常用微生物染色的方法共23页
常用的微生物染色方法
几种常用的微生物染色方法1简单染色不同的细菌，或者由于观察者所侧重观察的内容不同一，所以所使用的染料也有差异，但是简单染色的方法是一样的。
先按照上述的制片方法制片，制成需要观察的玻片后，使用相对应的染料滴加到玻片上菌膜区域，以覆盖菌膜为准。
按照不同染料的要求，结合所观察的内容确定染色时间，染色时间到达时，进行水洗，干燥等步骤(见图5-2)。
最后得到的玻片加盖盖玻片即可进行镜检。
如有需要可以后续再进行油封、蜡封等封片过程。
2芽孢染色法芽孢杆菌属和梭状芽孢杆菌属的细菌能产生内孢子，这些孢子耐高温、干旱及有毒化学试剂。
内孢子还能抵制细菌染色液的进入，在革兰氏染色法涂片染色时，革兰氏阳性菌的芽孢呈现无色。
然而，芽孢一旦着色后就很难脱色。
虽然芽孢通常可在革兰氏染色片中看到(芽孢由于不易让染料进入多呈现无色),但在不易清晰观察时，可用特殊的芽孢染色法，使芽孢与菌体呈现不同颜色，更便于观察。
其实验的操作方法与革兰氏染色类似。
主要的芽孢染色法有以下两种。
(一)孔雀绿染色法(1)将生有芽孢的斜而菌苔按革兰氏染色法涂片后，用饱和孔雀绿水溶液(约为7.6%)染10 min。
(2)用自来水冲洗。
(3)用0.5%番红液复染30%.(4)水洗，吸干。
(5)镜检：芽孢呈绿色，菌体和芽抱囊呈微红色，但应注意菌体中有异染粒时，也可呈绿色。
(二) 石炭酸复红染色法(1)按常规涂片。
(2)滴加石炭酸复红于涂片上，并于玻片下缓缓加热，使染液冒蒸气但不沸腾，并继续滴加染液，不使涂片上染液蒸干，这样保持5 min。
(3)涂片冷却后，倾去染液，用酸性乙醇脱色至无红色染剂洗脱为止。
(4)彻底水洗。
(5)用吕氏美蓝复染2 min -3 min。
(6)水洗、吸干。
(7)镜检：镜检时，菌体及孢囊呈蓝色，芽孢呈红色。
具体实验时，在对一些特殊芽孢染色时，需要对染色液和复染液进行修改。
3鞭毛染色鞭毛是细菌的运动器官，非常纤细，直径一般为10nm~20 nm,超出了光学显微镜的观察极限，因此通常情况下在显微镜下观察不到鞭毛。
常用微生物染色方法-精选文档
革兰染色意义
鉴别细菌
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌
选择药物
革兰氏阳性菌对青霉素等敏感 革兰氏阴性菌对链霉素等敏感
与细菌的致病性有关
革兰氏阳性菌产生外毒素 革兰氏阴性菌产生内毒素
抗酸染色
原理：结核菌、麻疯杆菌、耻垢菌等抗酸性菌， 因其菌体表面有一层类脂或脂质而不易着色，但 一经着色后酸或已醇的作用亦是不易脱色。利用 此特性并以增强的染色液染色，然后再用酸及乙 醇加处理，使其脱色后再对比染色，此时抗酸性 菌仍是固定着最初色素的颜色（红色），而其他 细菌及背景中的物质为蓝色。
二 等电点学说 酒精可使细胞壁脱水，间隙变小，
三 化学学说 通透性降低，阻碍结晶紫-碘复合
物渗出；
革兰氏阴性菌细胞壁结构比较
疏松，肽聚糖层很薄，外膜、脂 蛋白、脂多糖均含有大量脂质， 易被酒精溶解，致使细胞壁通透 性增高，细胞内的结晶紫-碘复合 物被酒精溶解洗出而脱色。
原理
一 通透性学说
二 等电点学说
常用微生物染色方法
泰兴市人民医院检验科微生物室 刘鸿丽
1、革兰染色 2、抗酸染色 3、墨汁染色
革兰氏染色
革兰氏染色原理
一 通透性学说 二 等电点学说 三 化学学说
LPS 磷壁酸
肽聚糖层 磷脂层
G- / G+ 细菌细胞壁比较示意图
革兰氏阳性菌细胞壁结构比较
原理
致密，肽聚糖层很厚，脂类含量
一 通透性学说 较少，酒精不易渗入，而且95％
三 化学学说
革兰氏阳性菌等电点（pH 23）比革兰氏阴性菌等电点 （pH 4-5）低，加之媒染剂 碘为弱氧化剂能降低革兰氏 阳性菌的等电点，因此在同 样的pH的染色环境中，阳性 菌所带负电荷比阴性菌多， 与带正电荷的结晶紫染料能 牢固结合，不易被酒精脱色。
微生物学实验-1 口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏染色
G-细菌
G+细菌
革兰氏染色机理
