氰化高铁血红蛋白测定法讲解
2013体检培训——血红蛋白
个浓度标准液校正。
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3. 仪器的质控 （1）分光光度计的校正
氰化高铁血红蛋白标准液： 含50、100、150、200g/L四种浓度，每 支标准约10ml。
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54
表6 可见光分光光度计波长540nm，光径1.0cm 标准液允许误差
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日期
表5 血红蛋白平行样测定质量控制表
2005.3.22
学校
学
采血人 崔丹
大兴榆垡中
编号 血红蛋白值 复测值
范围
是否合格
20
149
40
140
60
143
80
130
100
123
145
141.6<149<156.5
146
133<140<147
132
135.9<143<150.2
117
123.5<130<136.5
1 0 81 0 5 100(T)
95 92
1
2
3
5
6
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最大允许线 警告线
靶值线
警告线 最大允许线
4
次数
废液处理
原则：不允许直接排放到下水道， 建议委托专业机构处理。
试剂含有氰化钾，使用处理不当可造成严重公 害。氰化物必须在碱性及中性条件下，加入次氯酸 钠进行二级分解。
医务人员使用时，应首先做好职业防护。 废液处理，首先以水稀释（1:1）；然后，稀释 后的废液按每升加入35ml次氯酸钠；充分混匀后敞 开容器口，放置15小时以上，使CN-氧化成CO2和N2 挥发，或是水解成CO32-和NH4+，再排入下水道。
氰化高铁血红蛋白测定法讲解
0.200g 0.140g 0.5-1.0ml
上述成分分别溶于蒸馏水中混合，再加蒸馏水至1000ml混匀，试 剂为淡黄色透明溶液，PH值在7.0-7.4。血红蛋白应在5min内完 全转化为高铁血红蛋白。
▼贴标签：写明试剂名称、配制时间、有效期、贮存法。
检测步骤
制备标准曲线
将市售氰化高铁血红蛋白(HiCN)参考 液稀释为四种浓度(200g/L、100g/L、 50g/L、25g/L)，然后以HiCN试剂调零，分 别测定各自在540nm处的吸光度，以血红 蛋白浓度(g/L)为横坐标、绘制标准曲线。
常规检测操作
⑴ 取小试管1支，加入HiCN试剂5ml；
⑵ 用清洁干燥微量吸管准确吸取末梢静脉 血20ul；擦去管外余血，将吸管插入小试 管中稀释液底部，轻轻将血放出，并吸取 上清液，清洗吸管2-3次，混匀；
⑶ 静置5分钟后，测定待测标本在540nm下 的吸光度；
⑷ 查标准曲线求得血红蛋白含量。
131-172 g/L 113-151 g/L 180-190 g/L 110-120 g/L 120-140 g/L
警告值(危机值) Hb＜50 g/L 或 ＞ 250 g/L
贫血程度划分
轻度 Hb 正常下限 —91 g/L 症状轻微； 中度 Hb 90-60 g/L 体力劳动时心慌气短； 重度 Hb 60-31 g/L 休息时感觉心慌气短； 极重度 Hb ≤ 30 g/L 常合并贫血性心脏病。
氰化高铁血红蛋白测定法 方法学评价
是国际血液学标准化委员会推荐的参 考方法，该法操作简单、显色快、结果稳 定可靠、读取吸光度后可直接定值等优点。 其致命的弱点是氰化钾试剂中剧毒，使用 管理不当会造成公害。
试剂
氰化高铁血红蛋白测定法试剂
血常规检查及其意义医生解读
反映贫血的病理变化，对贫血的鉴别诊断有一
定的价值。
○诊断缺铁性贫血：IDA的病人95%以上RDW增
高，可与β-珠蛋白生成障碍性贫血（88%RDW正 常）鉴别。
贫血类型
大细胞均一性
大细胞不均一性 正细胞均一性 正细胞不均一性 小细胞均一性 小细胞不均一性
常见疾病
部分再障
