生物材料溶血性标准化评价方法比较_溶血率法和氰化高铁血红蛋白法
氰化高铁血红蛋白测定法
氰化高铁血红蛋白测定法氰化高铁血红蛋白测定法是一种常用的生物化学实验方法，用于测定血液中的血红蛋白含量。
本文将介绍这种测定方法的原理、步骤和应用。
一、原理氰化高铁血红蛋白测定法是基于血红蛋白与氰化高铁反应的原理。
血红蛋白是一种含有铁离子的蛋白质，与氰化高铁反应后形成氰合血红蛋白，其吸收波长为540 nm。
通过测定氰合血红蛋白的吸光度，可以间接测定血液中的血红蛋白含量。
二、步骤1. 血样处理：取适量的血液样品，离心分离出血浆，将血浆与氰化高铁试剂混合均匀。
2. 反应：将混合液放入分光光度计或分光比色计中，设定波长为540 nm，记录初始吸光度。
3. 添加还原剂：在反应过程中，加入适量的还原剂，如还原葡萄糖等，使氰合血红蛋白还原成血红蛋白。
4. 再次测定：记录还原后的吸光度。
5. 计算血红蛋白浓度：根据吸光度的变化，利用标准曲线或计算公式，计算出血液中的血红蛋白浓度。
三、应用氰化高铁血红蛋白测定法广泛应用于临床医学和生物研究中。
以下是该方法的几个常见应用：1. 临床诊断：血红蛋白是血液中的重要成分，其测定对于诊断贫血、血液病等疾病具有重要意义。
氰化高铁血红蛋白测定法可以快速、准确地测定血红蛋白含量，帮助医生进行诊断。
2. 药物研发：在药物研发过程中，需要评估药物对血红蛋白的影响。
氰化高铁血红蛋白测定法可以用于评估药物对血红蛋白的结合能力或解离能力，进而判断药物与血红蛋白的相互作用。
3. 营养评估：血红蛋白含量与身体的营养状况密切相关。
通过氰化高铁血红蛋白测定法，可以评估人体的血红蛋白含量，从而判断是否存在营养不良或缺铁性贫血等问题。
4. 动物实验：在动物实验中，血红蛋白的测定对于评估动物的健康状况和实验结果的可靠性至关重要。
氰化高铁血红蛋白测定法可以用于动物血液样品的血红蛋白浓度测定。
氰化高铁血红蛋白测定法是一种常用的测定血红蛋白含量的方法。
其原理简单，步骤明确，应用范围广泛。
在临床医学、药物研发、营养评估和动物实验等领域都有重要的应用价值。
氰化高铁血红蛋白测定法
氰化高铁血红蛋白测定法氰化高铁血红蛋白测定法是一种常用的血红蛋白测定方法，通过测定血红蛋白在氰化高铁存在下的吸光度变化，可以定量测定血液中的血红蛋白含量。
本文将详细介绍氰化高铁血红蛋白测定法的原理、步骤、优缺点以及应用等方面内容。
一、原理：氰化高铁血红蛋白测定法是基于血红蛋白与氰化高铁形成氰化高铁血红蛋白（MetHbFe(CN)5）的特点进行测定的。
当血液中存在氰化高铁时，血红蛋白与氰化高铁发生反应，生成氰化高铁血红蛋白，其吸收峰位在630 nm处。
血红蛋白的浓度可以通过测定吸光度来推算。
二、步骤：1. 准备工作：配制所需试剂，包括含氰化高铁的溶液、去离子水等。
2. 标定溶液的制备：用血红蛋白标准溶液制备出不同浓度的标定溶液。
3. 测定样品的制备：取一定量的待测样品，加入适量的氰化高铁溶液进行反应。
4. 吸光度测定：使用分光光度计等仪器，测定标定溶液和待测样品的吸光度。
5. 数据处理：根据吸光度与血红蛋白浓度的关系，计算出待测样品中血红蛋白的浓度。
三、优缺点：1. 优点：（1）灵敏度高：氰化高铁血红蛋白测定法对血红蛋白的检测灵敏度较高，可以提供准确的浓度结果。
（2）操作简便：该方法的操作步骤相对简单，对实验条件的要求较低，适用于临床实验室快速测定血液样品中的血红蛋白含量。
（3）广泛应用：氰化高铁血红蛋白测定法被广泛应用于临床实验室、医疗机构以及科研领域，能够快速准确地测定血液中的血红蛋白含量。
2. 缺点：（1）有毒性：氰化高铁具有一定的毒性，需特别注意在实验过程中的安全操作，避免接触和摄入。
（2）受干扰较大：在应用过程中，有些物质如某些药物、代谢产物等可能会影响测定结果，造成测定误差。
四、应用：氰化高铁血红蛋白测定法广泛应用于临床和研究领域，主要用于以下方面：1. 临床检测：在医疗机构中，血红蛋白含量的测定对于诊断和治疗某些疾病至关重要。
