PCR反应体系
标准的PCR反应体系
标准的PCR反应体系PCR的反应体积一般有：10、20、25、40、50、100μl（一般不要低于10μl，体积过少会影响扩增效率及产物得率）PCR反应体系与反应条件--------------------------------------------------------------------------------标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umolL引物各10～100mol模板DNA 01～2ugTqDNA聚合酶25ug2+ 15mmolL加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和g2+引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30b，常用为20b左右。
②引物扩增跨度：以200-500b为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度01～1umol或10～100mol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
pcr反应体系成分包括哪些
PCR反应体系成分包括哪些PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学研究中广泛使用的技术，用于扩增DNA 片段。
PCR 反应体系是指用于进行 PCR 反应的混合物，包括一系列关键成分，这些成分能够在温度变化下促使 DNA 的复制。
PCR 反应体系的核心成分包括 DNA 模板、引物、聚合酶、dNTPs 和缓冲液。
1. DNA 模板DNA 模板是在 PCR 反应中需要扩增的目标 DNA 片段。
这个片段可以是从细菌、动植物或人类中提取的 DNA。
PCR 的目标是在体系中扩增所需的特定 DNA 片段，因此DNA 模板是非常重要的。
2. 引物引物是两个短的 DNA 片段，它们是针对目标 DNA 片段的起始序列设计的。
引物在PCR 反应中起到了引导 DNA 复制的作用。
引物具有与目标 DNA 片段的两端互补的序列，它们会结合到目标 DNA 上，并作为 DNA 合成的起始点。
在 PCR 反应中，引物存在过量，以确保目标 DNA 片段的扩增。
3. 聚合酶聚合酶是一种酶类，它在 PCR 反应中起到关键的作用。
最常用的聚合酶是来自热泛菌属中的一种酶——特伦酶（Taq DNA polymerase）。
Taq 聚合酶具有耐高温的特性，因此适合在高温下进行 PCR 反应。
其他聚合酶如Pfu聚合酶、Tfl聚合酶也常用于特定的PCR。
聚合酶能够结合引物，从而将新的 DNA 链合成一个完整的双链 DNA。
4. dNTPsdNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）是 DNA 合成过程中所需的构建块。
它们分别代表脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞苷酸（dCTP）和脱氧胸苷酸（dTTP）。
在 PCR 反应体系中，dNTPs 以平衡的比例存在，以供 DNA 复制过程中的新链合成。
5. 缓冲液缓冲液是一种溶液，用于保持 PCR 反应的酶和其他组分的稳定性，以及调节反应体系的 pH 值。
缓冲液的成分通常包括一些盐和缓冲剂，如 Tris-HCl 和 KCl。
标准的pcr反应体系
标准的pcr反应体系PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种分子生物学技术，它可以在体外大量复制DNA片段。
PCR反应是在一定的条件下，通过DNA引物和DNA聚合酶，使目标DNA片段在体外迅速扩增，是分子生物学研究中常用的技术手段之一。
标准的PCR反应体系包括以下几个方面：1. DNA模板，PCR反应的第一步是添加待扩增的DNA模板。
这可以是从细胞中提取的基因组DNA，也可以是经过纯化的质粒DNA或PCR产物。
DNA模板的质量和纯度对PCR反应的效果有很大影响，因此在使用之前需要进行质检和定量。
2. 引物，PCR反应需要两个引物，它们分别位于待扩增DNA片段的两端。
引物的设计需要考虑到目标DNA的序列，确保引物能够特异性地结合到目标DNA 上。
此外，引物的长度和碱基组成也需要符合一定的要求，以保证PCR反应的效率和特异性。
3. DNA聚合酶，PCR反应中使用的DNA聚合酶通常是热稳定的，能够在高温下保持活性。
常用的DNA聚合酶有Taq聚合酶和Pfu聚合酶等。
在PCR反应中，DNA聚合酶起着复制DNA的作用，能够在高温下将引物结合到DNA模板上，并在适当的条件下合成新的DNA链。
4. 缓冲液，PCR反应需要在特定的pH和离子浓度条件下进行，因此需要添加合适的缓冲液来维持反应体系的稳定性。
常用的PCR缓冲液包括Tris-HCl缓冲液和KCl缓冲液等。
5. 脱氧核苷酸（dNTPs），PCR反应需要四种脱氧核苷酸作为DNA合成的原料，它们分别是脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胸苷酸（dCTP）和脱氧胸嘧啶酸（dTTP）。
在PCR反应中，这些脱氧核苷酸会被DNA聚合酶利用，与引物结合到DNA模板上，合成新的DNA链。
6. 离子，PCR反应中需要适当的离子浓度来维持DNA聚合酶的活性，通常通过添加Mg2+离子来实现。
Mg2+离子的浓度对PCR反应的效果有很大影响，需要根据具体的引物和DNA模板来进行优化。
pcr实验原理
pcr实验原理PCR实验原理PCR（聚合酶链式反应）是一种在体外扩增DNA的技术，它可以在短时间内从微量的DNA样本中产生大量的DNA复制物。
PCR技术已经广泛应用于基因工程、医学诊断、法医学和生物学等领域。
本文将从以下几个方面详细介绍PCR实验的原理。
