ABI公司测序仪
ABI Solid Sequencing
ABI SOLid SequencingSolid技术Solid测序技术是ABI公司于2007年开始投入用于商业测序应用的仪器。
它基于连接酶法，即利用DNA连接酶在连接过程之中测序。
它的原理是：图a. Solid测序技术1.DNA文库构建片段打断并在片段两端加上测序接头，连接载体，构建单链DNA文库。
2.Emulsion PCRSolid的PCR过程也和454的方法类似，同样采用小水滴emulsion PCR，但这些微珠比起454系统来说则要小得多，只有1um。
在扩增的同时对扩增产物的3’端进行修饰，这是为下一步的测序过程作的准备。
3’修饰的微珠会被沉积在一块玻片上。
在微珠上样的过程中，沉积小室将每张玻片分成1个、4个或8个测序区域（图a）。
Solid系统最大的优点就是每张玻片能容纳比454更高密度的微珠，在同一系统中轻松实现更高的通量。
3.连接酶测序这一步是Solid测序的独特之处。
它并没有采用以前测序时所常用的DNA聚合酶，而是采用了连接酶。
Solid连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物，这里将其简单表示为：3’-XXnnnzzz-5’。
连接反应中，这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对。
探针的5’末端分别标记了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM这4种颜色的荧光染料（图a）。
这个8碱基单链荧光探针中，第1和第2位碱基（XX）上的碱基是确定的，并根据种类的不同在6-8位（zzz）上加上了不同的荧光标记。
这是Solid的独特测序法，两个碱基确定一个荧光信号，相当于一次能决定两个碱基。
这种测序方法也称之为两碱基测序法。
当荧光探针能够与DNA模板链配对而连接上时，就会发出代表第1，2位碱基的荧光信号，图a和图b中的比色版所表示的是第1，2位碱基的不同组合与荧光颜色的关系。
在记录下荧光信号后，通过化学方法在第5和第6位碱基之间进行切割，这样就能移除荧光信号，以便进行下一个位置的测序。
Illumina、454、ABI测序仪比较
Illumina 、454 、ABI 测序仪比较Illumina 测序仪Illumina 公司的新一代测序仪Genome Analyzer 最早由Solexa 公司研发，利用其专利核心技术“DNA 簇”和“可逆性末端终结（reversible terminator ）”，实现自动化样本制备及基因组数百万个碱基大规模平行测序。
Illumina 公司于2007年花费6亿美金的巨资收购了Solexa ，就是为了促成Genome Analyzer 的商品化。
Genome Analyzer 作为新一代测序技术平台，具有高准确性，高通量，高灵敏度，和低运行成本等突出优势，可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学以及功能基因组学 （基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。
Genome Analyzer 自上市以来，已经为千人基因组计划立下了赫赫战功。
今年早期，荷兰科学家利用它首次绘出女性的基因组图谱。
而就在前两周，家利用它首次绘出女性的基因组图谱。
而就在前两周，《《Nature 》杂志上一连出现三个人类基因组图谱：炎黄一号-第一个亚洲人图谱；第一个癌症病人图谱；第一个非洲人图谱。
它们全是依赖Genome Analyzer 完成的。
哗，一下就来仨！这和第一个人类基因组图谱的13年形成了多么鲜明的对照。
根据去年底的数据，Genome Analyzer 已售出约200台，估计是市场占有率最广的。
前不久，华大基因再添置了12台，准备放在香港和深圳的实验室，至此华大基因已经有29台Genome Analyzer 。
而著名的麻省理工学院和哈佛大学Broad 研究院拥有47台Illumina 测序仪。
众多实验室之所以选择Illumina ，看中的无疑是Genome Analyzer 的高性价比。
上个月，Illumina 将Genome Analyzer II 升级到Genome Analyzer IIx ，距年底实现单次运行获得95 GB 数据的宏伟目标又近了一步。
ABI 3500xL基因分析仪操作流程
ABI 3500xL基因分析仪操作流程一、标准测序反应（一）质粒测序标准实验流程1．对质粒DNA的质量和浓度要求纯度：OD 260/OD 280= 1.6~2.0，用量：每反应150~300 ng。
2．测序PCR 反应标准反应体系：3．测序产物纯化：使用Edge Bio收集柱进行纯化。
（1）离心850g，3min柱子，弃掉收集管，换新的EP管。
（2）将待纯化样品加到柱子中间，注意不要加到离心柱侧壁上。
（3）离心850g，3min，弃掉柱子，即得纯化产物。
（4）取10 µL Hi-Di Formamide加入96孔板中，再加入10 µL待测样品，振荡混匀离心。
