优化蛋白相互作用实验(一)
检测蛋白相互作用的方法
检测蛋白相互作用的方法
检测蛋白相互作用的方法主要有酵母双杂交技术、免疫共沉淀和GST pull-down实验。
1. 酵母双杂交技术：主要用来进行互作蛋白的筛选，缺点就是假阳性较高，所以需要进行结果验证，一般可采用免疫共沉淀或GST-pull down实验进行验证。
2. 免疫共沉淀：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。
当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。
再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行Western blot检测，进而证明两者间的相互作用。
3. GST pull-down实验：是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术。
其基本原理是先构建靶蛋白-GST融合蛋白载体，然后进行体外表达及纯化。
将得到的靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，充当一种“诱饵蛋白”，然后将目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的蛋白，将目的蛋白洗脱下来，通过SDS-PAGE电泳及Western blot分析证实两种蛋白间的相互作用。
以上内容仅供参考，建议查阅相关文献获取更专业的信息。
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上寒风凛冽，又到了一年一度写标书的季节，你开始准备了么？在分子机制的研究中，蛋白和蛋白之间的互作研究可以说是非常经典了，研究蛋白互作的方法有很多，今天我们来介绍九种。
1、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）CoIP其实就是两个蛋白相互的IP（免疫沉淀反应）实验，在已知蛋白B和C之间有相互作用的前提下，这种前提一般需要有一个酵母双杂实验或者Pulldown实验来作为支持。
IP就是用来验证蛋白C和蛋白B之间相互作用的。
如果在Agarose珠上的Protean A/G所结合的抗体，可以结合并拉下蛋白B，那用Western Blot即可检测出蛋白C的表达，反之亦然，通过这种相互间免疫共沉淀的实验，就可以明确地验证出，B与C之间的相互作用了。
比如这份标书：PYK2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin？（百度检索题目可查到全文）2、Pull-down实验这个实验跟免疫共沉淀实验很像，不同的是免疫共沉淀是在细胞里进行的，在众多的蛋白里，拉住A蛋白的同时,把B蛋白也给拉出来了，这还不能证明是直接的结合，很有可能是A 拉住了C，而C拉住了B，这样拉住A蛋白的同时也能把B蛋白也给拉出来。
要证明直接的结合就是Pull-down实验。
提纯所要研究的两个蛋白（一般是在BL21等菌种表达提纯），这两个蛋白带上不同的标签（提纯蛋白一般带GST或者HIIS标签），然后将他们放在同一个体系里，使用GST-beads或者NI-beads,把其中一个蛋白拉下来，用WB检测另一个蛋白的存在。
比如这份标书：恶性肿瘤的发生、发展的细胞表观遗传学机制。
（同样可以百度检索到全文）3、免疫荧光（Immunofluorescence，IF）——共定位将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。
由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。
通过荧光共振能量转移技术研究蛋白质相互作用的实验方案
通过荧光共振能量转移技术研究蛋白质相互作用的实验方案引言：蛋白质是细胞中最重要的生物大分子之一，其相互作用是细胞内各种生物过程的基础。
荧光共振能量转移技术（FRET）是一种重要的生物物理方法，可以用于研究蛋白质相互作用。
本文将介绍一种基于FRET技术的实验方案，用于研究蛋白质相互作用的机制。
一、实验原理荧光共振能量转移技术基于两个荧光染料之间的能量传递过程。
当两个荧光染料距离足够近并且能量传递的条件满足时，能量将从一个荧光染料转移到另一个荧光染料上，从而引起荧光信号的变化。
在蛋白质相互作用研究中，通常将感兴趣的蛋白质标记上两个荧光染料，一个作为受体，一个作为给体。
当两个蛋白质相互作用时，两个荧光染料之间的距离发生改变，从而引起FRET信号的变化。
二、实验步骤1. 蛋白质标记首先，选择适合的荧光染料，并将其共价地标记到感兴趣的蛋白质上。
这可以通过化学反应或基因工程技术实现。
确保标记的荧光染料在蛋白质结构中不会引起明显的结构改变，以保证实验结果的准确性。
2. 荧光光谱分析使用荧光光谱仪对标记的蛋白质进行荧光光谱分析。
通过测量给体荧光和受体荧光的光谱特性，确定荧光染料的最大激发波长和最大发射波长。
这些参数将在后续实验中用于选择适当的激发光和检测光。
3. FRET效率测定使用FRET效率测定实验，确定两个荧光染料之间的能量传递效率。