1. PCR反应体系PCR反应体系主要由模板DNA、引物、聚合酶、缓冲液和dNTPs等组成。
其中模板DNA是需要扩增的目标序列，引物是用来定位目标序列起始点和终止点的短链寡核苷酸，聚合酶是催化DNA合成的酶类，缓冲液提供了适宜pH值和离子强度来维持聚合酶活性，dNTPs是四种脱氧核苷三磷酸。
2. PCR扩增过程PCR扩增过程分为三个步骤：变性、退火和延伸。
（1）变性：将双链DNA加热至95℃左右使其解旋成两条单链模板。
（2）退火：降温至引物与模板相互结合的最佳温度，引物与模板的互补碱基序列结合形成双链DNA。
（3）延伸：在聚合酶的催化下，dNTPs与单链模板互补配对形成新的DNA链，引物向外延伸，产生两条新的单链DNA。
这个过程会不断重复，每次扩增会产生一倍的DNA片段。
3. PCR反应条件PCR反应条件包括温度、时间和反应体系组分浓度等因素。
其中最关键的是温度控制。
变性阶段需要高温95℃左右；退火阶段需要适当降温至引物与模板互补碱基序列结合的最佳温度；延伸阶段需要适宜的延伸时间和温度。
同时，反应体系组分浓度也需要控制在一定范围内。
4. PCR扩增产物PCR扩增产物是目标序列在PCR反应中被扩增出来的DNA片段。
其大小由引物长度和目标序列长度决定。
PCR扩增产物可以通过琼脂糖凝胶电泳等方法进行检测，并可用于后续实验。
5. PCR技术优点PCR技术具有快速、灵敏、特异性强、扩增量大等优点，可以从微量的DNA样本中扩增出足够多的DNA，可用于检测罕见基因突变和病原体等。
此外，PCR技术还可以进行定量PCR、实时PCR和逆转录PCR等不同类型的实验。
总结PCR技术是一种重要的分子生物学技术，其原理简单易懂，应用广泛。
标准的PCR反应体系
标准的PCR反应体系PCR反应体系与反应条件标准的PCR反应体系:10X扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umolL引物各10〜100mol模板DNA01 〜2ugTqDNA聚合酶25ug2+15mmolL加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTR模板和g2+引物：引物是PCR寺异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30b ，常用为20b 左右。
②引物扩增跨度：以200-500b为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3' 端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCF失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度01〜lumol或10〜100mol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种TqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR反应约需酶量2。
5U（指总反应体积为100ul 时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
PCR反应体系与反应条件
PCR 反应体系与反应条件标准的 PCR 反应体系：10 X扩增缓冲液10ul4 种 dNTP 混合物各 200umol/L引物各10〜100pmol模板 DNA 0.1〜2ugTaq DNA 聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ulPCR 反应五要素：参加 PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、 dNTP 、模板和 Mg2+引物：引物是 PCR 特异性反应的关键， PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA 互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度： 15-30bp ，常用为 20bp 左右。
②引物扩增跨度：以 200-500bp 为宜，特定条件下可扩增长至 10kb 的片段③引物碱基： G+C 含量以 40-60% 为宜， G+C 太少扩增效果不佳， G+C 过多易出现非特异条带。
ATGC 最好随机分布，避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物 3' 端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致 PCR 失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.1〜lumol或10〜100pmol ,以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
PCR反应体系与反应条件
PCR反应体系与反应条件标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至100ul上述体系为100ul，实验中一般用50ul体系，即以上所有试剂减半。
也可根据Taq酶说明书上的推荐配方。
PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
A TGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
(最新整理)PCR反应体系
模板
➢ 单、双链DNA均可。 ➢ 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、
