荧光定量PCR反应体系配制
miRNA荧光定量PCR试剂盒说明书
HG miRNA SYBR Green PCR KitHG miRNA荧光定量PCR试剂盒Cat.No.:APXXXXX Size: 100次×20 μl描述：HaiGene的HG miRNA SYBR Green PCR Kit使用Peter改良的miR-Q技术，采用特异性的上下游引物对反转录所得miRNA的cDNA产物进行定量检测【参考文献1】。
不同于其它公司的单条特异性引物扩增方法，HaiGene采用双向特异性扩增引物（原理如图1），从而极大提高了miRNA的检测特异性，其可以区分极高相似度的miRNA分子、减少非特异性扩增（图2，3所示）。
该试剂盒对可以对任何miRNA分子进行检测。
HG miRNA荧光定量PCR试剂盒共有一万余种，试剂盒编号为APXXXXX，每一个miRNA分子对应一个检测试剂盒，可于HG miRNA qPCR kit.xls中查询。
如果您研究的mircoRNA分子不在我们的列表中，请来信咨询，我们将及时给您优化设计。
该试剂盒中的每一对引物均经过设计优化，确保扩增效率和特异性。
使用该方法进行miRNA 定量检测已被大量文献所采用【参考文献2～11】。
组分储存：避光置于-20°C，可保存2年；避免反复冻融注：其它miRNA荧光定量检测试剂盒见HG miRNA qPCR kit.xls。
图1：Peter改良miR-Q检测原理图图2：高效的扩增miRNAs图3：有效的区分相似度很高的miRNAsHG miRNA SYBR Green PCR KitHG miRNA荧光定量PCR试剂盒Cat.No.:APXXXXX Size: 100次×20 μl操作方法1. 按以下组分配制反转录反应液microRNA（0.01-0.1 μg）or Total RNA 0.1-2 μg4×One step miRNA RT Solution 5 μl*10×miRNA RT Primer 2 μlRnase Free H2O Up to 20 μl2. 在PCR仪上按以下条件进行反应:37°C 60min95°C 5min3. 获得cDNA产物后使用HG miRNA荧光定量PCR试剂盒进行miRNA定量检测。
RT-PCR 荧光定量理论
RT-PCR反应体系 反应体系： 1 RT-PCR反应体系： 1.1 模板 作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外 转录的RNA产物。模板RNA最常见的问题是RNA 降解或混有基因组DNA。 1.2 逆转录酶 1.3 DNA聚合酶 1.4 引物
RT-PCR方法 2 RT-PCR方法 2.1 一步法：即反转录和PCR扩增在同一管内 完成， 有助于减少污染，灵敏度更高 2.2 两步法：即反转录和PCR扩增分两步进行， 首先从RNA模板反转录得到cDNA，得到的 cDNA再进行一次或多次不同的PCR反应。
两个概念： 两个概念： 荧光阈值：在荧光扩增曲线上人为设定的一 个值，为了便于对所检测样本进行比较， 它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意 位置上，一般这个阈值是以PCR反应的前15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号 （baseline）,荧光域值的缺省设置是 315 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。 如果检测到荧光信号超过阈值被认为是真 正的信号。 CT 值：每个反应管内的荧光信号到达设定的 阈值时所经历的循环数被称为 CT 值
图 1 实时荧光扩增曲线图 荧光扩增曲线可以分成三个阶段： 荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平 台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖， 台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判 断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。 断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。 PCR 的终产物 量与起始模板量之间没有线性关系， 量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， 之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。 之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。
荧光定量pcr
荧光定量PCR( realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。
原理PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
荧光定量PCR 实验步骤：样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12000rpm离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。
混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR目前实时荧光定量PCR已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、SNP分析等......荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBR Green I 的非特异性方法和Taqman水解探针的特异性方法SYBR Green I 的非特异性方法(试剂盒：LightCycler 480 SYBR Green I Master）SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。
在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。
因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA数量。
一、实验前准备：实验试剂及耗材：试剂：特异性PCR引物，新鲜提取备用的总RNA试剂盒:Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、LightCycler 480 SYBR Green I Master1号管包含：热启动Taq DNA Polymerase、反应缓冲液、dNTP mix、SYBR Green I染料、MgCI2仪器及耗材：罗氏LightCycler 480全自动实时定量PCR仪以及配套使用的48或96孔板；Thermo Scientific Arktik PCR仪、F1单道移液器、冰盒、QSP盒装吸头等正式实验开始前，冰上解冻各个试剂【注意：SYBR Green I Master 需要避光放置】二、反转录实验操作时注意：所有RNA相关的操作均需要佩戴手套，防止RNase污染。