（二）PCR 产物测序标准实验流程1．对PCR 产物的要求纯度：OD 260/ OD280=1.6~2.0，用量：每反应10~100 ng。
强烈建议在测序前，先纯化PCR产物。
2．PCR产物的测序PCR 反应标准反应体系：3．测序产物纯化：方法同上。
二、上机测序（一）启动系统1.打开电脑，检查电脑右下角处3500监控状态是否正常启动。
2.打开3500 xL仪器电源，等待仪器自检，指示灯由黄色变为绿色即为自检完成。
3.启动电脑桌面Data collection software。
4.检查维护提醒：浏览维护提醒，若已完成点击。
5.检查耗材状态：点击“Refresh”，更新后检查仪表盘上各种耗材的状态（POP7、ABC、CBC和毛细管），若指示针在可用范围内则可继续，若在指示针在红色区域中，则需更换耗材后再继续。
6.仪器预热：点击仪表盘上的“Start Pre-heat”按钮预热炉子和泳道。
（二）放置待测样品1. 检查确保橡胶隔板均通透后，将其小心盖在加有待测样品的96孔板上，注意孔对孔盖好。
2. 将板子放入板架中，盖好固定盖，确保所有孔都一一对齐，即组装好测序板子。
3. 按仪器的TRAY按钮，使托盘出仓，之后将组装好的板子放入自动采样器中，注意有标记的一侧面对操作者。
ABI3730xl型测序仪日常维护标准操作规程(SOP)
检查胶瓶中的胶以确认有足够的胶完成实验
每天或每次实验前
检查泵胶块和下胶块以确认其未松动
每天
清洁仪器表面、实验台表面
每天
检查毛细管旋钮，连接管螺帽和阀门以防止泄露
每天
每星期
维护工作
频率
使用Change Polymer向导换胶
每星期或需要时
检查旧毛细管的储存条件
每星期
使用注射器抽取20ml去离子水，清洗泵头的密封圈
每次实验前
更换溶液槽中的Buffer和水，确认槽的外围是干燥的
每48小时或每20个runs
更换water和waste溶液槽中的水，确认槽的外围是干燥的
每天或每20个runs
检查泵上下block、连接管、胶管和各通道中是否有气泡，使用Bubble Remove向导除去气泡
每天或每次实验前
检查毛细管的取样末端以确认其未损坏
每星期
使用去离子水浸泡胶垫，用自来水冲洗后再用去离子水洗一遍
每星期或需要时
每月
维护工作
频率
运行Water Wash向导，不管有无气泡，冲洗毛细管端口
每月或需要时
检查旧毛细管的储存条件
每月或需要时
每年
维护工作
频率
对机器内部进行除尘清洁，光路校正等整体保养
每年或需要时
需要时
维工作
频率
清洁漏液托盘
需要时
更换毛细管
需要时
去除毛细管末端已经干掉的胶，使用双蒸水湿润的无纤维布
需要时
使用无屑的棉球沾上无水乙醇轻轻擦拭毛细管检查窗口两端
每季度或空间、光谱校正时
ABI3730xl型测序仪日常维护标准操作规程(SOP)
ABI公司相关仪器简介
• 触摸屏
• 多种规格：
样品基座升降温速度3.9℃5 ℃ /s
见微知著 去伪存真
60-Well 96-Well & 96-Well Fast 384-Well
Genetic Analyzer
• 1986年全球第一台测序仪370 373 377 310（1996年，第一台毛细管） 3100-avant, 3100 3130, 3130xl （中、高通量） 3730， 3730xl（生产规模）
见微知著 去伪存真
7500 Real-Time PCR System
见微知著 去伪存真
• 五色荧光技术 • 新型光路设计检测更
多荧光标记FAM™/SYBR®
Green I, VIC®/JOE, NED™/ TAMRA™/ Cy3®, ROX™/Texas
Red®,和Cy5®
• 96-well • Standard-小于2hs
降温速度4.1℃/s
• 9700技术
• 2h 25min • 26*52*30，12kg • GeneAmp 快速PCR
通用试剂&96孔快速 反应板
见微知著 去伪存真
Veriti TM Thermal Cycler
• PCR仪的革新
• 9700 & VeriFlex TM Blocks——6个独立的温 度模块
见微知著 去伪存真
Thank You！
见微知著 去伪存真
见微知著 去伪存真
2720 Thermal Cycler
样品基座升降温速度 2.7℃/s
• 9700技术
• 价格优惠
• 小巧21*36*22，6.1kg， 散热装置在仪器后面
• 可计算Tm值，确定引物 的退火温度
abi测序仪的测序原理和操作规程
ABI型DNA测序仪的测序原理和操作规程DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。
自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。
美国PE ABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。
本实验介绍的是ABI PRISM 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。
