标准的PCR反应体系
PCR反应体系
反 应 体 系
PCR
镁离子
引物及探针 模板
06
PCR buffer
PCR反应缓冲液的目的是给Taq DNA聚合酶提供一 个最适酶催反应条件。
成分 Tris-HCl KCl NH4+ 小牛血清白蛋白 明胶 Tween 20 二硫苏糖醇（DTT） 浓度 10-50mmol/L ≤50mmol/L 16.6mmol/L 100μg/ml 0.01% 0.05% ～0.1% 5mmol/l 有助于酶的稳定，提高试 剂的稳定性。 作用 平衡ph值 利于引物的退火（产率比 较高） 特异性比较好
的提高了扩增的准确性内参基因是为了平衡不同模板之
间的差异。加入浓度50μ L体系加入0.1μ L 25μ M ROX， 终浓度为versetranscripatase）是以RNA为模板指
导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。 ROX（ROX Reference Dye）一般用于ABI、 Stratagene等公司的Real Time PCR扩增仪上。用于消 除信号本底以及效正孔之间产生的荧光信号，最大限度
Taq酶
Taq酶是从水生栖热菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中分 离出的具有热稳定性的DNA聚合酶。
5'到 3'合成 DNA能力 普通Taq酶 有 5'到 3'外 切酶活性 有 3'到 5'外 切酶活性 无 3'端加A
延伸速度
有
2000base/min
热启动Taq酶
有
有
无
有
2000base/min
P C R 反 应 体 系
PCR 原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）是指在DNA聚合酶催化下， 以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等 步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
pcr反应体系成分包括哪些
PCR反应体系成分包括哪些PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学研究中广泛使用的技术，用于扩增DNA 片段。
PCR 反应体系是指用于进行 PCR 反应的混合物，包括一系列关键成分，这些成分能够在温度变化下促使 DNA 的复制。
PCR 反应体系的核心成分包括 DNA 模板、引物、聚合酶、dNTPs 和缓冲液。
1. DNA 模板DNA 模板是在 PCR 反应中需要扩增的目标 DNA 片段。
这个片段可以是从细菌、动植物或人类中提取的 DNA。
PCR 的目标是在体系中扩增所需的特定 DNA 片段，因此DNA 模板是非常重要的。
2. 引物引物是两个短的 DNA 片段，它们是针对目标 DNA 片段的起始序列设计的。
引物在PCR 反应中起到了引导 DNA 复制的作用。
引物具有与目标 DNA 片段的两端互补的序列，它们会结合到目标 DNA 上，并作为 DNA 合成的起始点。
在 PCR 反应中，引物存在过量，以确保目标 DNA 片段的扩增。
3. 聚合酶聚合酶是一种酶类，它在 PCR 反应中起到关键的作用。
最常用的聚合酶是来自热泛菌属中的一种酶——特伦酶（Taq DNA polymerase）。
Taq 聚合酶具有耐高温的特性，因此适合在高温下进行 PCR 反应。
其他聚合酶如Pfu聚合酶、Tfl聚合酶也常用于特定的PCR。
聚合酶能够结合引物，从而将新的 DNA 链合成一个完整的双链 DNA。
4. dNTPsdNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）是 DNA 合成过程中所需的构建块。
它们分别代表脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞苷酸（dCTP）和脱氧胸苷酸（dTTP）。
在 PCR 反应体系中，dNTPs 以平衡的比例存在，以供 DNA 复制过程中的新链合成。
5. 缓冲液缓冲液是一种溶液，用于保持 PCR 反应的酶和其他组分的稳定性，以及调节反应体系的 pH 值。
缓冲液的成分通常包括一些盐和缓冲剂，如 Tris-HCl 和 KCl。
pcr反应体系组成
pcr反应体系组成
聚合酶链反应（PCR）是一种高效的DNA扩增技术，它可以在几小时内将少量DNA扩增
到可以检测的水平。
PCR反应体系由多种成分组成，包括DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+和反应缓冲液。
DNA模板是PCR反应的核心，它是要扩增的DNA片段。
它可以是一段DNA片段，也可
以是一个基因。
引物是一种特殊的DNA分子，它可以与DNA模板特异性结合，并且可以
被DNA聚合酶所识别。
DNA聚合酶是一种酶，它可以将DNA模板和引物结合，并将其
扩增。
dNTPs是一种核苷酸，它可以与DNA聚合酶一起将DNA模板和引物结合，从而实现DNA扩增。
Mg2+是一种金属离子，它可以促进DNA聚合酶的活性，从而提高PCR反
应的效率。
反应缓冲液是一种溶液，它可以维持PCR反应的稳定性，并保持反应的最佳
条件。
PCR反应体系是一种复杂的体系，它由多种成分组成，包括DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+和反应缓冲液。
它们之间的相互作用可以实现DNA的高效扩增，为后
续的基因分析提供了重要的基础。
标准的pcr反应体系
标准的pcr反应体系PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种分子生物学技术，它可以在体外大量复制DNA片段。
PCR反应是在一定的条件下，通过DNA引物和DNA聚合酶，使目标DNA片段在体外迅速扩增，是分子生物学研究中常用的技术手段之一。