通过氰化高铁血红蛋白测定法，可以快速准确地测定血液中的血红蛋白含量，以辅助疾病的诊断和治疗过程。
生物医用材料生物相容性及其评价方法
其他功能
细胞粘附
细胞散布 细胞生物合成功能
对细胞功能影响的分子生物学评价
细胞粘附分子(CAM)
细胞因子和生长因子 DNA转录翻译与信号传导
细胞粘附分子(CAM)
细胞粘附分子(CAM)家族，它是一类 表达在细胞表面的分子，能够控制和 促进细胞与其他细胞(比如基质中的 细胞)的相互作用。
致癌试验是用不同形状、大小、表面状态的材料植入体内某 一部位，观察动物整个寿命期材料和医疗器械对体内潜在的 致癌作用； 血液相容性试验是通过材料和医疗器械直接接触血液，首先 观察对血小板激活、血栓形成的凝血作用，其次观察血浆蛋 白、血液由形成分和补体系统、细胞因子的作用； 植入试验是将生物材料和医疗器械埋入动物体内某些部位， 断肠埋入不同时间材料对局部的组织病理学的改变； 降解试验是采用各种体内外方法，测定材料和医疗器械的降 解程度、力学强度的变化，了解降解产物在体内的吸收、分 布、代谢过程，评价材料对机体的有害作用。
生物材料生物学评价标准的发展
1982年美国国家标准学会和牙科协会 (ANSI/ADA)公布了评价生物相容性实验标准 草案。 国际标准化组织( ISO )于1997年 以10993 编号发布了17 个相关标准 。 我国全国医疗器械生物学评价标准化技术委 员会成功将ISO10993系列标准转化为国家标 准――《医疗器械生物学评价》
荧光染色法
将细胞与乙酰乙酸荧光素(FDA) 和溴化乙锭(EB)一起培养, FDA 能够进入细胞内部并转化为荧光 素, 荧光素, 在适当的激发波长 下发出绿色荧光。EB不能穿过完 整的细胞膜, 但如果细胞膜已经 被破坏, EB就能够进入细胞并且 与核酸尤其是细胞核内的DNA 紧 密结合, 这时看到的是橘红或红 色的荧光。
氰化高铁血红蛋白测定法试剂
氰化高铁血红蛋白测定法试剂氰化高铁血红蛋白测定法是一种常用的生化实验方法，用于分析和测定血液中的血红蛋白含量。
本文将全面介绍该测定法的原理、操作步骤及实验结果的解读，以及实验中需要注意的事项。
氰化高铁血红蛋白测定法的原理是利用氰化高铁与血红蛋白形成氰合血红蛋白，通过测定其最大吸收波长处的吸光度来确定血红蛋白的浓度。
这个测定法在实验室应用广泛，特别适用于快速分析大量样本。
操作步骤如下：1. 准备试剂：将氰化高铁溶液定容至10ml，并使用洗瓶洗净可塑性吸光管。
2. 取1ml待测血清，加入两滴牛磺酸溶液，充分混合。
3. 加入2ml的氰化高铁溶液，尽量避免溶液溢出或产生气泡。
4. 轻轻倾斜吸光管，充分混合后，放置在室温下孵育5分钟。
5. 将孵育后的吸光管置于1cm光程比色皿中，切不可触摸吸光池。
6. 使用5% NaOH溶液分别置于两个比色皿中，作为空白对照。
7. 使用比色计在最大吸收波长（540nm）测定各组的吸光度值。
8. 计算血红蛋白浓度。
根据标定曲线和吸光度值的关系，描绘标定曲线并用所测吸光度值参照标定曲线，查得相应血红蛋白浓度。
实验结果的解读需要注意以下几个方面：1. 血红蛋白浓度的计算：在标定曲线上查找所测吸光度值对应的血红蛋白浓度，可得到最终结果。
2. 结果的参考范围：血红蛋白浓度的正常范围在男性为130～175g/L，女性为115～155g/L。
3. 实验误差的排除：实验过程中，应严格控制各实验条件的一致性，避免外界因素对实验结果的影响。
同时，在同一天内重复检测样本可以提高实验结果的可靠性。
需要注意的事项：1. 操作安全：氰化高铁溶液有毒，操作时应佩戴手套和护目镜，并避免接触皮肤和吸入气体。
2. 实验条件：实验室应具备较好的通风条件，同时实验过程中，避免光线、震动和干扰。
3. 校准和质控：每天开始实验前进行仪器校准，并使用已知浓度的标准品进行质控，以确保实验结果的准确性和可靠性。