2. 生理变化：
○年龄及性别 ○精神因素 ○剧烈体力劳动或运动
○生理性贫血
新生儿：红细胞明显增
高、两周后下降，6-7 岁最低 男性：25岁-35岁达高 峰 女性：13岁-15岁达高 值，21岁-35岁低水平， 以后渐渐增高
3．病理变化：
增多：
Male RBC＞6.0×1012/L Hb＞170g/L
3. 参考值：
RBC Hb
成年男性（4.0-5.5）×1012/L （120-160）g/L
成年女性（3.5-5.0）×1012/L （110-150）g/L
初生儿 （6.0-7.0）×1012/L （170-200）g/L
（二）临床意义：（多RBC和Hb一同观察）
1．影响因素：
○全身血液容量 ○全身血浆容量
（一）概述
定义：
RBC指单位体积（每升）血液内的红细胞数量。
Hb指单位体积血液中所含血红蛋白的量。
方法：
（1） 红细胞计数
手工法 ：取样 稀释
计数 计算
仪器法 阻抗分析或激光分析
（2）血红蛋白测定
氰化高铁血红蛋白法（HiCN法）：
取样 加转化液（溶血、转化） 比色
血液在血红蛋白转化液中溶血后，除SHb外各血红 蛋白均可被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白，再 与CN-结合生成稳定的棕红色氰化高铁血红蛋白， 通过比色根据吸光度得血红蛋白的浓度。
实验三血红蛋白(Hb)及全血尿素氮
实验三血红蛋白（Hb）及全血尿素氮的测定一、血红蛋白的测定（氰化高铁血红蛋白法）血红蛋白（Hb）是一种结合色蛋白，色素部分是亚铁血红素，蛋白质部分是珠蛋白。
1分子的Hb是由4分子的亚铁血红素和1分子的珠蛋白结合而成的。
Hb的主要生理功能是：1、运输氧气（O2）和二氧化碳（CO2），2、缓冲作用。
每分子的Hb可结合4分子的氧气，在标准的情况下（0℃，1个大气压），每克Hb能结合1.39毫升氧气。
HbO2比Hb具有较强的酸性，例如，在红细胞中，1毫摩尔的HbO2能产生1.88毫克当量的氢离子（H+），而1毫摩尔的Hb只能产生1.28毫克当量的H+。
因此，在组织中，每放出1毫摩尔O2（体积22.4毫升），就能多结合0.60毫克当量的。
因而Hb在调解体内酸碱平衡也有一定的作用。
所以，在运动训练和比赛中，Hb不仅能为组织提供氧气，促进物质的有氧代谢和带走CO2，而且也能起中和酸性的作用。
调查研究认为：正常人与运动员Hb含量没有明显差异。
故Hb的正常值男性为120-160克/升；女性110-150克/升。
贫血仍采用临床标准，即成年男性低于120克/升；成年女性低于105克/升；14岁以下的少年、儿童，不论男女，均以低于120克/升作为贫血标准。
Hb在运动训练的不同阶段，其含量不完全相同，这与运动员的机能状态、训练水平及遗传因素等关系密切。
因此，系统测试Hb的含量，对于评定运动员的机能状态和运动员选材等具有重要的意义。
（一）实验目的1、学习血红蛋白的生物学功能及在运动训练中的作用2、学习超微量血红蛋白的测定方法及原理，熟练掌握试管、相关仪器的操作技能（二）实验原理Hb被高铁氰化钾[K3Fe(CN)6]氧化成高铁血红蛋白（Hi），Hi与氰离子（CN-）结合成氰化高铁血红蛋白（HiCN），它在540nm有一吸收峰，测定其光密度，与标准血红蛋白进行比较，而得到Hb的含量。
（三）实验试剂和仪器1、试剂：（1）HiCN 稀释液：称取高铁氰化钾[K 3Fe(CN)6]200毫克，氰化钾（KCN ）50毫克，磷酸二氢钾（KH 2PO 4）140毫克，加蒸馏水稀释至1升。
血红蛋白测定方法
6.1 血红蛋白测定（氰化高铁法）消光系数法和标准曲线法任选其一测定血红蛋白。
１.6.1.1 光系数法１.6.1.1.1 原理血红蛋白(haemoglobin，Hb)被铁氰化钾氧化后生成高铁血红蛋白，再生氰离子结合形成氰化高铁血红蛋白（红色），氰化高铁血红蛋白（红色）极为稳定，在540nm波长下，毫克分子消光系数为44，据此，用分光光度法测其光密度，运用消光系数作血红蛋白的定量测定。