严格按照试剂盒使用说明进行相关操作。
按照体系配方在冰上的Rnasefree的灭菌PCR管中配置Templateprimer mix，总体系13ul。
本实验是联合使用anchored oligo dT引物和随机六聚体引物进行的反转录。
荧光定量PCR原理
荧光定量PCR原理PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
①浓度测定A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。
样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。
具体计算如下：RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或0.84 μg/μl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为：35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
2）变性琼脂糖凝胶电泳测定28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。
还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。
在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。
RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。
实时荧光定量pcr的方法
实时荧光定量pcr的方法实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qPCR），也称为荧光定量PCR，是一种常用于检测和定量DNA或RNA的分子生物学技术。
相比传统的PCR方法，实时荧光定量PCR具有更高的灵敏度、准确性和特异性，能够量化目标核酸序列的含量。
实时荧光定量PCR的原理主要包括PCR反应的进行和荧光信号的检测与实时监测。
PCR反应是通过逐渐升高的温度循环，使DNA链解链、引物与模板相互结合，合成新的DNA链，不断扩增目标序列的过程。
荧光信号的检测是通过加入特定的荧光探针，在PCR反应过程中的每个循环都量化目标序列的含量，并以荧光信号的强度来表示。
下面将详细介绍实时荧光定量PCR的方法及其一般步骤。
1. 样品处理与提取：首先需要从待测样品中提取出目标DNA或RNA的模板，并进行适当的处理。
比如，可以使用细胞裂解液或提取试剂盒来裂解和纯化细胞或组织中的核酸。
2. 反转录：对于需要检测的RNA目标，需要先将其反转录为cDNA。
这一步骤通常使用反转录酶和适当的引物，在一定的温度条件下合成cDNA。
反转录反应通常在37-42C进行。
3. 扩增反应体系制备：根据实验需要和反应装置的规格，配制好PCR反应的体系。
体系中的成分通常包括模板DNA（cDNA或DNA模板）、引物（前向引物和逆向引物）、荧光标记探针（如TaqMan探针）、聚合酶（如Taq DNA聚合酶）、dNTPs等。
4. PCR扩增条件设置：根据模板DNA的长度和序列特性，设置PCR反应的温度和时间条件。
通常，PCR反应的温度包括初始变性（95C）、扩增（56-72C）和延伸（72C）等多个循环。
5. 荧光信号的检测与实时监测：PCR反应过程中，可以通过专用的实时荧光定量PCR仪器进行检测和监测。
这类仪器常常能够实时记录PCR反应的荧光信号强度，并产生实时的反应曲线图。
根据荧光信号的强度变化，可以推断目标DNA 或RNA的含量。
实时荧光定量PCR技术
荧光定量PCR过程
一 体系配制
组分名称 10×buffer（Tri-Hcl、 ( NH4)2SO4、K+、Mg2+等） 作用 缓冲液-提供反应环境
引物mix
探针mix Taq酶（10U/ul） UNG酶（1U/ul） dNTPs（dATP、dTTP、 dCTP、dGTP、dUTP）20mM H2O
四 数据分析
• 从核酸的提取到实验结果的获得，中间的步骤繁多，因而影响反应的因 素也很多，主要包括：反应体系，模板的浓度与纯度，Mg2+浓度，引物 与探针的浓度，反应循环数，Taq酶活性，扩增程序等。因而实验结果 也会出现各种各样的问题，主要包括：信号强度低，扩增效率低，特异 性低，体系稳定性差等。
• 反应过程
MGB探针
• 新型TaqMan探针，其3`端采用了非荧光性的淬灭基团，吸收报告基团的 能量后并不发光，大大降低本底信号的干扰。此外MGB探针3`端还连接 了一个小沟结合物--二氢环化吲哚卟啉-三肽，可以大大稳定探针与模 板的杂交，提高探针Tm值，使得较短的探针也能达到较高的Tm值，淬灭 效果更好，荧光背景更低。
TaqMan探针
利用Taq酶的5`外切活性，即Taq酶具有天然的5`-3`核酸外切酶活性 ，能水解双链DNA 5`端的核苷酸。 依据目的基因设计一条能与之特异杂交的探针，5`端标记报告基团 Reporter，3`端标记淬灭基团Quencher，正常情况下两个基团的空间距离 很近，构成FRET关系，荧光基团信号被淬灭。PCR扩增时，引物与探针结 合到模板上，探针位于上下游引物之间。当扩增延伸到探针结合的位置时 ，Taq酶利用5`-3`外切酶活性，将探针5`端连接的荧光分子从探针上切割 下来，破坏了两个荧光分子的FRET关系，从而发出荧光。
荧光定量pcr检测步骤
荧光定量pcr检测步骤嘿，朋友们！今天咱就来唠唠荧光定量PCR 检测步骤这档子事儿。
你想想看啊，这就好比一场奇妙的旅程。
首先呢，咱得把要检测的样本准备好，这就像是给旅程准备行囊，可不能马虎呀！样本得纯净，不能有杂七杂八的东西捣乱。
然后呢，就是设计引物啦！这引物就像是旅程中的指南针，得特别精准，才能指引我们往正确的方向走。
设计得不好，那可就容易迷路啦，检测结果也会乱七八糟的。
接下来，就是配制反应体系啦！各种试剂就像旅途中的伙伴，得搭配好，让它们和谐共处，共同发挥作用。
这可不是随便倒倒就行的，得精确再精确。
再之后，把样本和反应体系混合好，放进PCR 仪里。
这PCR 仪啊，就像是旅程中的交通工具，带着我们的样本和反应体系一路前行。
在这个过程中，温度会不断变化，就像车子在不同的路况下行驶一样。
在 PCR 仪里跑了一段时间后，就到了检测荧光信号的时候啦！这荧光信号就像是旅途中的美景，我们得仔细观察，不能错过任何一个精彩瞬间。
嘿，你说这荧光定量 PCR 检测是不是很有意思？就像一次充满挑战和惊喜的冒险！每一步都得小心翼翼，却又充满期待。
要是哪一步出了差错，那可就前功尽弃啦！所以啊，做这个检测的时候，可得打起十二分的精神来。
就像你去旅行，总不能稀里糊涂的吧！得认真准备，认真对待每一个环节。
你想想，如果因为自己的不小心，导致检测结果不准确，那得多郁闷呀！这可关系到很多重要的事情呢，比如疾病的诊断、科学研究的进展。
哎呀，说了这么多，相信你对荧光定量 PCR 检测步骤也有了一定的了解啦！总之，认真对待，就像对待生活中的每一件重要事情一样，准没错！希望大家都能在这个奇妙的检测世界里顺利前行，得到准确又可靠的结果哟！。