第六章 生物合成技术
生命科学研究中的合成生物学技术
生命科学研究中的合成生物学技术在生命科学领域中，合成生物学技术是近年来受到广泛关注的一种技术。
它通过对生命系统进行精确控制和工程改造，实现对生物系统的定制化设计和构建，为研究生物现象和开发新型生物工程技术提供了一种新的途径。
一、合成生物学技术的概念和发展合成生物学技术是一种综合了化学、生物、物理学等多学科交叉的学科领域，旨在通过合成基因、代谢途径和生物信号传导网络等方法，构建更复杂的生物系统，并实现对整个系统的控制和优化。
合成生物学技术起源于20世纪80年代，在德国生物学家Thomas Bäckhuis的启发下，美国生物学家Jay Keasling和Scott Fraser等人开始探索利用工程学的方法来构建微生物细胞内的化学反应和基因调控网络，实现对细胞代谢和信号传递的精确控制。
此后，合成生物学技术迅速发展，并逐渐涉及到生物医药、环境保护、能源开发等广泛领域。
二、合成生物学技术的应用1. 生物医药领域合成生物学技术的应用在生物医药领域具有广泛潜力，可以为药物开发提供新的途径和工具。
例如，可以利用合成生物学技术构建仿生医用器材、生产人体之外的器官、设计新型生物药物等。
2. 工业生产领域在工业生产领域，通过合成生物学技术可以利用微生物生物工程代谢产物。
例如，利用大肠杆菌和酵母等微生物生产生物柴油和乙烯等商品化合物，也可以生产生物医药中的重要化合物。
3. 环境保护领域合成生物学技术对于环境保护领域也具有应用价值。
例如，可以利用微生物代谢某些有害物质，将其转化为无害或有用产物；或者构建新型微生物，用于清除重金属等污染物。
三、合成生物学技术的发展趋势1. 大规模生产合成生物学技术在药品开发、化学材料生产等领域的应用正在日益增长。
未来，合成生物学技术还将突破生物界面和能源界面，实现微生物对废物和可再生资源的利用，以及在人工光合作用和电化学发电方面的应用。
2. 优化生物系统人工合成的生物系统仍然存在许多问题。
合成生物学技术的原理和应用
合成生物学技术的原理和应用随着科技的不断进步，人们对于生物学的研究也越来越深入。
而合成生物学技术的出现，更是加速了普通人了解生物学的进程。
合成生物学是基于生物学、化学和工程学的交叉学科，其中生物学是其最基本的领域。
合成生物学主要是将生物系统的各个组成部分进行个性化设计，就像是搭建一座建筑，把每个零件优化设计再组合起来，从而形成不一样的产物。
合成生物学技术的原理合成生物学技术包含了多个层面的应用，其中主要的是在分子水平与整体系统水平上，利用设计的基因组、蛋白质翻译和生化途径来实现特定的功能。
合成生物学技术主要从原子、分子和细胞层面开始研究，然后逐渐演化到整个生物系统的层面。
其中的关键问题就是如何合成和拼接一些具有特定功能的DNA片段。
基因合成技术会先对目标序列进行计算，并基于人工智能进行模拟。
最后得到的模拟结果可以被应用于实际基因片段的设计。
这样可以降低合成基因片段的复杂度，节约时间和成本。
此外，在实际操作中也需要规划合适的核酸合成器，来精确地甄别目标基因，并快速合成DNA片段。
同时基因片段的合成也会进行体外合成和体内合成两种方式。
其中体内合成组装过程更加简便，但体外合成却可以大幅提高基因片段的合成成功率和性能。
体外合成还可以针对有缺陷的基因片段进行自动纠错，从而降低合成操作的失败风险。
合成生物学技术的应用合成生物学技术的应用领域非常广泛，可以涉及从农业生产、自然资源再生利用到生物能源开发等跟方向。
其中提高农业生产能力、治理环境污染和能源开发等都是目前合成生物学技术重点研究的领域。
在农业方面，合成生物学技术可以通过改良作物基因，来提高作物产量和抗病能力。
另外还可以构建可重复利用的农业生态系统，通过合成生物学技术可以控制氮、磷和钾等营养元素在作物生长过程中的分配效率，从而提高作物的产量，减轻农药和化肥对环境的污染负担。