综上所述，氰化高铁血红蛋白测定法是一种简便、快速、准确的血红蛋白测定方法。
材料的血液相容性表征
材料在医疗领域中的应用越来越广泛，因此了解和评估材料的血液相容性非 常重要。在本次演示中，我们将深入探讨材料血液相容性的定义、评价方法 以及未来发展方向。
什么是血液相容性？
红细胞膜的相容性
血液相容性是指材料接触到红细胞膜时，是否会 激活免疫系统释放细胞毒素导致红细胞的损伤和 死亡。
如何表征血液相容性
凝集作用
血液透明度的变化、血栓形成情况等。
血浆蛋白变化
血浆蛋白，如C3、C4等的变化。
血细胞形态变化
大小、形态等变化。
溶血试验和补体激活
溶血度、补体激活情况等。
材料相容性测试实验设计
实验设备
选择合适的器材和设备进行实验。
取样方法
使用准确的取样方式保证实验的准确性。
操作技能
熟练地掌握实验操作技能。
实验流程评估
对于实验过程中产生的问题进行评估并改善。
相容性测试结果分析与解读
1
结果分析
综合分析实验结果，确定材料的血液相容性评价标准。
2
结果解读
将实验结果与已有标准进行比较分析，对于实验结果进行科学的解读。
3
风险评估
基于分析结果对于材料的应用风险进行评估和控制。
未来发展方向
多重评估指标的应
性评价
用
将高通量筛选技术应用 于材料的血液相容性评 价，大幅提高实验效率。
对于3D打印材料的血液 相容性评价技术进行研 究，以适应3D打印在医 疗领域中的不断发展。
结合多种技术和评估指 标，提高材料血液相容 性评价的客观性和科学 性。
血液输注的相容性
血液相容性还可以用来描述给予血液或血液制品 时，受者的血液是否反应异常，导致炎症反应、 溶血等不良后果。
两种试验方法对一种阳性溶血材料的溶血性能的研究
两种试验方法对一种阳性溶血材料的溶血性能的研究赵增琳;屈秋锦;侯丽;刘香东;董秀丽【摘要】目的:探讨吸光度测定法和血红蛋白浓度测定法两种不同方法对丁腈材料的溶血性能结果的影响,为有效评估医疗器械或材料的溶血性能提供合理的试验方法.方法:采用吸光度测定法和血红蛋白浓度测定法两种方法对丁腈材料进行溶血性能检测,每种方法分别采用直接接触和间接接触两种方式进行,对测得的溶血结果进行比对.结果:直接接触血液时,两种测定方法结果没有差异(P>0.05),为轻度溶血,说明考察试验材料表面接触血液对红细胞的影响时,两种方法中对溶血性能的评价是稳定且一致的.60％浓度稀释液时,虽然结果都在同一判定标准中(都为溶血性),但吸光度测定法溶血率值明显低于血红蛋白浓度测定法(P<0.01).100％浓度浸提液时,吸光度测定法和血红蛋白浓度测定法结果没有差异(P>0.05),均为全部溶血.结论:在实际选择溶血试验方法时,需根据医疗器械临床使用特点,选择适宜的方法考察医疗器械溶血性能.【期刊名称】《中国医疗器械信息》【年(卷),期】2018(024)003【总页数】4页(P5-7,21)【关键词】吸光度测定溶血法;血红蛋白浓度测定溶血法;溶血【作者】赵增琳;屈秋锦;侯丽;刘香东;董秀丽【作者单位】山东省医疗器械产品质量检验中心,山东济南 250101;山东省医疗器械生物学评价重点实验室,山东济南 250101;;;【正文语种】中文【中图分类】R197.39医疗器械/材料的溶血作用是指医疗器械/材料表面或其可溶出物可导致红细胞膜破坏，血浆中游离血红蛋白增加，从而产生的毒性生物学作用。
故医疗器械或材料介导的溶血试验可分为直接接触法和间接接触法。
目前，国际上公认的材料引起的溶血试验方法包括：美国国立卫生院（NIH）吸光度测定法（直接接触法）、美国材料试验协会（ASTM）血红蛋白浓度测定法（直接接触法和间接接触法）[6]。
氰化高铁血红蛋白测定法
氰化高铁血红蛋白测定法
原理：
血液中除硫化红蛋白(SHb)外的各种血 红蛋白(如氧化血红蛋白、碳氧血红蛋白、 高铁血红蛋白或其他衍生物)均可被高铁氰 化钾氧化称高铁血红蛋白，再与氰离子(CN-) 结合，生成稳定的氰化高铁血红蛋白，氰化 高铁血红蛋白在波长540nm处有一个较宽的 吸收峰，它在540nm处的吸光度同它在溶液 中的浓度成正比，常规测定可以从HiCN参 考液制作的标准曲线上读取结果。