这可以通过测量给体荧光的减弱和受体荧光的增强来实现。
根据FRET效率的计算公式，可以得到两个荧光染料之间的距离。
4. 蛋白质相互作用实验将标记的蛋白质样品加入到含有适当缓冲液的反应体系中，使蛋白质相互作用。
然后使用荧光光谱仪或荧光显微镜等设备，测量FRET信号的变化。
根据FRET效率的变化，可以推断蛋白质相互作用的强度和机制。
三、实验注意事项1. 荧光染料的选择应考虑其激发和发射波长的重叠程度，以及在生物体系中的稳定性和光学性质。
2. 蛋白质标记的方法应选择对蛋白质结构影响较小的方法，避免影响实验结果的准确性。
蛋白相互作用Pull-Down实验
蛋白相互作用Pull-Down实验实验原理：Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。
是确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。
Pull-Down实验可用来检测已知的蛋白相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用。
用作诱饵的蛋白是重组蛋白，会含有一个用于纯化的亲和标签。
这个融合标签就是用于Pull-Down实验的基础。
最常见的标签为谷胱甘肽S-转移酶（GST）和多组氨酸（6×His）。
其分别使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金属螯合物亲和配体（如Ni2+和Co2+）。
实验准备：实验仪器：谷胱甘肽琼脂糖凝胶（镍离子琼脂糖凝胶）、离心机、实验材料：表达的含标签的纯化蛋白、细胞裂解液实验试剂：Binding Buffer/Washing Buffer: 4.2mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、140mM NaCl、10mM KClSDS loading Buffer: 50mM Tris-Cl(pH6.8)、2%SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油、10mM DTT裂解缓冲液：20mM Tris-Cl(pH8.0)、200mM NaCl、1mM EDTA（pH8.0）、0.5% Nonidet P-40 使用前加入加入蛋白酶抑制剂。
（蛋白酶抑制剂：2ug/ul抑肽酶（aprotinin）、1ug/ul白胃素（leupeptin）、0.7ug/ml胃酶抑素（pepstatin）、25ug/ml苯甲磺酰氟（PMSF））实验方法：方法一：1、预清除细胞裂解液：将细胞裂解液与50ul的50%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液和25ug GST在4℃混合孵育2h。
离心机12,000g在4℃离心2min。
将上清转移至新的离心管中。
2、探测细胞裂解液两个含等量预清除细胞裂解液及50ul谷胱甘肽琼脂糖球珠的微量离心管。
在一管中加约10ug的GST蛋白，另一管中加约10ug的GST融合探针蛋白。
检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术
检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术蛋白质之间的相互作用对于生物体的正常功能和生理进程至关重要。
因此，了解和研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用对于疾病研究和新药发现具有重要意义。
本文将介绍常见的用于检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术。
1. 免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）免疫沉淀是一种常用的方法，用于鉴定和分离与特定抗原相互作用的蛋白质。
该方法利用特异性抗体结合特定蛋白质并沉淀出来，然后通过电泳、质谱或免疫印迹等分析方法进行检测。
这种方法不仅可以用于识别特定的蛋白质-蛋白质相互作用，还可以捕获整个蛋白质复合物。
2. 酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）酵母双杂交是一种广泛应用于蛋白质-蛋白质相互作用的实验技术。
该方法利用了转录因子的两个功能域的相互作用来检测蛋白质-蛋白质相互作用。
这种方法包括构建两个融合蛋白质：一个与DNA结合域融合的结构域和一个与激活域融合的结构域。
当两个融合蛋白质相互结合时，它们能够重新组装转录因子并激活报告基因的表达。
3. 质谱（Mass Spectrometry，MS）质谱是一种常用于分析蛋白质-蛋白质相互作用的技术。
图谱可以通过分析蛋白质混合物的质量和荷质比来确定蛋白质相互作用的可能性。
质谱技术包括多肽和蛋白质质量指纹图谱（Peptide and protein mass fingerprinting），包括基于基质辅助激光脱附电离（Matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI）和电喷雾（Electrospray Ionization，ESI）的方法。