在环境治理方面，利用合成生物学技术可以研究微生物的物质代谢过程，进而构建针对特定污染源的微生物群落，并利用这些微生物来对污染物进行微生物降解，实现环境治理的目的。
合成生物技术
合成生物技术合成生物技术作为一门全新的科学技术，正在迅猛地发展着。
在生物工程领域里，人类对合成生物的认识才刚刚开始。
从20世纪80年代初到现在，大约30多年的时间里，人类在这方面的研究取得了很大的进步。
合成生物技术发展至今，已经形成了许多新型分子实体：“人造器官”、“人造血液”、“人造皮肤”、“人造肌肉”……今天，让我来告诉你一些关于“人造器官”的事情吧！“人造器官”是什么呢？在我看来，它应该算是人工器官。
当你失去了心脏，就可以换上一个“人造心脏”；当你失去了肾脏，就可以换上一个“人造肾脏”；如果你失去了手臂，那你可以换上一只“人造手臂”……这样一来，你就会和没有缺陷的人一样。
但是，合成器官也存在不足之处。
由于受到技术水平的限制，在合成器官过程中使用的一些原料大部分是重复利用的，在使用完毕后还需要更换。
目前我们主要是利用一些天然材料中蕴含的天然基因，通过合成的方法获得具有特定功能的基因，使其表达出所希望的性状，在这个过程中基因表达的量非常小。
例如，用植物细胞培养出能生产能源的酵母菌，然后用基因表达系统将其特定的蛋白质合成出来。
目前，美国正在研究把自身的组织细胞和酶通过基因工程加入人体细胞内。
在组织细胞上安装人工胰腺，把它送入人体内以后，能够像人的胰腺一样工作。
“人造血液”听上去令人不寒而栗，因为在未来的医疗条件下，它可以给病人输血。
人造血液包括红细胞和血小板两种成分。
红细胞的培养，先用卵清蛋白和血浆，在体外培养7天左右，再转入适宜的培养基内继续培养14天，使红细胞变圆、增大，用过滤或离心的方法将杂质去掉，使剩下的血浆凝固起来，这时便成了红细胞悬液。
与此同时，从人的骨髓中提取造血干细胞，把它放入培养皿中，逐渐增加培养液的浓度，并添加少量含铁盐的培养基，如硫酸亚铁、硫酸亚铁铵等，从而造出一定量的红细胞悬液。
最后，把这些红细胞悬液注入静脉血管中，即可得到一定数量的红细胞。
血液中含有氧气、二氧化碳、尿素、水、电解质和葡萄糖等营养物质。
生物合成研究的基本原理及应用
生物合成研究的基本原理及应用生物合成是指生物体内合成各种有机物质的过程，这些有机物质包括蛋白质、核酸、脂类、多糖等基本生物分子。
生物合成是生命活动的基础之一，它不仅决定了生物体的生长、发育、运动、代谢等生命现象，还为工业、医学等领域提供了一系列重要的研究和应用。
本文将围绕生物合成研究的基本原理及应用展开讨论。
一、生物合成的基本原理生物合成的基本原理是通过一系列酶催化反应使有机物质在生物体内进行转化，最终合成出目标分子。
这一过程通常需要多条途径参与其中，涉及到一系列基于生化反应的机制。
1.典型生物合成途径典型的生物合成途径包括葡萄糖代谢、脂类代谢、核苷酸代谢等多种途径，其中最重要的是氨基酸的代谢以及核苷酸的合成途径。
当养分缺乏时，生物体能够通过自身内部资源以及外源性物质的输入，维持其对一系列关键物质的需求。
2.酶催化反应生物合成依靠一系列酶催化反应，这些酶能够加速化学反应速度、使反应进程更加有选择性、降低反应能垒以及加速反应平衡过程。
酶在催化反应当中起到了非常重要的作用，决定了生物体内生化反应的速率、效率和低温适应能力。
3.能量代谢参与生物体合成有机物质的过程也参与了生物体内高能化学物质的转化，这些高能化学物质包括ATP、GTP、NADH和FADH2等。
这一过程能够提供能量，维持细胞内各种生化反应的进程。
二、生物合成的应用生物合成的应用非常广泛，包括生物医药、农业、工业等领域。
下面我们将分别从这些方面进行分析。
1.生物医药领域生物合成能够创造各种生物大分子，因此在生物医药领域拥有非常广泛的应用，如抗生素等药品的制备、基因治疗以及诊断试剂的研制等。