警告值(危机值) Hb＜50 g/L 或 ＞ 250 g/L
贫血程度划分
轻度
Hb 正常下限 —91 g/L 症状轻微；
中度 Hb 90-60 g/L 体力劳动时心慌气短； 重度 Hb 60-31 g/L 休息时感觉心慌气短；
极重度 Hb ≤ 30 g/L 常合并贫血性心脏病。
注意事项
HiCN试剂应贮存在棕色的有塞的玻璃瓶中， 不能贮存在塑料瓶中，否则会使CN-丢失，测 定结果偏低
HiCN试剂应在4℃保存，不能0℃保存，因结 冰可使试剂失效 白细胞过高或球蛋白异常增高时，可产生浓 度干扰实验 氰化钾试剂是剧毒品，测定后的废液应除毒 处理后再弃去
质量控制
HiCN试剂应4℃保存，否则试剂失效，直 接影响检测质量 试剂应保持新鲜，至少一个月配制一次 样本中白细胞过高或球蛋白异常增高时， 可干扰实验，解决方法是：白细胞过高， 离心后取上清液比色；球蛋白异常增高 (如肝硬化者)，比色液中加入少许固体氯 化钠或碳酸钾，混匀后溶液澄清后再比 色
测定值假性增高
稀释倍数不准确 红细胞未完全溶解
血浆中脂质或蛋白质量增加
废液处理
氰化钾试剂是剧毒品，测定后的废液
应首先以水稀释(1:1)，再加次氯酸钠
临床检验基础资料
1、中毒颗粒：在严重感染时中性粒细胞内出现的染成紫黑色的粗大颗粒。
2、杜勒小体：是中性粒细胞胞质因毒性变而保留的嗜碱性区域，呈圆形，梨形或云雾状，界限不清，是胞质局部不成熟，即核与胞质发育不平衡的表现，他亦见于单核细胞中，常见于严重感染。
3.豪-焦小体：成熟红细胞或幼红细胞胞质内含有一个或多个直径为1~2μm暗紫红色圆形小体，为核碎裂、溶解后的残余部分。
常与卡波环同时存在，见于脾切除后、无脾症、脾萎缩、脾功能减低、红白血病、某些贫血（如巨幼红细胞性贫血）4.核左移：外周血中性杆状核粒细胞增多（出现晚、中、早幼粒细胞以致原粒细胞）的现象。
5.核右移：外周血中性分叶核粒细胞增多，并且五叶核以上者超过3％的现象，常见于巨幼贫。
6.网织红细胞：是介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间的过渡阶段细胞，略大于成熟红细胞，报纸中残存的嗜碱性物质RNA源自有核红细胞。
RNA是嗜碱性物质，经碱性染料活体染色后，形成蓝色或紫色的点粒状或丝网状结构沉淀物。
7.卡波坏:成熟红细胞内的胞质中出现的紫红色或绕成8字型结构，可能是由于核膜的残余物或纺锤体的残余物及胞质中脂蛋白变性所致，常与染色质小体同时存在。
多见于巨幼细胞贫血，铅中毒，白血病。
8.红细胞沉降率ESR：指红细胞在一定条件下的沉降速度，简称血沉。
9.血细胞比容：只在一定条件下经离心沉淀压实的红细胞在全血中所占体积的百分比。
10.本周氏蛋白：多发性骨髓瘤患者体内产生的免疫球蛋白轻链。
可出现于尿中，该蛋白加热至40～50℃发生沉淀，继续加热则重新溶解。
11.瑞氏染液：是最常用、最经典的血涂片染色的方法，由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料。
12.异型淋巴细胞：在某些病毒性感染或过敏原刺激下使淋巴细胞增生，并出现一定的形态变化称为异型淋巴细胞。
13.退行性变白细胞：白细胞出现胞体肿大、结构模糊、边缘不清、核固缩、肿胀或溶解等变化。
14.APTT：是在体外模拟体内内源性凝血的全部条件，测定血浆凝固所需的时间，用以反映内源性凝血因子是否正常，是筛选止血功能最基本常用的试验之一。