4. X射线晶体学（X-ray crystallography）X射线晶体学是一种用于解析蛋白质-蛋白质相互作用的高分辨率结构的技术。
该方法涉及到将蛋白质复合物结晶成晶体，然后通过测量和分析这些晶体所产生的X射线散射模式来确定蛋白质的结构及相互作用。
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结实验步骤
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结实验步骤蛋白质与蛋白质相互作用是生物学领域中的一个重要研究方向，可以揭示生命活动的基本机理以及药物设计和治疗疾病的潜在靶点。
本文将总结蛋白质与蛋白质相互作用的研究方法以及实验步骤。
一、蛋白质与蛋白质相互作用研究方法总结：1.蛋白质-蛋白质亲和层析法：该方法通过利用蛋白质与目标蛋白质之间的亲和力，将目标蛋白质与其他非特异结合的蛋白质分离，可用于筛选靶向蛋白质的抑制剂或开发特定结合位点。
2.酵母双杂交方法：该方法是通过融合目标蛋白质与一组已知蛋白质相互作用的底物，通过检测底物报告基因（比如启动子）的表达来确定两个蛋白质相互作用的情况。
3.免疫共沉淀法：该方法通过利用抗体的特异性，将目标蛋白质和与其相互作用的蛋白质一同从细胞裂解液中沉淀下来，以证明它们之间存在相互作用关系。
4.光学双光子显微镜或荧光共振能量转移法：这些方法可以利用荧光染料标记的蛋白质，通过观察它们之间的相互作用情况来研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。
5.表面等离子体共振（SPR）：该方法通过在金属表面固定一个蛋白质，然后观察黄金膜表面等离子体共振信号的变化来研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用过程。
6.核磁共振（NMR）：该方法利用蛋白质中的^1H、^13C和^15N原子的自旋，通过一系列的波形解析来确定蛋白质与蛋白质之间的相互作用，可以提供高分辨率的结构和动力学信息。
7.体外重组蛋白质表达和结合实验：利用大肠杆菌或霞赤红热单核细胞感染表达载体后表达目标蛋白质，以及通过重组技术制备的其他蛋白质，通过混合这些重组蛋白质来研究它们之间的相互作用。
二、蛋白质与蛋白质相互作用实验步骤：1.实验前准备：根据研究目的选择适当的实验方法和方法，准备相应的试剂和材料。
2.原料处理：获得目标蛋白质样品后，进行必要的纯化或浓缩处理，以去除其他污染物，并保持蛋白质的活性。
3.实验设计：根据研究目的设计实验方案，比如确定实验条件、控制实验和重复实验。
研究蛋白质之间相互作用的实验方法
研究蛋白质之间相互作用的实验方法一、酵母双杂交系统酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。
其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。
将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。
在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。
Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。
可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。
此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。
二、噬茵体展示技术在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。
此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。
目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。
三、等离子共振技术表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。
它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。
SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。
测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。
四、荧光能量转移技术荧光共振能量转移（FRET ）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用; 与荧光显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA 的时空信息。
蛋白相互作用Pull-Down实验