１.6.1.1.2 仪器721型或其它型号的分光光度比色计。
10微升量吸管。
１.6.1.1.3 试剂称取碳酸氢纳（）140毫克\铁氰化钾200毫克、氰化钾50毫克，用水溶解并稀释到1000毫升。
贮存於棕色试剂瓶内，在暗处或冰箱（+4℃）保存，至少可稳定数月到一年。
１.6.1.1.4 实验步骤１.6.1.1.4.1 试剂2.5毫升於5毫升带盖试管中，加入10微升血液，混匀后，放置15分钟。
１.6.1.1.4.2 选用0.5厘米光径比色杯，于540nm波长下，以试剂调零点，将所得样品管之光密度乘以73.6，即为血红蛋白之浓度（克%）。
计算公式如下：Ct=待测的血红蛋白（克%）浓度。
D 540 = 氰化高铁血红蛋白在540nm波长下测出的光密度。
HICN251=测定时血液的稀释倍数（血10微升加入试剂2.5毫升中）44=氰化高铁血红蛋白的毫克分子消光系数0.5=比色杯的光径10000=将（毫克/升）换算成（克%）的数字１.6.1.1.5 注意事项１.6.1.1.5.1 试剂不要放在聚乙烯瓶内，以免因氰离子与其反应而使试剂作用降低。
１.6.1.1.5.2 仪器因mM消光系数法完全依靠仪器的吸光度来计算,故此法要求所用的仪器性能要符合要求(如仪器的波长准确与否,以及灵敏度及线性等),否则将直接影响测定的结果。
1.6.1.1.5.3仪器在使用前最好以WHO规定的氰化高铁血红蛋白参考液校正后再使用。
参考液最好选用ICSH9国际血液学标准化委员会）确定的由RIV（莅国立公共卫生研究院）制定的氰化高铁血红蛋白参考液或上海医学化验所制血的氰化高铁血红蛋白标准液。
氰化高铁血红蛋白测定法
氰化高铁血红蛋白测定法氰化高铁血红蛋白测定法是一种常用的生物化学实验方法，用于测定血液中的血红蛋白含量。
本文将介绍这种测定方法的原理、步骤和应用。
一、原理氰化高铁血红蛋白测定法是基于血红蛋白与氰化高铁反应的原理。
血红蛋白是一种含有铁离子的蛋白质，与氰化高铁反应后形成氰合血红蛋白，其吸收波长为540 nm。
通过测定氰合血红蛋白的吸光度，可以间接测定血液中的血红蛋白含量。
二、步骤1. 血样处理：取适量的血液样品，离心分离出血浆，将血浆与氰化高铁试剂混合均匀。
2. 反应：将混合液放入分光光度计或分光比色计中，设定波长为540 nm，记录初始吸光度。
3. 添加还原剂：在反应过程中，加入适量的还原剂，如还原葡萄糖等，使氰合血红蛋白还原成血红蛋白。
4. 再次测定：记录还原后的吸光度。
5. 计算血红蛋白浓度：根据吸光度的变化，利用标准曲线或计算公式，计算出血液中的血红蛋白浓度。
三、应用氰化高铁血红蛋白测定法广泛应用于临床医学和生物研究中。
以下是该方法的几个常见应用：1. 临床诊断：血红蛋白是血液中的重要成分，其测定对于诊断贫血、血液病等疾病具有重要意义。
氰化高铁血红蛋白测定法可以快速、准确地测定血红蛋白含量，帮助医生进行诊断。
2. 药物研发：在药物研发过程中，需要评估药物对血红蛋白的影响。
氰化高铁血红蛋白测定法可以用于评估药物对血红蛋白的结合能力或解离能力，进而判断药物与血红蛋白的相互作用。
3. 营养评估：血红蛋白含量与身体的营养状况密切相关。
通过氰化高铁血红蛋白测定法，可以评估人体的血红蛋白含量，从而判断是否存在营养不良或缺铁性贫血等问题。
4. 动物实验：在动物实验中，血红蛋白的测定对于评估动物的健康状况和实验结果的可靠性至关重要。
氰化高铁血红蛋白测定法可以用于动物血液样品的血红蛋白浓度测定。
氰化高铁血红蛋白测定法是一种常用的测定血红蛋白含量的方法。
其原理简单，步骤明确，应用范围广泛。
在临床医学、药物研发、营养评估和动物实验等领域都有重要的应用价值。
氰化高铁血红蛋白测定法
氰化高铁血红蛋白测定法氰化高铁血红蛋白测定法是一种常用的血红蛋白测定方法，通过测定血红蛋白在氰化高铁存在下的吸光度变化，可以定量测定血液中的血红蛋白含量。
本文将详细介绍氰化高铁血红蛋白测定法的原理、步骤、优缺点以及应用等方面内容。