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生物材料溶血性标准化评价方法比较:溶血率法和氰化高铁血红蛋白法张伶俐 朱蔚精 谭言飞 屈树新 张兴栋△(四川大学分析测试中心生物学评价实验室,生物材料工程研究中心,成都 610064) 摘要 采用游离血红蛋白直接测定法即溶血率测定法(根据ISO TR7405)和氰化高铁血红蛋白法(根据ISO 1099324)测定了羟基磷灰石(陶瓷)和胶原(高分子材料)的溶血性能,结果提示这两种方法的结论是一致的,且氰化高铁血红蛋白法较血红蛋白直接测定法有灵敏、稳定、可比性好等优点,值得推广应用。
但它存在着一些标准中尚未明确规定的问题。
作者在大量试验和不违背标准原则的基础上提出了一些改进意见,使它更具有可操作性,以便于标准化评价生物材料的溶血性能。
关键词 生物学评价 血液相容性 溶血试验Com par ison between Hem olysis Percen tage M ea surem en t and Hem iglob i ncyan ide M ea surem en t for Standard iz i ng the Eva lua tion ofHem olytic Properties of B ioma ter i a lsZhang L i ngl i Zhu W e ij i ng Tan Yanfe i Qu Shux i n Zhang X i ngdong∃(B iolog ica l E va lua tion L aborota ry,A na ly sis and T esting Cen ter,E ng ineering R eseach Cen ter in B io m a teria ls,S ichuan U n iversity,Cheng d u 610064,Ch ina) Abstract In th is study,tw o m ethods——the supernatant hemoglobin spectropho tom etry,i.e.hemo lysis percentage m easurem ent(acco rding to ISO TR7405)and the hem iglobincyanide m easurem ent(acco rding to ISO 1099324)——w ere used to assay the hemo lytic p roperties of hydroxyapatite(bi oceram ics)and co llagen(po lym er).T he results show ed that the conclusi ons draw n from using the tw o m ethods w ere basically consistent,and the lat2 ter w as mo re sensitive,stable and comparable.How ever,som e of the p rocedures in the hem iglobincyanide m ethod w ere no t defined in details.So based on our experi m ents w e have offered som e suggesti ons and i m p rovem ents, w h ich do no t deviate from ISO and A STM standards,fo r h iher p racticability of usig it in standardizing the evalua2 ti on of the hemo lytic p roperties of bi om aterials.H em iglobincyanide m easurem ent is w o rthy of w ider app licati on.Key words B i o logical evaluati on H emocompatibility H emo lysis test1 引 言与血液直接或间接接触的生物材料必须评价它的血液相容性。