其中最重要的应用领域是蛋白质药物的研究和生产，基于生物合成制备的重组蛋白质药物比传统小分子化学药物更容易获得高度纯度的产品，并且有更好的安全性和有效性。
2.农业领域生物合成还可以用于生产、改良作物品种，使其产量提高、品质升级，并提供优质的野生植物、蔬菜和水果。
生物材料的生物合成与应用技术
生物材料的生物合成与应用技术生物材料是指由生物体自身或通过生物合成产生的材料，具有在生物环境中与生物体相容性良好以及具备生物功能的特点。
生物材料的研究和应用领域日益扩大，可以广泛应用于医学、工程、环境保护等领域。
本文将介绍生物材料的生物合成过程以及其在医学和环境领域中的应用技术。
一、生物材料的生物合成过程生物合成是指利用生物体自身的代谢能力，通过某些细胞内酶或细胞外酶的作用，将特定的物质合成成所需的生物材料。
生物合成技术可以通过基因工程手段来改变生物体的代谢途径，以产生特定的生物材料。
1. 微生物发酵法微生物发酵法是一种常见的生物合成技术，通过利用特定微生物代谢途径中的酶作用，将底物转化成目标产物。
例如，利用大肠杆菌酶的作用，可以将底物转化为聚羟基丁酸（PHB），一种常见的生物降解塑料。
微生物发酵法具有操作简便、高效、成本低等优点，被广泛应用于生物材料的生物合成过程中。
2. 植物合成法植物合成法是指利用植物体内的生物合成机制来产生特定的生物材料。
植物细胞具有合成多糖、蛋白质等生物材料的能力，通过研究和改变植物细胞的生物合成途径，可以合成出具有特殊功能的生物材料。
例如，通过改变拟南芥细胞壁合成途径，可以合成出具有特殊结构和性能的纤维素纳米纤维。
3. 动物合成法动物合成法是指利用动物体内的代谢途径来合成特定的生物材料。
例如，利用动物细胞中的酶的作用，可以将底物转化为胶原蛋白，一种常用的生物材料，广泛应用于医学领域。
动物合成法在生物材料的生物合成过程中具有一定的局限性，但仍然是一种重要的生物合成技术。
二、生物材料在医学领域中的应用技术生物材料在医学领域中有广泛的应用，可以用于医疗器械、组织工程、药物传递等方面。
1. 医疗器械生物材料可以用于制备各种医疗器械，如人工关节、心脏起搏器等。
生物材料的生物相容性良好，可以与人体组织相容，并且具有一定的生物活性，能够促进组织修复和再生。
例如，利用生物降解材料可以制备可吸收的缝线，避免了术后二次手术取线的需求，减少了创伤和感染的风险。
第6章抗生素的生物合成
第一节 研究方法
完整地阐明生物合成过程应包括： (1)促成分子建成的初级代谢物结构单元的确立。 (2)代谢途径中中间产物的分离；这些产物的结构可
能会提供关于反应次序问题的合理假设。 (3)催化每一个反应的酶的鉴定。 (4)操纵基因及其序列和组成的确定。
阻断变株可通过对产生菌进行诱变处理，然后分 离出那些不具有产生抗生素能力的菌落而获得。
将这些变株一次两个在同一摇瓶内培养，发酵液 进行抗菌活性的测定。
两种不同的突变株进行共培养
突变株单独培养时不能产生抗生素，但将 两种不同的突变株进行共培养时，则可以 产生抗生素，表明这两种突变株的突变发 生在生物合成途径中的两个不同的阶段。
在菌株培养过程中，这些中间产物则转变为终产物分子。 终产物分子的质子NMR可以显示在酶促反应中，该原子 是否被保留或被取代。
二、中间代谢物的鉴定
生物合成反应中某一步反应不能进行的突变株的 分离，是用来鉴定合成途径中某些中间产物的一 种普遍采用的适宜手段。这些被称为“阻断变株” 的突变体，常导致培养基中那些无法参与下一步 反应的底物的积累。
对核磁共振光谱峰及其偶合常数的多重性的高分辨分析， 可以揭示出两个原子是否在整个代谢过程中都连结在一 起，还是保持相对独立，或是通过不同的代谢途径掺入 的。
通过利用氘标记的前体物的NMR的研究，同样可以获取 重要的信息。与氢不同，氘在NMR中不会产生质子的共 振信号。在生物合成反应机制的研究中，氘作为一种特 殊的标记物质，在生物合成过程的反应位点上取代单个 或多个氢原子。
13C标记前体