G+细菌由于细胞壁较厚、肽聚糖含量较高和其分子交联 度较紧密，故在用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔会因脱水而 明显收缩，因不含脂类，故乙醇处理不能在壁上溶出缝 隙，因此，结晶紫与碘复合物仍牢牢阻留在其细胞内， 使其呈现紫色。 G-细菌因其壁薄、肽聚糖含量低和交联松散，故遇乙醇后， 肽聚糖网孔不易收缩，加上它的类脂含量高，所以当乙 醇把类脂溶解后，在细胞壁上就会出现较大的缝隙，结 晶紫与碘的复合物极易被溶出细胞壁，因此，通过乙醇 脱色后，细胞又呈无色。这时再经番红复染，就使G-细 菌染成红色，而G+细菌仍呈紫色。
实验材料
试剂：
蒸馏水； 石碳酸复红染液；香柏油；
二甲苯
光学显微镜、灭菌牙签、载玻片
实验方法
滴水 刮取牙垢 涂片 自然干燥 火焰固定
革兰氏染色或 复红染色1分钟 水洗 干燥
镜检（油镜）
口腔微生物染色操作步骤
实验结果
注意事项
1. 载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。
2. 取样时只需轻刮牙齿表面，肉眼可见少许牙垢 即可，滴水不宜过多，以免干燥时间过长；涂 片不宜过厚，以免水洗不完全造成背景杂乱。 3. 自然干燥后再进行火焰固定（以玻片不烫手为 宜）。 4. 染色过程中勿使染色液干涸。
实验目的
实验原理
微生物学实验-1
实验材料
实验方法 实验结果 注意事项 实验报告
实验一 细菌的革兰氏染色
思考题
实验目的
1. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌 分类鉴定中的重要性。 2. 学习并掌握革兰氏染色技术，进一步 熟练光学显微镜油镜的使用技术。
实验原理
革兰氏染色法（Gram staining） 是微生物学中常用的一种染 色方法，该染色法由丹麦医 生（Christian Gram）于1884 年创立，故名。
几种常用的微生物染色方法汇总
·健康科学·几种常用的微生物染色方法汇总黄波因微生物细胞比较小且透明，在普通的光学显微镜下不容易进行观察。
染色以后微生物细胞会与背景形成比较鲜明的色差，从而可以清楚地观察到微生物的形态，有利于鉴别、强化细化或细胞组分与周围环境之间产生的反差，方便利用普通光学显微镜对微生物细胞进行观察的简便方法。
一、微生物染色原理因微生物细胞含有大量的水分，所以对光线的吸收、反射及水溶液之间的差异不明显，机体属于无色、透明样，且与周围的环境背景之间也没有明显的反差，在普通的光学显微镜下不容易进行识别，所以必须对微生物进行染色，经过染色以后，菌体会与背景有明显色差的形成，才能更加清楚地观察到其形态与结构。
微生物细胞主要是有由蛋白质、核酸等两性电解质以及其他的化合物所组成，所以会表现出两性电解质的性质。
而两性电解质又兼具了碱性基、酸性基，在酸性溶液当中，会解离出含有碱性基呈碱性带正电；在碱性溶液当中，会解离出酸性基呈酸性带负电。
经过测定后，细菌等电pH值在2~5之间，所以在中性、碱性或是偏酸性的溶液中，细菌的等电点均小于上述中溶液的pH值，因此，细菌是带负电荷，容易和带正电荷的碱性染料相互结合，所以应用碱性染料色的比较多。
此外，微生物体内的各种结构的结合力与染料不同，所以可以使用各种染料对微生物的结构分别进行染色，便于观察。
二、染料的种类与选择染料可以分为2种类型：①天然染料，包含胭脂虫红、地衣素、石蕊、苏木素等，大部分都是从植物中所提取的，成分较为复杂。
②人工染料，又被称为煤焦油染料，大部分都是从焦煤油中所提取的，属于苯的衍生物。
大部分染料都属于带色有机酸或是碱类，有的也与有机溶剂相溶，为了使其能够在水中易溶，通常会把它们制作成盐类。
染料按照电离后的染料离子，所带的电荷性质，将其可分为以下几种类型。
（一）酸性染料该类染料进行电离以后，染料离子带负电，例如伊红、刚果红、苯胺黑等，可以和碱性的物质进行结合，成为盐；当培养基为糖类，而分解产酸的时候会使pH值下降，同时细菌所带的正电荷会增加，这时应该选择酸性染料，微生物容易被染色。
大肠菌群革兰氏染色具体方法
大肠菌群革兰氏染色具体方法在微生物学领域，大肠菌群的革兰氏染色法是一种常用的方法，它可以帮助我们区分细菌的种类和特性。
具体操作步骤如下：首先，取适量的大肠菌群样品，将其放入95%的乙醇中，然后搅拌均匀，静置10分钟。
这一步的目的是让细菌固定在样本中，便于后续的染色操作。
接下来，从乙醇固定的菌液中取一滴，滴加革兰氏染液。
革兰氏染液是由结晶紫染液和碘溶液混合而成的，它可以将细菌染色，使其在显微镜下更容易观察。
在滴加革兰氏染液后，轻轻搅拌均匀，然后静置1分钟，让染色充分进行。
第三步，用滤纸过滤染液，弃去初滤液，留下次滤液。
这一步的目的是去除多余的染料，以便进行下一步的操作。