溶血试验检测生物材料与红细胞的相互作用,是一项非常重要的血液相容性评价试验,也是一项重要的体外粗筛试验。
目前国内外大多采用游离血红蛋白直接测定法即溶血率测定法评价生物材料的溶血性能[1～6],但国际标准化组织(In ter2 nati onal standard o rgan izati on,ISO)于2000年颁布了ISO D IS1099324:2000标准[7],重点推荐了氰化高铁血红蛋白法(hem iglob incyan ide,H i CN),并指∃联系人。
E2m ail:zhangxd@。
T el:028*********明操作程序参考A STM F756293标准[8]。
为了与国际接轨,我国正在准备出台相应的等同标准(GB T16886.42xxxx[9])。
然而,无论是ISO D IS109932 4:2000还是A STM F756293都还有一些问题没有规定和说明,给这一标准的实施带来一定的困难。
比如A STM F756标准要求用3只兔的血分别进行试验,而ISO D IS1099324:2000要求最好用人血,也可以用三只兔的混合稀释血代替人血,因为动物血中兔的溶血性能与人最接近。
其次,A STM F756293和ISO D IS1099324:2000都没有规定无定形材料的检测用量,等等。
本文对H i CN测定法进行了一些探索,重点分析了不同血液来源和不同材料的测定结果,比较了两种方法的优缺点,并且在不违背标准原则的基础上提出了一些建议,以便更好地贯彻实生物医学工程学杂志J B i om ed Eng 2004;21(1)∶111～114 施新颁布的标准(GB T16886.4)。
2 材料和方法2.1 材料和仪器选择了两大类生物材料。
第一类是羟基磷灰石(H ydroxyap atite,HA)生物陶瓷,白色颗粒状,51 mm,其阴性对照选用氧化铝陶瓷,呈白色砂粒状。
第二类是医用高分子胶原(co llagen),白色片状,厚度大于0.5mm,其阴性对照选用医用输血袋聚氯乙烯(Po lych lo rovinyl,PV C),无色透明片状,厚度小于0.5mm。
新鲜兔血取自附有健康合格证的大耳白兔,人血取自某单位健康体检人群。
可见与紫外分光光度计(UV755B型,上海精密科学仪器有限公司分析仪器总厂制造,中国测试技术研究院检定)被用于本试验。
2.2 氰化高铁血红蛋白法(H i CN法)[7～10]2.2.1 材料的准备 颗粒或砂粒状材料取1g放入一只试管中,蒸馏水洗3次,生理盐水洗3次,生理盐水浸泡5m in,沥干备用。
厚度大于0.5mm的片状材料取15c m2(单面面积),厚度小于0.5mm 的取30c m2(单面面积)放入一只试管中。
每种材料准备6个试管。
2.2.2 血液的准备 抗凝剂用肝素或A CD液(枸橼酸4.7g L,枸橼酸钠13.3g L,葡萄糖30.0g L)。
兔血或人血的血浆游离血红蛋白浓度应小于1.0m g mL。
用生理盐水稀释全血至总血红蛋白浓度小于1.250±0.125m g mL。
另外稀释三只兔的等量混合血,混合血的血浆游离血红蛋白和全血的总血红蛋白浓度均应满足上述要求。
取稀释血1 mL,加入3mL D rabk in’s试剂(碳酸氢钠1.0g L,氰化钾0.05g L,铁氰化钾0.2g L)中,测吸光度(OD540)值,即得1mL稀释血中的总血红蛋白。
2.2.3 材料与血液接触 于每种材料6只试管中各加入5mL稀释全血,轻轻混匀。
6只试管分成两组进行静态试验和动态试验。
静态试验组在37±2℃恒温水浴中静置4h,动态试验组在37±2℃的条件下,置振摇板上振摇混合1h,垂直方向不超过45°,振摇频率为30±6r m in。