标准的PCR反应体系包括以下几个方面：1. DNA模板，PCR反应的第一步是添加待扩增的DNA模板。
这可以是从细胞中提取的基因组DNA，也可以是经过纯化的质粒DNA或PCR产物。
DNA模板的质量和纯度对PCR反应的效果有很大影响，因此在使用之前需要进行质检和定量。
2. 引物，PCR反应需要两个引物，它们分别位于待扩增DNA片段的两端。
引物的设计需要考虑到目标DNA的序列，确保引物能够特异性地结合到目标DNA 上。
此外，引物的长度和碱基组成也需要符合一定的要求，以保证PCR反应的效率和特异性。
3. DNA聚合酶，PCR反应中使用的DNA聚合酶通常是热稳定的，能够在高温下保持活性。
常用的DNA聚合酶有Taq聚合酶和Pfu聚合酶等。
在PCR反应中，DNA聚合酶起着复制DNA的作用，能够在高温下将引物结合到DNA模板上，并在适当的条件下合成新的DNA链。
4. 缓冲液，PCR反应需要在特定的pH和离子浓度条件下进行，因此需要添加合适的缓冲液来维持反应体系的稳定性。
常用的PCR缓冲液包括Tris-HCl缓冲液和KCl缓冲液等。
5. 脱氧核苷酸（dNTPs），PCR反应需要四种脱氧核苷酸作为DNA合成的原料，它们分别是脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胸苷酸（dCTP）和脱氧胸嘧啶酸（dTTP）。
在PCR反应中，这些脱氧核苷酸会被DNA聚合酶利用，与引物结合到DNA模板上，合成新的DNA链。
6. 离子，PCR反应中需要适当的离子浓度来维持DNA聚合酶的活性，通常通过添加Mg2+离子来实现。
Mg2+离子的浓度对PCR反应的效果有很大影响，需要根据具体的引物和DNA模板来进行优化。
标准的PCR反应体系
标准的PCR反应体系PCR反应体系与反应条件标准的PCR反应体系:10X扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umolL引物各10〜100mol模板DNA01 〜2ugTqDNA聚合酶25ug2+15mmolL加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTR模板和g2+引物：引物是PCR寺异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30b ，常用为20b 左右。
②引物扩增跨度：以200-500b为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3' 端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCF失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度01〜lumol或10〜100mol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种TqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR反应约需酶量2。
5U（指总反应体积为100ul 时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
PCR反应体系包括哪些成分组成
PCR反应体系包括哪些成分组成引言聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是一种重要的分子生物学技术，可用于放大DNA序列片段。
PCR在生物医学研究、遗传学分析、病毒检测、法医学等领域具有广泛的应用。
了解PCR反应体系的成分组成对于正确使用和优化PCR实验至关重要。
PCR反应体系成分组成PCR反应体系由若干关键成分组成，包括DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTPs （脱氧核苷酸三磷酸盐）、缓冲液以及水。
下面将逐个介绍这些组成成分。
DNA模板DNA模板是PCR反应的起始物质，它含有待扩增的目标DNA序列。
DNA模板可以是基因组DNA、cDNA（反转录合成的DNA）或已知DNA序列等。
PCR反应通过保温循环中的高温和低温步骤来模拟DNA复制过程，从而使DNA模板得以扩增。
引物引物是PCR反应中的两个短链DNA分子，它们与目标DNA序列的两端互补结合。
引物提供了扩增反应的起始位点，使聚合酶能够在该位点上开始合成DNA链。
引物的选择非常关键，它们的长度、碱基组成和互补性需要经过仔细设计和优化。
DNA聚合酶DNA聚合酶是PCR反应中的关键酶，它能够在合适的反应条件下，以DNA模板为引导，在引物的作用下合成新的DNA链。
常用的DNA聚合酶包括热稳定聚合酶（如Taq聚合酶）和高保真度聚合酶（如Pfu聚合酶）。
这些聚合酶具有耐高温的特性，从而使PCR反应的扩增步骤在高温条件下进行。
dNTPsdNTPs是PCR反应中DNA合成的原料，它们是脱氧核苷酸的三磷酸盐。
dNTPs包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP，它们在PCR反应中与DNA聚合酶一起合成新的DNA 链。
dNTPs在PCR过程中为新合成的DNA提供了所需的碱基。
缓冲液缓冲液是PCR反应中的重要成分，它用于调节PCR反应体系的pH值，维持酶的活性，提供适宜的离子环境和缓冲性能。
常用的PCR缓冲液包括Tris-HCl缓冲液、KCl缓冲液等。
pcr反应体系的基本构成
pcr反应体系的基本构成PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，它能够在体外迅速扩增特定DNA片段。
PCR反应体系的基本构成包括引物、DNA模板、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）、聚合酶、缓冲液和水。