在第四步中，取一滴次滤液，滴加95%的乙醇，轻轻混匀后静置10秒钟。
乙醇的作用是脱色，使细菌染色后的颜色更加清晰。
随后，用滤纸过滤，弃去初滤液和次滤液，留下脱色后的细菌悬液。
在第五步中，取一滴脱色后的细菌悬液，滴加番红复染液（稀），轻轻搅拌均匀，静置1分钟。
番红复染液可以使细菌重新着色，同时增强细菌的对比度，便于观察。
第六步，用滤纸过滤，弃去初滤液和次滤液，留下复染后的细菌悬液。
此时，细菌已经完成了革兰氏染色，呈现出鲜明的紫色。
最后，在第七步中，取一滴复染后的细菌悬液，涂抹在载玻片上，然后加盖盖玻片。
这样，我们就得到了一个革兰氏染色后的样本。
最后一步是进行镜检，通过显微镜观察染色后的细菌形态和结构，从而进行进一步的分析和研究。
革兰氏染色法在微生物学领域具有广泛的应用，其主要优点如下：1.染色效果鲜明：革兰氏染色法能使大肠杆菌呈现出鲜明的紫色，便于观察和区分。
2.染色步骤简单：革兰氏染色法的操作步骤相对简单，容易掌握，适用于各种实验条件。
3.染色时间短：整个革兰氏染色过程仅需数分钟，有利于提高实验效率。
4.适用范围广泛：革兰氏染色法不仅适用于大肠杆菌的染色，还可用于其他类型细菌的染色。
革兰氏染色法在微生物学领域的应用主要包括：1.临床检测：革兰氏染色法可用于临床样本中细菌的检测，如痰液、尿液、血液等，有助于临床医生诊断感染性疾病。
常见的三种微生物染色方法
常见的三种微生物染色方法学院：生命科学专业：生物科学年级：2010级姓名：王亚军摘要：在用普通光学显微镜观察细菌时，往往要先将细菌进行染色，借助于颜色的反衬作用，可以更清楚地观察细菌的形状及某些细胞的结构。
通过对细菌的简单染色可初步认识细菌的形态特征；通过革兰氏染色可将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性;通过对细菌的芽孢染色可初步了解芽孢杆菌的形态特征。
通过这三种常见的微生物染色方法，可对微生物的形态结构进行观察。
关键词：染料革兰氏染色无菌技术芽孢引言：学会油镜的使用；学会对细菌进行涂片；学习无菌操作技术；学会革兰氏染色法及芽孢染色法；了解芽孢杆菌的形态特征，观察押宝的形态、大小、着生位置。
用于为生物染色的染料，是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。
发色基团赋予化合物颜色的特征，助色基团则给予化合物能够成盐的性质仅含发色基团的苯化合物（称色原）即使带有颜色也不能作为染料，因为它不能电离，不能与酸或碱形成盐，对微生物没有结合力，很容易被洗脱或机械方法除去。
染料通常都是盐，分酸性染料和碱性染料两大类，但在微生物染色中，碱性染料较常用。
常用的碱性染料有美蓝、结晶紫、碱性复红、番红、孔雀绿等。
实验内容：一、细菌的简单染色1、原理：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，碱性染料在电离时，其分子染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。
故可用单一的碱性染料对细菌进行染色。
2、器材：（1）仪器：显微镜、酒精灯等（2）实验材料：菌种：枯草芽孢杆菌四联球菌染色剂：齐氏石碳酸复红染液3、操作步骤：（1）先将载玻片洗净，擦干。
（2）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴生理盐水，无菌从斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀，涂成薄膜，越薄越好，注意取菌不要太多。
（3）晾干：让涂片自然晾干。
(4)固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。
(5)染色：滴加染液于涂片上，然也刚好覆盖涂片薄膜即可。
微生物的制片染色技术
微生物的制片染色技术微生物的细胞含水量大（一般可达80～90％或更高），菌体薄而透明，折光性强，因此，除观察活细胞外，绝大多数情况下，都必须经过染色才能在显微镜下观察。
至于细菌的特殊结构——鞭毛、芽孢、荚膜，以及真菌的有性或无性孢子等，均需经特殊方法染色后，才能进行观察。
细菌的制片染色细菌涂片的制作与简单染色涂片制作：在干净载片上加清水1滴，用接种环（或牙签）取纯培养菌种（或牙垢等含菌标本）少许，与水混匀，涂布成薄层，在酒精灯火焰上方微热烘干，杀死菌体并使其固定在载片上。