一、原理：氰化高铁血红蛋白测定法是基于血红蛋白与氰化高铁形成氰化高铁血红蛋白（MetHbFe(CN)5）的特点进行测定的。
当血液中存在氰化高铁时，血红蛋白与氰化高铁发生反应，生成氰化高铁血红蛋白，其吸收峰位在630 nm处。
血红蛋白的浓度可以通过测定吸光度来推算。
二、步骤：1. 准备工作：配制所需试剂，包括含氰化高铁的溶液、去离子水等。
2. 标定溶液的制备：用血红蛋白标准溶液制备出不同浓度的标定溶液。
3. 测定样品的制备：取一定量的待测样品，加入适量的氰化高铁溶液进行反应。
4. 吸光度测定：使用分光光度计等仪器，测定标定溶液和待测样品的吸光度。
5. 数据处理：根据吸光度与血红蛋白浓度的关系，计算出待测样品中血红蛋白的浓度。
三、优缺点：1. 优点：（1）灵敏度高：氰化高铁血红蛋白测定法对血红蛋白的检测灵敏度较高，可以提供准确的浓度结果。
（2）操作简便：该方法的操作步骤相对简单，对实验条件的要求较低，适用于临床实验室快速测定血液样品中的血红蛋白含量。
（3）广泛应用：氰化高铁血红蛋白测定法被广泛应用于临床实验室、医疗机构以及科研领域，能够快速准确地测定血液中的血红蛋白含量。
2. 缺点：（1）有毒性：氰化高铁具有一定的毒性，需特别注意在实验过程中的安全操作，避免接触和摄入。
（2）受干扰较大：在应用过程中，有些物质如某些药物、代谢产物等可能会影响测定结果，造成测定误差。
四、应用：氰化高铁血红蛋白测定法广泛应用于临床和研究领域，主要用于以下方面：1. 临床检测：在医疗机构中，血红蛋白含量的测定对于诊断和治疗某些疾病至关重要。
通过氰化高铁血红蛋白测定法，可以快速准确地测定血液中的血红蛋白含量，以辅助疾病的诊断和治疗过程。
血红蛋白测定实验
血红蛋白测定实验一、实验目的与任务了解XF—1B型（或Hb—2000型）血红蛋白仪的使用方法，掌握血红蛋白的测定技术。
有训练运动员在较好训练效果的影响下血红蛋白正常值高于正常成年人，因此，血红蛋白的测定是评定训练效果的重要指标。
二、原理测定血红蛋白的方法很多，常见的有直接比色，光电比色法，沙利氏比色法（间接比色法）。
我们现在实验室用的是XF—1B型和Hb—2000型血红蛋白仪。
此仪器是采用氰化高铁法，应用光电比色的原理测定血红蛋白值的，其原理是：将全血样品20ul注入5ml氰化高铁血红蛋白稀释液内（亦称文—齐氏液），作251倍稀释，溶化红细胞释出血红蛋白。
稀释剂将血红蛋白先转变成高铁血红蛋白，再转化为氰化高铁血红蛋白。
然后，再用XF—1B 型（或Hb—2000型）Hb仪比色法直接测定显示浓度数，不需任何换算（每次测定只需5秒钟）。
三、实验器材XF—1B型和Hb—2000型血红蛋白仪、一次性血细胞吸管（刻度10～20ul）、采血针、75%酒精、消毒棉球、培养皿、烧杯、可调加液器、试管架、血红蛋白测定试剂（文—齐氏液）、氰化高铁血红蛋白标准液。
四、实验步骤1、插上电源，打开血红蛋白仪电源开关，按动进样开关，重复三次吸入蒸馏水，并通电预热20～30分钟。
观察显示是否为“零”。
（按出Hb仪器左下角“测试—定标”按键，使之处于“测试”状态。
）2、取试管一支，加入Hb测定试剂（文—齐氏液）5ml，放在试管架上备用。
3、采血、比色：先消毒，再用采血针在耳垂或无名指尖处采血，用干棉球擦去第一滴血，待第二滴血自然流出一大滴时，用血细胞吸管取血液20ul（注意：吸管内不可有气泡，否则需重新采血）。
擦去吸管外血液后，轻轻吹入测定管底部，并回吸数次洗净吸管，然后充分混合均匀。
待5分钟后，置Hb仪上比色。
4、记录：直接读数，记录下来。
Hb值通常以每100 ml血液中含Hb若干克来表示。
（g/ml）。
本仪器采用国际单位制（g/L），可直接显示Hb值（g/L）。
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计算公式
血红蛋白(g/L)=测定管吸光度×64458/44000 ×251
=测定管吸光度×367.6
式中：64458为目前国际公认的血红蛋白平均分子量 44000为1965年国际血液学标准化委员会公布的 血红蛋白摩尔吸光系数。 251为稀释倍数