引物是PCR反应中的关键组成部分，它是DNA的两条链的起始序列，能够指示扩增特定DNA片段的位置。
引物一般由合成寡核苷酸组成，长度通常为18-30个碱基。
在PCR反应中，引物与DNA模板的两个互补序列结合，作为DNA聚合酶的起始点。
DNA模板是PCR反应中的待扩增的DNA片段，可以是从细胞中提取的基因组DNA，也可以是经过特定方法提取和纯化的DNA片段。
DNA 模板的质量和纯度对PCR反应的结果有重要影响，因此在PCR反应前需要对DNA模板进行质检和纯化处理。
dNTPs是PCR反应中的四种脱氧核苷酸三磷酸盐，分别是dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
它们是DNA合成的基本单元，在PCR反应中起到提供碱基的作用。
dNTPs的浓度需要适当控制，过高或过低都会影响PCR反应的效果。
聚合酶是PCR反应中的关键酶，它能够在适宜的温度下，在DNA模板和引物的指导下，合成新的DNA链。
常用的聚合酶有Taq聚合酶和Pfu聚合酶，它们具有高度的热稳定性和DNA聚合酶活性，适用于PCR反应的高温环境。
缓冲液是PCR反应中必不可少的成分，它可以维持PCR反应体系的pH值和离子浓度稳定，提供适宜的反应环境。
常用的PCR缓冲液包括Tris-HCl缓冲液和KCl缓冲液。
水是PCR反应体系中的溶剂，它起到稀释其他反应成分和提供体积的作用。
水的质量和纯度对PCR反应的结果有一定影响，因此需要使用去离子水或高纯水。
除了上述基本构成外，PCR反应中还可以添加其他辅助成分，如Mg2+离子、PCR增效剂和引物嵌合物等。
Mg2+离子是聚合酶活性的必需离子，能够稳定DNA双链结构和提供DNA结合的稳定性。
PCR 增效剂可以提高PCR反应的效率和特异性，减少非特异性扩增产物的生成。
pcr标准反应体系
pcr标准反应体系PCR标准反应体系。
PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种分子生物学技术，用于扩增DNA片段。
PCR标准反应体系是PCR技术中非常重要的一环，它的稳定性和准确性直接影响到PCR扩增的结果。
本文将介绍PCR标准反应体系的组成和影响因素。
PCR标准反应体系由DNA模板、引物、酶、缓冲液、dNTPs和水组成。
其中，DNA模板是待扩增的DNA片段，引物是用于识别目标DNA序列的寡核苷酸片段，酶是用于DNA合成的酶，缓冲液用于维持反应体系的pH值，dNTPs是四种脱氧核苷酸，用于DNA合成，水则是PCR反应的溶剂。
这些组分的比例和质量都会对PCR反应的效果产生影响。
首先，DNA模板的质量和浓度会直接影响到PCR扩增的效果。
如果DNA模板的质量不好或者浓度过低，会导致PCR扩增产物稀少或者根本无法扩增。
因此，在进行PCR反应前，需要对DNA模板进行质量和浓度的检测，以确保PCR反应的准确性和稳定性。
其次，引物的设计和浓度也是影响PCR反应的重要因素。
引物的设计需要考虑到目标DNA序列的特点，如GC含量、碱基序列等，以确保引物能够特异性地识别目标DNA序列。
引物的浓度过高或者过低都会影响到PCR反应的效果，因此需要进行引物的优化实验，确定最佳的引物浓度。
酶是PCR反应中的关键因素之一，不同的酶具有不同的特性，如热稳定性、扩增速率等。
选择合适的酶对PCR反应的效果至关重要。
同时，酶的浓度也需要进行优化实验，以确定最佳的酶浓度。
缓冲液的选择和pH值的调节可以影响PCR反应的特异性和效率。
不同的缓冲液具有不同的缓冲能力和离子强度，因此需要根据实验需求选择合适的缓冲液。
同时，缓冲液的pH值也需要进行调节，以确保PCR反应在最适宜的pH条件下进行。
dNTPs是PCR反应中必不可少的组分，它们是DNA合成的基本原料。
因此，dNTPs的质量和浓度也会对PCR反应产生影响。
需要注意的是，dNTPs的浓度过高或者过低都会影响到PCR反应的效果，因此需要进行优化实验，确定最佳的dNTPs浓度。
pcr反应体系应包含哪些成分和作用方式
PCR反应体系应包含哪些成分和作用方式引言聚合酶链反应（PCR）是一种强大的技术，用于扩增DNA序列。
PCR反应体系由不同的成分组成，每个成分都具有重要的作用。
本文将详细介绍PCR反应体系的每个成分以及它们的作用方式。
PCR反应体系成分和作用方式模板DNA模板DNA是PCR反应的起点，它是需要被扩增的DNA序列。
模板DNA可以来自各种来源，例如细菌、动植物、人类等。
在PCR反应中，模板DNA充当被扩增的目标，通过引导链式反应，最终产生大量的DNA产物。
引物（primers）引物是PCR反应中的两个短DNA链，它们通过碱基对的互补配对与目标DNA序列结合。
引物的选择非常重要，因为它们确定了目标DNA序列的起始点和终止点。
引物在PCR反应体系中作为DNA合成的起始物，引导扩增过程的进行。
DNA聚合酶DNA聚合酶是PCR反应体系中的关键酶。
它能够识别引物，将游离的核苷酸与目标DNA序列的碱基互补配对，并进行链式反应。
最常用的DNA聚合酶是来自热液单胞菌Thermus aquaticus的Taq聚合酶。
Taq聚合酶在高温下仍然保持活性，适用于PCR反应中的高温退火和DNA扩增。
dNTPsdNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）是PCR反应体系中的四种单核苷酸单元，包括脱氧腺嘌呤核苷酸（dATP）、脱氧胸腺嘧啶核苷酸（dTTP）、脱氧鸟嘌呤核苷酸（dCTP）和脱氧鳟嘌呤核苷酸（dGTP）。
它们是DNA链式反应的合成材料，在PCR反应中提供了新的DNA碱基单位。
缓冲液缓冲液是PCR反应体系中的一种溶液，用于维持适宜的酸碱度和离子浓度。
合适的酸碱度和离子浓度可以提供最佳的DNA聚合条件，以确保PCR反应的准确性和高效性。
高温退火PCR反应通常包含多个温度阶段，其中一个关键阶段是高温退火。