在利用13C标记前体时，掺入单个原子的情况可以 通过产物的核磁共振(NMR)光谱来显示。
利用这项技术，分子中单个碳原子在共振光谱中以 高峰出现，其高度与其中13C的含量几乎成正比。
合成生物学的技术
合成生物学的技术
合成生物学是一个跨学科的科学领域，它利用工程学的方法来研究和改造生命系统。
以下是合成生物学的主要技术：
1.基因测序技术：基因测序技术是合成生物学的基础，它能够精确地测定基
因组的序列，从而了解基因的结构和功能。
2.基因克隆技术：基因克隆技术是将一个或多个基因片段插入到载体中，以
便在宿主细胞中进行复制和表达。
3.基因编辑技术：基因编辑技术是一种在DNA水平上对基因进行精确编辑的
技术，包括CRISPR-Cas9系统等。
4.基因表达调控技术：基因表达调控技术是通过调节基因的表达水平来改变
细胞的行为，包括启动子工程、转录因子工程等。
5.基因合成与组装技术：基因合成与组装技术是将DNA片段组装成完整的基
因或基因簇，用于创建新的生命形式或改造现有的生命系统。
6.基因组编辑技术：基因组编辑技术是一种在全基因组水平上对基因进行精
确编辑的技术，包括锌指核酸酶（ZFN）、转录激活因子样效应核酸酶（TALEN）等。
7.细胞培养技术：细胞培养技术是在体外培养细胞的技术，用于研究细胞生
长和分化、生产生物制品或筛选药物。
8.微生物发酵技术：微生物发酵技术是在微生物细胞中生产有用化合物的技
术，包括抗生素、氨基酸等。
9.生物信息学技术：生物信息学技术是一种利用计算机分析生物学数据的技
术，包括基因组学、蛋白质组学等。
这些技术为合成生物学提供了强大的工具，使得科学家能够更好地研究和改造生命系统，为人类创造更多的价值。
张雪峰讲解合成生物技术 -回复
张雪峰讲解合成生物技术-回复合成生物技术是指利用生物学和工程学知识，通过合成基因、重组DNA 以及其他生物过程来创造新的生物材料或优化现有的生物系统的一种技术。
这项技术不仅可以为生命科学研究提供强大的工具，还可以应用于医学、农业和环境领域，具有广泛的应用前景。
在本篇文章中，我们将深入探讨合成生物技术的原理、应用和未来发展。
合成生物技术的原理可以概括为以下几个步骤：1. 设计目标基因：合成生物技术的首要任务是确定所需合成的基因序列，这需要遵循设计原则和目标功能。
科学家可以利用计算机模拟和基因库，通过不同的遗传工程技术来设计目标基因。
2. 合成基因序列：一旦目标基因确定，就可以利用化学或酶法合成相应的DNA序列。
该过程通常包括DNA片段的合成、连接和克隆等步骤。
3. 重组DNA：在直接合成基因序列之前，可以对目标基因进行调整和优化。
这可以通过添加、删除或替换部分基因序列来实现。
重组DNA是合成生物技术的关键步骤之一，经过调整的基因序列可以进一步提高其稳定性和运行效率。
4. 转化宿主细胞：为了使合成的基因能够产生所需要的功能，需要将其引入宿主细胞。
这一步骤涉及到细胞的转化、转型和筛选等过程。
科学家可以利用多种方法，如化学转化、电穿孔或基因枪等，将外源基因导入细胞。
5. 表达和产物分离：一旦将目标基因导入到宿主细胞中，基因就可以被转录和翻译为所需的产物。
这一过程需要调节基因的表达水平，并合理选择适当的生产环境。
最后，需要将产生的目标产物从细胞中分离和纯化出来。
合成生物技术的应用范围非常广泛，涉及了多个领域。
在医学领域，合成生物技术可以用于生产各种药物、疫苗和诊断试剂盒。
这种技术的应用可以提高药物的生产效率和质量，并且使得更多的药物变得可及和可负担。
在农业领域，合成生物技术可以用于改良农作物的基因组，提高其抗性和产量等特征。
此外，通过合成生物技术，科学家还可以创造新的农作物品种，使其具有更好的适应性和营养价值。
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生物合成技术生物技术,又称生物工程或生物工程技术,就是生物科学与工程技术相结合而形成的新学科。