DNA结合蛋白类。 ➢ DNA模板使用量一般为20-200ng。 ➢ 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 ➢ RNA模板注意保证其防止RNA降解。
其他成分
➢ RNasin（RNase Inhibitor）的作用：RNA酶 抑制剂，抑制RNA酶的活性。
➢ UNG酶的作用原理是选择性水解断裂含有dU 的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成 的有缺失碱基的DNA链，在碱性介质以及高 温下会进一步水解断裂，从而被消除。UNG 酶的最佳活性温度为50℃，95℃灭活。
其他成分
➢ 反转录酶（Reversetranscripatase）是以RNA为模板指 导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。
PCR反应体系
PCR 原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）是指在DNA聚合酶催化下， 以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等 步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
01 PCR buffer
PCR
02 Taq酶
反 应
03 dNTPs
非特异性 产物减少 扩增
导致错配 产物减少
Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的 浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
引物及探针
➢ 引物是人工合成的一段寡核苷酸序列。一般为20 个碱基。
➢ 引物的序列与模板结合的特异性是决定PCR反应 结果的关键。
➢ 探针是人工合成的在两端分别标记荧光基团的一 段寡核苷酸序列。
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反 应 体 系
PCR
镁离子
引物及探针 模板
06
PCR buffer
PCR反应缓冲液的目的是给Taq DNA聚合酶提供一 个最适酶催反应条件。
成分 Tris-HCl KCl NH4+ 小牛血清白蛋白 明胶 Tween 20 二硫苏糖醇（DTT） 浓度 10-50mmol/L ≤50mmol/L 16.6mmol/L 100μg/ml 0.01% 0.05% ～0.1% 5mmol/l 有助于酶的稳定，提高试 剂的稳定性。 作用 平衡ph值 利于引物的退火（产率比 较高） 特异性比较好
的提高了扩增的准确性内参基因是为了平衡不同模板之
间的差异。加入浓度50μ L体系加入0.1μ L 25μ M ROX， 终浓度为versetranscripatase）是以RNA为模板指
导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。 ROX（ROX Reference Dye）一般用于ABI、 Stratagene等公司的Real Time PCR扩增仪上。用于消 除信号本底以及效正孔之间产生的荧光信号，最大限度
Taq酶
Taq酶是从水生栖热菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中分 离出的具有热稳定性的DNA聚合酶。
5'到 3'合成 DNA能力 普通Taq酶 有 5'到 3'外 切酶活性 有 3'到 5'外 切酶活性 无 3'端加A
延伸速度
有
2000base/min
热启动Taq酶
有
有
无
有
2000base/min
P C R 反 应 体 系
PCR 原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）是指在DNA聚合酶催化下， 以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等 步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
01
PCR buffer
02 Taq酶
03 04 05 dNTPs
DNA模板使用量一般为20-200ng。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 RNA模板注意保证其防止RNA降解。
其他成分
RNasin（RNase Inhibitor）的作用：RNA酶 抑制剂，抑制RNA酶的活性。 UNG酶的作用原理是选择性水解断裂含有dU 的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成 的有缺失碱基的DNA链，在碱性介质以及高 温下会进一步水解断裂，从而被消除。UNG 酶的最佳活性温度为50℃，95℃灭活。
引物及探针
引物是人工合成的一段寡核苷酸序列。一般为20 个碱基。 引物的序列与模板结合的特异性是决定PCR反应 结果的关键。 探针是人工合成的在两端分别标记荧光基团的一 段寡核苷酸序列。 探针的特异性及退火温度对反应体系影响很大。
模 板
单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、 DNA结合蛋白类。
高保真Taq酶
有
无
有
无
600base/min
Mg2+和dNTPs
作用 Mg2+ TaqDNA聚合 酶是Mg2+依赖 性酶 浓度 1.5～ 2.0mmol/L 偏高 偏低
非特异性 产物减少 扩增 导致错配 产物减少
dNTPs
DNA合成的原 50～ 200umol/L 料
Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的 浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。