【原理】 ABI PRISM310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3''''''''末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。
由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。
分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。
它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。
PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。
这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。
它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。
ABI_3730xl测序仪简介-01
基因分型
2008年基因分型样本量为30000个； STR,SNP,CNV遗传标记
ABI 3730xl测பைடு நூலகம்仪简介
生物医学研究院 5楼 联系电话：54237651 联系人：夏明英，李士林
主要特性（一）
- 内置一体化自动进样器及样品孔打孔装置； - 内置样品板条形码自动识别； - 100次（9600个样品）运行试剂一次上机； - 自动碱基识别与质量评分判定； - 动态铂金内镀毛细管壁；
12406G
4833T 10646G 4491C
7028T
12705T 14569G
5301T 15607A 9824A 5178A
4715T 5417G 3010T 4216T 663A 11719A
3730xl的总结
基因检测：
2008年对4万个样本进行测序
检测碱基数达到2千4百万个
现可检测的PCR产物长度为600-1000bp
- 氩离子激光光源； 实现实时的、空间连续的测量；可以保证返回的光信息能够达到探测的量级。 激发波长为488nm和514.5nm
毛细管规格: 96道毛细管 毛细管长度: 50cm 凝胶的规格: POP-7液体分离胶
配套的试剂: 基因测序(BigDye3.1v和5×Sequence buffer)
1000样本
10小时
测序的原理
DNA测序的双脱氧链末端合成终止法. Sanger法测序的原理：
用DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终 止核苷酸为止。 每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱 氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸 (ddNTP)。 由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地 在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种 dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱 基的链终止产物。 它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率 变性凝胶电泳分离大小不同的片段进行检测。
常用的五种基因测序仪器的比较
四、测序仪之——ROCH-454
SOLID的双碱基编码矩阵
两个碱基共同决定一 个颜色，可以极大的 提高测序的准确率
五轮测序反应反应后，按照第0、1位，第1、2 位... …的顺序把对应于模板序列的颜色信息连起来， 就得到由“0，1，2，3…”组成的SOLiD原始颜色序 列。
2. ABI SOLID的特性
• 无以伦比的通量 目前SOLiD 3系统单次运行能产生50 GB的人基因 组序列数据，相当于基因组的17倍覆盖度，这显 然是其他任一台新一代测序系统都无法达到的
测序仪器 3730XL
所采用测序技术
鸟枪Sanger测 序法 毛细管 电泳技术
校错方法
高通量
主要用于KB～MB 级别的测序
ABI SOLiD 微乳液PCR扩增 双碱基编码
连接酶法测序
技术
最高可达180 GB
优势方面
常规测序， 高准确度
第二代测 序仪中准 确度最高
Solexa GA
桥式PCR技术 合成测序法
加入DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。 每个循环掺入单个碱基。用激光扫描反应板表 面，读取所聚合上去的核苷酸种类。之后，将 这些基团化学切割，恢复3′端粘性，继续聚合第 二个核苷酸。如此继续下去，直到每条模板序 列都完全被聚合为双链。这样，就可以得知每 个模板DNA片段的序列。
桥式PCR
2. Illumina GA的特性
上市时间
2002年 2007年 1月
2007年
2005年 2008年
2月