在高温退火过程中，反应体系的温度被升高以使引物与目标DNA序列结合。
高温退火阶段的温度通常比目标DNA序列的熔解温度略低，以确保引物能够特异性地结合目标DNA。
PCR反应体系包含哪几种成分,
PCR反应体系包含哪几种成分PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学中广泛应用的技术，可快速扩增DNA 片段。
PCR反应体系是进行PCR实验时所需的各种试剂的组合，包括几种重要的成分。
下面将介绍PCR反应体系中的几个主要成分。
基本PCR反应体系成分1.DNA模板：PCR反应的目标是扩增特定的DNA片段，因此需要将待扩增的DNA作为反应体系的一部分。
DNA模板可以是来自细胞的基因组DNA，也可以是经过特定方法纯化的目标DNA片段。
2.引物：PCR反应中的引物是两个短的DNA序列，与待扩增DNA片段的两端序列互补。
引物的作用是指导DNA聚合酶在扩增过程中的特异性引物结合和合成新链的起始。
引物的设计对PCR反应的特异性和成功与否至关重要。
3.DNA聚合酶：PCR反应中最重要的酶是DNA聚合酶，常用的是具有高热稳定性的热稳定DNA聚合酶，如Taq聚合酶。
这种酶可以在高温下活性稳定，适合PCR 反应的温度循环。
4.双脱氧核苷酸三磷酸（dNTPs）：PCR反应需要四种单个脱氧核苷酸（dATP、dCTP、dGTP和dTTP）作为DNA聚合酶合成新链所需的原料。
它们在PCR反应体系中以三磷酸形式存在。
5.缓冲液：PCR反应体系中的缓冲液是为了调节反应体系的pH值和离子强度，提供合适的环境条件使DNA聚合酶活性最高。
常用的缓冲液包括Tris-HCl缓冲液。
6.Mg2+：镁离子是DNA聚合酶活性的重要辅因子，它能够稳定聚合酶与dNTPs的结合，促进引物与DNA模板的结合。
PCR反应需要在反应体系中添加适量的Mg2+。
其他PCR反应体系常见成分1.BSA：牛血清蛋白（BSA）是一种常用的PCR反应体系添加剂。
BSA的存在可以提高PCR反应的特异性和扩增效率，减少非特异性扩增的产生。
2.DMSO：二甲基亚砜（DMSO）可用于提高PCR反应的特异性和扩增效率，特别是对GC含量较高的DNA片段。
DMSO还可以降低反应温度的影响，提高反应的灵敏度。
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标准的PCR反应体系PCR反应体系与反应条件--------------------------------------------------------------------------------标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umolL引物各10～100mol模板DNA 01～2ugTqDNA聚合酶25ug2+ 15mmolL加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和g2+引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30b，常用为20b左右。
②引物扩增跨度：以200-500b为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度01～1umol或10～100mol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种TqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR反应约需酶量2。
5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。
dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1NH或1Tris。
HCL的缓冲液将其PH调节到70～75，小量分装，-20℃冰冻保存。
多次冻融会使dNTP降解。
在PCR反应中，dNTP应为50～200umolL，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。
浓度过低又会降低PCR产物的产量。
dNTP能与g2+结合，使游离的g2+浓度降低。
模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。
SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。
提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。
一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。
RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNse降解RNA。
g2+浓度g2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umolL时，g2+浓度为15～20mmolL为宜。
g2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
PCR反应条件的选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。
在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。
对于较短靶基因(长度为100～300b时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度TqDNA酶仍有较高的催化活性)。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。