注意：载片一定要清洁无油，即水滴可均匀散开，不收缩；取样要适当，不可过多；涂片要薄而均匀，干后呈淡乳白色、半透明状；烘干过程载片背面保持温热。
简单染色：在涂片上滴1滴复红或其他染色液，染色1分钟，倾去染料，用水沿玻片一侧轻轻冲去多余染料，擦干载片背面及周围水渍，风干，镜检。
此方法用于观察细菌外形及大小。
革兰氏染色细菌学中广泛使用的一种染色方法。
用于鉴别细菌，可将细菌分为革兰氏染色阳性及革兰氏染色阴性两大类。
染色步骤：用上述方法制备细菌涂片，干燥后，加结晶紫1滴，初染1分钟，用水冲去多余的染料；稍干后，加媒染剂卢戈氏碘液2～3滴，固定1～2分钟，用水冲去碘液；稍干后，加95％酒精1～2滴，脱色20～30秒，迅速用水冲洗（此时革兰氏阳性菌紫色，阴性菌无色）；滴加0.5％番红1滴复染1分钟，使被脱色的阴性菌着色。
镜检时，阳性菌紫色，阴性菌红色。
革兰氏染色的关键为酒精脱色，脱色过轻，阴性菌脱不掉紫色；若脱色过重，阳性菌的紫色也会脱掉。
因此，染色时首先应制好薄而均匀的涂片，并掌握好脱色时间。
此外还应注意菌龄，某些革兰氏染色阳性菌，其老龄菌常呈阴性反应，因此，染色用菌种应是24小时内的培养物。
特殊结构染色细菌的鞭毛、芽孢、荚膜等特殊结构，必须用特殊方法才能使其着色。
芽孢染色：芽孢壁较厚，染料不易透过，但着色后亦不易脱色。
芽孢染色一般需用培养24～48小时的菌种，涂片风干后，加5％孔雀绿染液3～5滴，用酒精灯微火加热至出现蒸气（不断补充染液，使其保持不干，也不沸腾），染色5～10分钟，冷却后，用水冲洗，再用0.5％番红液复染1分钟，水洗，风干后镜检。
微生物染色ppt课件
2.革兰氏染色法
是 1884 年由丹麦病理学家 C.Gram 所创立 的。革兰氏染色法是细菌学上最常用的鉴别 染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别 为革兰氏阳性菌（ G+ ）和革兰氏阴性菌（ G- ） 两大类。
2019
-
4
革兰氏染色法原理：
革兰氏染色法将细菌分为G＋和G- ，这由两类细菌细胞壁的结构和 组成的不同而决定。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作 为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫-碘的复合物，增强了染料与菌体的 结合力。用乙醇脱色处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。G＋细菌 的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、类脂含量低，用 乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低，使得结晶 紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染仍然保持 初染剂的蓝紫色。G-细菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含 量高，所以在脱色处理时，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使 结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染 上复染剂的颜色。
绘出枯草杆菌和大肠杆菌的形态图，并注明 两菌的革兰氏染色的反应性。
1 ．你认为哪些环节会影响革 兰氏染色结果的正确性？其中最关 键的环节是什么？ 2 ．当你对一株未知菌进行革 兰氏染色时，怎样能确证你的染色 技术操作正确，结果可靠？
2019 11
实验二
细菌的芽孢染色
实验目的
1、继续学习微生物标本的制作方法；
2019 2
单染色步骤
1．涂片 取一块载玻片，用记号笔划分出两区域 并做上记号，在两区域中央各滴半滴无菌水，用接种 环以无菌操作法分别取两种菌种在左右两滴水中，和 匀后涂成薄膜。 2．干燥 室温自然干燥或吹干。 3．固定 涂面朝上，通过火焰2~3次。 4．染色 在涂片薄膜上滴加结晶紫染液，使之覆 盖2分钟。 5．水洗 傾倒去染液，斜置载玻片，用洗瓶小水 流沿玻片边缘冲洗，直至水呈无色为止。 6．干燥 室温自然干燥或用吸水纸吸干。