ABI3130测序仪技术指标
3130 技术指标1.工作条件1.1温度要求：15-30℃1.2湿度要求：20-80%1.3电源：220-240V+/- 10%,50-60Hz +/- 10%2.总则全自动遗传分析仪可用于DNA序列测定、序列比较和基因型自动分析和SNP分析。
3.主要技术指标3．14道全自动毛细管电泳系统3．2采用激光光源双束激发装置，保证能量信号高度均一。
3．3检测系统采用高灵敏度的低温CCD装置3．4光栅同步分光装置，更换染料不必更换硬件设备3．5全球专利的五色荧光检测技术3．6自动灌胶装置、自动上样装置3．7局部恒温的检测部件3．8可实现24小时无人监控连续运行3．9一块板可同时进行测序和片段分析3．10一种管子一种胶可同时进行测序和片段分析（测序性能技术要求）3．11DNA序列分析精度98.5％或以上，长度可达950bp或以上3．1224小时测序量达164样品数以上，碱基数>82,0003．13测序试剂可常规做不少于16倍稀释3．14有针对困难模板的专用试剂盒3．15有针对人类功能基因再测序的配套试剂盒系统3．16有通用于1400多种细菌和900多种真菌分型的微生物鉴定试剂盒（片段分析技术要求）3．17可同时进行5色荧光的实时检测3．18片段分析分辨率：精确度达±0.15bp；3．19可进行大规模STR研究，24小时可分析1万个以上STR基因型。
3．20可进行大规模SNP的系列研究，24小时可进行1.5万个SNP分析。
3．21电泳操作温度：18℃-65℃，适合进行变性胶电泳的SSCP突变分析。
3．22有基于STR的全基因组连锁分析和疾病基因定位研究的全套引物和配套试剂盒。
3．23有适用于亲子鉴定和个体识别的法医配套试剂盒，通过FBI认证3．24有适用于单泳道10/48重SNP位点检测的配套试剂盒数据分析软件要求3．25测序软件要求：每一碱基判读均有国际公认的质量评分系统（Phred Q20），精确度达98.5%真实反映峰高比例，能精确自动辨认杂合子位置，不漏检采用Oracle数据库，满足高通量分析，24小时测序分析达84,000碱基数3．26序列比对、拼接软件：SeqScape2.1，适合于不同生物种类基因组快速检测变异位置全自动、高通量，无序列数量限制，自动批处理，可后期编辑，直接兼容Genebank文件格式3．27片段分析软件要求：高速、高通量，每小时可处理5万以上基因型可自动剔除干扰峰，不需要人工修正，输出表格简单易懂采用Oracle 数据库，可以大规模搜索和管理数据有现成五色荧光片段分析参数设置,可方便进行亲子鉴定，连锁分析，SNP分析3．28计算机工作站要求计算机工作站：处理器Pentium IV，2GHz，内存（RAM）1GB，Windows XP，彩色屏幕17英寸，硬盘双36GB，带有CD/RW光驱4.必备附件.,4.14道毛细管阵列：内径小，使用寿命达300次以上，有自动涂层功能4.2DNA测序分离介质：用量节省，容易分装，1ml可支持100个样品测序。
ABI 3730xl测序仪简介-01
基因分型
2008年基因分型样本量为30000个； STR,SNP,CNV遗传标记
测序的原理
DNA测序的双脱氧链末端合成终止法. Sanger法测序的原理：
用DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终 止核苷酸为止。 每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱 氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸 (ddNTP)。 由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地 在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种 dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱 基的链终止产物。 它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率 变性凝胶电泳分离大小不同的片段进行检测。
- 氩离子激光光源； 氩离子激光光源； 实现实时的、空间连续的测量；可以保证返回的光信息能够达到探测的量级。 激发波长为488nm和514.5nm 毛细管规格: 毛细管规格 96道毛细管 道毛细管 毛细管长度: 毛细管长度 50cm 凝胶的规格: 凝胶的规格 POP-7液体分离胶 液体分离胶 配套的试剂: 基因测序(BigDye3.1v和5×Sequence buffer) 配套的试剂 基因测序 和 × 基因分型(Liz120, Liz500, ROX500) 基因分型
SNP遗传标记在SnapSHot反应的结果
原理： 单碱基延伸,单碱基测序.利用延伸引物对PCR产物进行单个碱基的延伸,并引 入尾部的荧光.其荧光的颜色及其荧光出现的位置进行区分其基因型 SnapSHot技术优点： 可以研究样本量少,snp位点多,位点间物理距离较远的SNP检测.