一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。
此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。
变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。
由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。
退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。
对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)复性温度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允许围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。
复性时间一般为30～60se，足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间：TqDNA聚合酶的生物学活性：70～80℃150核苷酸S酶分子70℃60核苷酸S酶分子55℃24核苷酸S酶分子高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb 以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。
3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
循环次数循环次数决定PCR扩增程度。
PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。
一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
PCR技术概论聚合酶链反应(PolymerseCinReion,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。
它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。
过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。
PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。
PCR技术简史PCR的最早设想核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korn于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆RNA基因”。
PCR的实现1985年美国PE-Ceus公司人类遗传研究室的ullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。
其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。
PCR的改进与完善ullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶的Kleno片段，其缺点是：①Kleno酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。
②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。
此种以Kleno酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Kleno酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。
这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。
1988年初，Keonog改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。
但每循环一次，仍需加入新酶。
1988年Siki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(ermusquius)中提取到一种耐热DNA 聚合酶。
此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2后其残留活性是原来的40%。
②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。
③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(20Kb)。
由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。
为与大肠杆菌多聚酶Kleno片段区别，将此酶命名为TqDNA多聚酶(TqDNAPolymerse)。
此酶的发现使PCR广泛的被应用。
PCR技术基本原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
到达平台期(Pleu)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。
反应最终的DNA扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。
平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。
反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。