生物参考区间
成年男性 成年女性 新生儿 婴儿 儿童
131-172 g/L 113-151 g/L 180-190 g/L 110-120 g/L 120-140 g/L
警告值(危机值) Hb＜50 g/L 或 ＞ 250 g/L
贫血程度划分
轻度 Hb 正常下限 —91 g/L 症状轻微； 中度 Hb 90-60 g/L 体力劳动时心慌气短； 重度 Hb 60-31 g/L 休息时感觉心慌气短； 极重度 Hb ≤ 30 g/L 常合并贫血性心脏病。
0.200g 0.140g 0.5-1.0ml
上述成分分别溶于蒸馏水中混合，再加蒸馏水至1000ml混匀，试 剂为淡黄色透明溶液，PH值在7.0-7.4。血红蛋白应在5min内完 全转化为高铁血红蛋白。
▼贴标签：写明试剂名称、配制时间、有效期、贮存法。
检测步骤
制备标准曲线
将市售氰化高铁血红蛋白(HiCN)参考 液稀释为四种浓度(200g/L、100g/L、 50g/L、25g/L)，然后以HiCN试剂调零，分 别测定各自在540nm处的吸光度，以血红 蛋白浓度(g/L)为横坐标、绘制标准曲线。
氰化高铁血红蛋白测定法 方法学评价
是国际血液学标准化委员会推荐的参 考方法，该法操作简单、显色快、结果稳 定可靠、读取吸光度后可直接定值等优点。 其致命的弱点是氰化钾试剂中剧毒，使用 管理不当会造成公害。
试剂
氰化高铁血红蛋白测定法试剂
氰化钾[KCN]
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
0.050g
高铁氰化钾[(K3Fe(CN)6)] 无水磷酸二氢钾 [KH2PO4] 非离子表面活性剂
试剂应保持新鲜，至少一个月配制一次
样本中白细胞过高或球蛋白异常增高时， 可干扰实验，解决方法是：白细胞过高， 离心后取上清液比色；球蛋白异常增高 (如肝硬化者)，比色液中加入少许固体氯 化钠或碳酸钾，混匀后溶液澄清后再比 色
血红蛋白 （HGB）
临床意义
生理性变化
增高
减低
•新生儿、
•主要见于婴幼儿
常规检测操作
⑴ 取小试管1支，加入HiCN试剂5ml；
⑵ 用清洁干燥微量吸管准确吸取末梢静脉 血20ul；擦去管外余血，将吸管插入小试 管中稀释液底部，轻轻将血放出，并吸取 上清液，清洗吸管2-3次，混匀；
⑶ 静置5分钟后，测定待测标本在540nm下 的吸光度；
⑷ 查标准曲线求得血红蛋白含量。
注意事项
HiCN试剂应贮存在棕色的有塞的玻璃瓶中， 不能贮存在塑料瓶中，否则会使CN-丢失，测 定结果偏低
HiCN试剂应在4℃保存，不能0℃保存，因结 冰可使试剂失效
白细胞过高或球蛋白异常增高时，可产生浓 度干扰实验
氰化钾试剂是剧毒品，测定后的废液应除毒 处理后再弃去
质量控制
HiCN试剂应4℃保存，否则试剂失效，直 接影响检测质量
高原地区居住者 老年人
•及妊娠中晚期等
血红蛋白 （HGB）
临床意义
病理性变化
增高
•真性红细胞增多、 代偿性红细胞增多症
•先天性心脏病、 慢性肺部疾病、脱水
减低
•各种贫血、白血病 •产后、手术后、大 量失血
结果分析
测定值假性增高
稀释倍数不准确 红细胞未完全溶解 血浆中脂质或蛋白质量增加
废液处理
氰化钾试剂是剧毒品，测定后的废液 应首先以水稀释(1:1)，再加次氯酸钠 35ml/L，充分混匀，放置15小时以上，使 CN-氧化成CO2和N2挥发，再排入下水道， 废液不能直接与酸性溶液混合，避免产生 剧毒的氰氢酸气体
(HGB)
氰化高铁血红蛋白测定法
原理：
血液中除硫化红蛋白(SHb)外的各种血 红蛋白(如氧化血红蛋白、碳氧血红蛋白、 高铁血红蛋白或其他衍生物)均可被高铁氰 化钾氧化称高铁血红蛋白，再与氰离子(CN-) 结合，生成稳定的氰化高铁血红蛋白，氰化 高铁血红蛋白在波长540nm处有一个较宽的 吸收峰，它在540nm处的吸光度同它在溶液 中的浓度成正比，常规测定可以从HiCN参 考液制作的标准曲线上读取结果。