结合，然后通过磁场将目标物质与杂质分离。
该方法可以选择性地提取特定表面标记的外泌体亚群。
优点：高选择性、高灵敏度，适用于特定外泌体的纯化。
缺点：操作相对复杂，适用于实验室规模的外泌体研究。
适用范围：适用于特定外泌体亚群的纯化和研究，如肿瘤相关外泌体的分离等。
总结起来，外泌体的提取方法各有优缺点，在选择时需要根据实验目的和样本特点进行综合考虑。
超速离心法和渗透梯度离心法适合初步提取外泌体，尺寸筛选法适合快速提取外泌体，免疫磁珠法适合提取特定亚群的外泌体。