生物技术主要包括基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程与发酵工程。
基因工程又称为重组DNA技术,就是通过人工操作,在分子水平上进行基因重组、改造与转移,以获得具有新的遗传特性的细胞,合成人们所需物质的技术过程。
酶工程就是酶的生产与应用的技术过程。
即就是通过人工操作,获得人们所需的酶,并通过各种方法使酶发挥其催化功能的技术过程。
细胞工程就是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。
发酵工程又称为微生物工程,就是在人工控制的条件下,通过微生物的生命活动而获得人们所需物质的技术过程。
发酵方式主要分为固体发酵与液体发酵两大类。
生物技术可以定向改造生物、加工生物材料,有目的地利用生命过程,广泛应用于医药、农林牧渔、生态、轻工食品、化工、能源、材料、海洋开发及环境保护等领域,涉及面广,促进传统产业的改造与新型产业的形成。
实验1 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验目的1、学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
2、学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。
二、实验原理转化就是将异源DNA分子引入另一细胞品系,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段,它就是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
转化过程所用的受体细胞一般就是限制-修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶与甲基化酶的突变株。
受体细胞经过一些特殊方法处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许外源DNA分子通过感受态细胞。
在一定条件下,将外源DNA分子与感受态细胞混合保温,使外源DNA分子进入受体细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养即可筛选出转化体。
本实验以E、coli DH 5α菌株为受体细胞,用氯化钙处理受体菌使其处于感受态,然后在一定条件下与pBR322质粒携带有抗氨苄青霉素与抗四环素的基因,因而使接受了该质粒的受体菌也具有抗氨苄青霉素与抗四环素的特性,常用Amp r,Tet r符号表示。
将经过转化后的全部受体细胞经过适当稀释后,在含有氨苄青霉素抗四环素的平板培养基上培养,只有转化体才能存活,而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素与四环素的能力都被杀死,所有带有抗药基因的质粒DNA能使受体菌从对抗菌素敏感(Amp s,Tet s)转变为具有抗药性(Amp r,Tet r),即表明了该质粒具有生物活性。
这种转化活性就是检查质粒DNA生物活性的重要指标。
转化体经过进一步纯化扩增后,再将转入的质粒DNA分离提取出来,可进行重复转化、电泳、电镜观察及做限制性内切酶酶解图谱、分子杂交、DNA测序等实验鉴定。
为提高转化率,实验中要注意以下几个重要因素:(1)细胞生长状态与密度:不要用已经过多次转接及贮存在4℃或室温的培养菌液;细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为最佳(可通过测定培养液A600nm控制),密度不足或过高均会使转化率下降。