2.2.4 吸光度的测定 取出上述试管,以700～800g离心5m in,小心吸取上清液1mL,加入3mL D rabk in’s试剂中,在紫外2可见分光光度计(UV2 755B)上,用D rabk in’s试剂调零,测定540nm波长下的吸光度(OD540)值,光径1c m。
查标准曲线,即得游离血红蛋白浓度。
2.2.5 计算溶血指数(H em o lytic index,H.I.)H.I.=1mL上清液中的游离血红蛋白1mL稀释血中的总血红蛋白2.2.6 结果判断 溶血指数为0～2,不溶血;溶血指数为2～10,轻度溶血;溶血指数为10～20,中度溶血;溶血指数为20～40,明显溶血;溶血指数> 40,重度溶血。
2.3 游离血红蛋白直接测定法[11～14]2.3.1 材料的准备 颗粒或砂粒状材料取5g放入一支试管中,洗涤方法同前。
片状材料厚度大于0.5mm取30c m2(单面面积)放入一支试管中。
阴性对照为生理盐水(0.9%N aC l so lu ti on,N S),阳性对照为蒸馏水,各取10mL装入一支试管中。
材料、阴性对照、阳性对照各准备3只试管。
2.3.2 血液的准备 取一只健康家兔的鲜血2 m l,肝素抗凝,加入2.5m l生理盐水稀释,0.2mL 稀释血在10mL蒸馏水中于波长545nm处的吸光度值应为0.8±0.3。
2.3.3 材料与血液相接触 在3只装有样品的试管中每只加入10mL生理盐水,与阴性对照组和阳性对照组同时放入37±2℃恒温水浴中静置30 m in,加入0.2mL稀释血,再在37±2℃恒温水浴中静置1h。
2.3.4 吸光度的测定 取出上述试管,以700～800g离心5m in。
小心吸取上清液4mL,在紫外2可见分光光度计(UV2755B)上,用生理盐水调零,测定545nm波长下的吸光度(OD545)值,光径1c m。
阴性对照组的吸光度的平均值为D nc,阳性对照组的吸光度的平均值为D pc,样品的吸光度为D t。
计算溶血率Z:Z=D t-D ncD pc-D nc×100%2.3.5 结果判断 试验样品的溶血率应小于5%,若大于5%则预示材料有溶血作用。
3 结 果3.1 H i CN法检测羟基磷灰石陶瓷颗粒的溶血指数首先测定了样品在不同兔血中的溶血指数(结果见表1)。
证实不同个体的兔血对试验结果有影响。
211 生物医学工程学杂志 第21卷表1 HA颗粒与不同个体的兔血接触的H i CN法试验结果Table1 The results of HA i n con tact with differen t rabbit blood by H i CN methodM aterials R abbits H emo lytic indexof static testFo r q PH emo lytic indexof static testFo r q PHA8#36.5±7.214.4<0.0168.5±4.554.2<0.01 13#18.7±0.724.3±3.415#42.3±4.165.8±2.4R abbits22.7±1.9 ①与③23.09<0.0155.0±13.3 ①与③10.01<0.01H um an A5.5±0.0 ①与②18.95<0.0111.3±2.0 ①与②8.48<0.01H um an B3.2±0.7 ②与③4.14<0.056.4±1.4 ②与③1.53>0.05A l2O38#2.2±0.65.27<0.055.6±1.10.35>0.0513#1.5±0.04.5±2.615#4.9±0.88.1±1.6N S8#2.2±1.70.25>0.055.0±1.77.22<0.05 13#1.1±0.04.1±0.715#2.4±1.63.2±1.6 注:①、②、③是按三个组的溶血指数的均数从大到小排列,3HA:hydroxyapatite;H i CN:hem iglobincyanide ISO D IS1099324:2000指出,最好选用人血做溶血实验,也可以用三只兔的混合稀释血液代替人血。