13010G
13263A
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ABI公司测序仪的应用
, Ph.D.
Technical Product Specialist
chenyd@
提要
DNA测序仪应用概况
ABI遗传分析仪家族
1 4 16 48 96
测序仪三大功能
测序仪可以用来做什么？
Diagram from Celera Genomics
线粒体DNA测序
MITOMAP: A Human Mitochondrial Genome Database.
–Mouse Karyotype ZooWeb-Karyotypes home page Human Karyotype
医学测序
杂合子检测：发现新突变
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2006-11-17 |
© 2006 Applied Biosystems
细菌和真菌鉴定
MicroSeq® ID Analysis Software
MicroSeq® 500 16S Bacterial Identification Kit MicroSeq® D2 LSU Fungal Identification Kit
DNA Sequencing of the 16S ribosomal RNA gene Classification of Eubacteria, Yeasts,and Filamentous Fungi Sequence polymorphisms Bacterial category A biothreat agents Food pathogens Same day results
12
2006-11-17 |
© 2006 Applied Biosystems
SAGE™ Analysis
基因组范围的基因表达图式分析 鉴定转录子(mRNA)
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2006-11-17 |
© 2006 Applied Biosystems
基于测序的HLA配型
Donor / Recipient compatibility prior to tissue transplantation HLA typing products - distributed directly by Celera Diagnostics for research purposes only.
1-866-235-3723
/cdx/HLA_Typing
Referenced to GENBANK: HLA–C 6p21.3 major histocompatibility complex, class I, C.
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2006-11-17 |
© 2006 Applied Biosystems
功能强大的片段分析
• 片段长度多态性
• AFLP和T-RFLP
• BAC指纹图谱 • 相对荧光定量
• LOH和QMPSF
• 构象分析扫描突变
• SSCP和CSCE
• InVivoScribe B细胞和T细胞clonality • TILLING
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2006-11-17 |
© 2006 Applied Biosystems
相对荧光定量
细胞淋巴瘤(cell lymphomas) 及其他肿瘤中的等位基因丢失 染色体不平衡 部分和全部染色体丢失
LOH (Loss of Heterozygosity) P53 17p13.1
非遗传的in-vivo LOH
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2006-11-17 |
© 2006 Applied Biosystems
寻找新的SNP位点
Mutation Profiling - SNP Discovery and Analysis
17
2006-11-17 |
© 2006 Applied Biosystems
SNP扫描
SNPlex™ Genotyping System
SNaPShot® Multiplex System SNP Validation Linkage Mapping and Association Studies Pharmacogenomic Research
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2006-11-17 |
© 2006 Applied Biosystems
SSCP突变快速扫描
SSCP
Amplify region of interest Heat denature in HiDi formamide and NaOH
A T A T A T
G C G C
Rapidly chill and electrophoresis under non denaturing conditions
G
C
WT Wild Type
20
rfu
MUT
mobility
Mutant
© 2006 Applied Biosystems
2006-11-17 |
SSCP Workflow
Post PCR Purification
SSCP data on ABI 3130 Series
植物AFLP®分析
AFLP技术原理
AFLP工作流程
AB公司AFLP相关产品
AFLP Data Generated on AB Systems
Expt1:
Polymorphic peak
Common peak
Experiment 2: AFLP collaboration with U.S. customer
Customer Research Project Goals
Genotypes from AFLP Analysis of Hedysarum Lines
Hedysarum Variety Identification by AFLP Analysis
HO U5 01 09
HO U5 01 18
HO U5 01 11
HO U5 01 14
MicroSeq®细菌鉴定
500 bp试剂盒
全长基因试剂盒
FDA Draft Guidelines
分子生物学手段鉴定微生物
MicroSeq®Microbial Identification Kit
试剂盒组成
细菌鉴定策略
forward
reverse
MicroSeq®工作流程or
样品制备特别简单
MicroSeq®真菌鉴定真菌鉴定试剂盒
rDNA在真菌染色体上的排列
测序目标是D2
强项：MicroSeq®ID 软件
methylSEQr Bisulfite Conversion Kit 甲基化分析
重亚硫酸钠转化试剂盒
Applied Biosystems Products for Each Step of the Workflow
methylSEQr™Bisulfite Conversion Kit。