(2)转化的质粒DNA的质量与浓度:用于转化的质粒DNA应主要就是共价闭环DNA(即cccDNA,又称超螺旋DNA),转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时则会使转化率下降。
(3)试剂的质量:所用的试剂,如氯化钙等,应就是高质量的,且最好分装保存于干燥的暗处。
(4)防止杂菌与其它外源DNA的污染:所有器皿,如离心管、分装用的Eppendorf管等,一定要干净,最好就是新的。
整个实验过程中要注意无菌操作。
氯化钙转化法由Cohen等首创。
其转化率一般能达到每1 μg超螺质粒DNA 产生5×106~2×107个转化体,足以满足常规基因克隆试验的需要。
该法具有简单、快速、稳定、重复性好、菌株适用范围广等优点而被广泛采用。
三、仪器、材料与试剂材料:E、coli DH 5α受体菌(Amp s,Tet s),pBR322质粒试剂:含抗菌素的LB平板培养基:将配好的LB固体培养基高温灭菌20 min 后,冷却至60℃左右,加入氨苄青霉素与四环素贮存液,使终浓度分别为50 μg/mL 与12、5 μg/mL,摇匀后铺板。
LB液体培养基:胰蛋白胨10 g/L,酵母浸膏5 g/L,氯化钠10 g/L,用氢氧化钠调节至pH 7、5。
120℃高温灭菌20 min。
氨苄青霉素与四环素贮存液:用50%乙醇配制。
0、1 mol/L 氯化钙溶液:每100 mL溶液中含无水氯化钙1、10 g,用无菌重蒸水配制,灭菌处理。
仪器:恒温摇床、电热恒温培养箱、无菌操作超净台、电热恒温水浴箱、分光光度计、台式离心机、带盖离心管、吸量管或自动加样器、Eppendorf管等。
四、实验内容1、感受态细胞的制备(1)从新活化的E、coli DH 5α菌平板上挑取一单菌落,接种于3 mL LB液体培养基中,37℃振荡培养12 h左右至对数生长期。
将该菌悬浮液以1:100接种量转接于100 mL LB液体培养基中,37℃振荡扩大培养,当培养液开始出现混浊后,每隔20~30 min测一次A600nm,至A600nm≤0、7停止培养。
(2)培养液转入离心管中,在冰上冷却片刻后,于0~4℃,4000 r/min离心10 min。
倒出上清培养液,并将离心管倒置在滤纸片上1 min,使残留的培养液流尽。
用10 mL冰冷的0、1 mol/L 氯化钙溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置15~30 min。
于0~4℃,4000 r/min离心10 min。
弃去上清液,加入2 mL冰冷的0、1 mol/L 氯化钙溶液,小心悬浮细胞,冰上放置片刻后即制成了感受态细胞悬液。
(3)以上制备好的感受态细胞悬液可在冰上放置,24 h后直接用于转化实验,也可加入等体积30%灭菌甘油,混匀后,分装于0、5 mLEppendorf管中,每管含100~200 μL感受态细胞悬液,置于-70℃条件下保存半年至一年。
2、转化(1)取100 μL摇匀后的感受态细胞悬液(如就是冷冻保存液,则需化冻后马上进行下面操作),加入pBR322质粒DNA溶液2 μL(含量不超过50 ng,体积不超过10 μL),此管为转化实验组。
同时做两个对照管。
受体菌对照组:100 μL感受态细胞悬液+2 μL无菌重蒸水。
质粒DNA对照组:100 μL 0、1 mol/L 氯化钙溶液+2 μLpBR322质粒溶液。
(2)将以上各样品轻轻摇匀,冰上放置30 min后,于42℃水浴中保温1、5 min,然后迅速在冰上冷却3~5 min。
(3)上述各管中分别加入100 μL LB液体培养基,则总体积为0、2 mL,该溶液称为转化反应原液。
混匀,于37℃水浴中温浴45 min(欲获得更高的转化率,此步也可恒温摇动培养),使受体菌恢复正常生长状态,并使转化体产生抗药性(Amp r,Tet r)。
3、稀释与平板培养(1)将上述经培养的转化反应原液摇匀后,进行梯度稀释,方法见表1、表1 转化反应原液梯度稀释表(2)分别取适当稀释度的各样品培养液0、1 mL,接种于两种(含抗菌素与不含抗菌素)LB 平板培养基上,涂匀。
以上各步操作均需在无菌超净台上进行。
(3)待菌液完全被培养基吸收后,倒置培养皿,于37℃恒温培养箱内培养24 h,待菌落生长良好而又未相互重叠时停止培养,每组平行做两份。
4、 检出转化体与计算转化率统计每个培养皿中的菌落数,各实验组平皿内菌落生长情况应如表2所示。
表2 各实验组在培养皿内生长情况及结论不含抗菌素培养基 含抗菌素培养基 结果说明 受体菌对照组有大量菌落长出 无菌落长出 本实验中未产生抗药性突变株 质粒DNA 对照组无菌落长出 无菌落长出 pBR322质粒DNA 溶液不含杂菌 转化实验组 有大量菌落长出 有菌落长出 pBR322质粒进入受体细胞使其产生抗药性所以,转化实验组在含抗菌素培养基平皿中长出的菌落即为转化体,根据此皿中菌落数则可计算出转化体总数与转化率,计算公式如下:接种菌液体积转化反应原液总体积稀释倍数菌落数转化体总数⨯⨯= %100⨯=）质量（加入质粒转化体总数转化率g DNA μ 再根据受体菌对照组不含抗菌素平皿中检出的菌落数,则可求出转化反应液内受体菌总数,进一步可计算出本实验条件下,由多少个受体菌可获得一个转化体。
五、注意事项(1)本实验涉及溶液的移取、分装等需敞开实验器皿的操作,均应在无菌超净台中进行,以防污染。
(2)衡量受体菌生长情况的A 600nm 与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同,因此,不同菌株的合适A 600nm 就是不同的。
(3)转化菌不宜培养时间过长,使其菌落过多而重叠,妨碍计数与单菌落的挑选。
六、思考题1、 如果一次实验的转化率偏低,应从哪些方面去分析原因？2、 制备感受态细胞的基本原理就是什么？3、 如果在对照组不该长出菌落的平皿中长出了一些菌落,您该怎样分析您的实验结果,并进行下面的实验？实验2 PCR 扩增基因特异片段一、实验目的1、学习PCR体外扩增的原理及其引物设计原则;2、了解扩增过程中各因素对扩增结果的影响;3、掌握PCR的基本操作二、实验原理PCR(polymerase chain reaction)就是在体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应。
在分子生物学研究中,广泛地应用于研究基因突变,获取加上酶切位点的目的基因与DNA序列测定等方面,就是分子生物学中一项极为常用的技术。
PCR的原理就是在模板DNA、引物与4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)存在的条件下,依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。
两个引物分别位于靶序列的两端,同两条模板的3＇端互补,由此限定扩增片段。
PCR反应由一系列的变性—退火—延伸反复循环构成,即在高温下模板双链DNA变性解链,然后在较低的温度下同过量的引物退火,再在适中的温度下由DNA聚合酶催化进行延伸。
由于每一循环的产物都可作为下一循环反应的模板,因此扩增产物的量以指数级方式增加。
理论上,经过N次循环可使特定片段扩增到2n-1,考虑到扩增效率不可能达到100％,实际上要少些,通常经25～30次循环可扩增106倍,这个量足够分子生物学研究的一般要求。
(一)PCR引物设计1、Tm值Tm值就是PCR引物设计中的一个重要参数,就是指引物与模板之间精确互补并且在模板过量的情况下有50％的引物与模板配对,而另外50％的引物处于解离状态时的温度,Tm值一般高于55℃。
合适的引物选择应需考虑到以下因素,如Taq酶的最适温度(T E)与Tm值等。
最常用的Taq酶的最适温度(T E)范围为70～74℃,根据T E可以先确定一个合适的退火温度范围(Ta)。