蛋白相互作用Ｐulｌ—Ｄｏwn实验实验原理：Pｕlｌ—Down技术就是通过蛋白相互作用来研究细胞通路得有力工具。
就是确定两种或更多蛋白之间相互作用得体外方法。
Pｕll—Dｏwn实验可用来检测已知得蛋白相互作用条件,并且可用来筛选未知得蛋白相互作用。
用作诱饵得蛋白就是重组蛋白，会含有一个用于纯化得亲与标签。
这个融合标签就就是用于Ｐull—Dｏｗn实验得基础.最常见得标签为谷胱甘肽S－转移酶（GＳＴ）与多组氨酸(6×His）。
其分别使用固相化得谷胱甘肽与固相化得金属螯合物亲与配体（如Ｎi2+与Ｃo2＋）。
实验准备：实验仪器：谷胱甘肽琼脂糖凝胶(镍离子琼脂糖凝胶）、离心机、实验材料：表达得含标签得纯化蛋白、细胞裂解液实验试剂：ＢindinｇBuffer/Wａｓhing Buffeｒ：４、2mM Na2ＨPO4、2ｍM KH2PＯ4、140mM ＮaＣl、10mM ＫClSDＳloaｄing Ｂｕfｆｅr：50mＭTｒｉs—Ｃl（ｐH6、８）、２％ＳＤS、0、1％溴酚蓝、1０％甘油、１0mM DTT裂解缓冲液:20mM Tris-Cｌ（pH8、０）、200mM NａCl、1mM EＤTA(pH8、0)、0、５％Noniｄｅt P－４0 使用前加入加入蛋白酶抑制剂.(蛋白酶抑制剂:2ug/uｌ抑肽酶（aprｏｔinin）、1ug／ul白胃素(ｌeupeptin）、0、７ug／ml胃酶抑素(ｐeｐｓｔatｉn）、25ug/ml苯甲磺酰氟(ＰMSF））实验方法:方法一：1、预清除细胞裂解液:将细胞裂解液与50ul得５0%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液与25ug ＧSＴ在4℃混合孵育2h。
离心机１2，00０ｇ在4℃离心２min.将上清转移至新得离心管中.2、探测细胞裂解液两个含等量预清除细胞裂解液及5０ｕl谷胱甘肽琼脂糖球珠得微量离心管.在一管中加约10ug得GST蛋白,另一管中加约1０ug得GSＴ融合探针蛋白.两个反应中加入得探针与对照蛋白质得量应该就是等摩尔得.将离心管在4℃翻转混合孵育2h。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Sigma-Aldrich公司近日推出Imprint Methylated DNA Quantification Kit (MDQ1)，用于表观遗传学研究。
Imprint Methylated DNA Quantification Kit利用类似ELISA的步骤，无需放射性同位素或层析，能在不到四小时内检测整体的甲基化情况。
这个试剂盒只需要5ng的甲基化DNA，分析形式为灵活的8孔分析胶条，能够对培养的细胞、组织、血浆和其他体液样品的DNA进行高通量或手工分析。
Imprint MDQ技术让科学家迅速确定生物样品中的整体甲基化状态，为改变甲基化状态的条件以及更深入的疾病研究打下基础。
目前的甲基化定量研究主要采取反向HPLC、MALDI-TOF-MS 、甲基化敏感内切酶指纹法、DNA甲基化酶分析、免疫组化染色和点杂交等方法。
MDQ1试剂盒为研究人员提供了一种新的选择。
MDQ1试剂盒中包含了所有必需的试剂，能让实验室自行筛选样品，而无需将样品送出去分析。
Sigma-Aldrich的销售经理Tim Fleming表示：“我们的Imprint Methylated DNA Quantification Kit为整体DNA甲基化定量提供了快速而完整的解决方案。
这项激动人心的技术添加到我们的表观遗传学研究产品中，反映出Sigma- Aldrich开发可靠的平台来支持表观遗传学研究的承诺。
”
Sigma- Aldrich是从Epigentek集团获得MDQ技术的许可。
Imprint Methylated DNA Quantification Kit 是Sigma在生命科学领域的表观遗传学研究产品线的补充，它还包括Imprint DNA Modification Kit和Imprint ChIP Kit，以及DNA纯化、qPCR、测序和反应后纯化等产品。
Epigentek的首席科技官Adam Li表示：“我们非常高兴Sigma-Aldrich选择与Epigentek在表观遗传学领域合作。
这次协议强调了Epigentek在表观遗传学方面的地位，巩固了我们的策略和产品，两家公司有望合作开发新的表观遗传学技术和产品。
”
关于Imprint Methylated DNA Quantification Kit以及Sigma-Aldrich表观遗传学研究产品组合的更多信息，请访问/epigenetics。
关于Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich是一个领先的生命科学和高科技公司。
它的生化和有机化学产品和试剂盒广泛应用于基因组学研究、生物技术、药物研发和疾病诊断，并成为药物及其他高科技生产的关键组分。
该公司的客户遍布生命科学公司、大学和政府研究院、医院和工业。
超过百万科学家和技术人员使用其产品。
Sigma-Aldrich致力于通过在生命科学的领导地位、高科技和服务来加速客户的成功。
如需Sigma-Aldrich的更详细信息，请访问其屡获大奖的网站。
（生物通余亮）
2008年11月6日第四十六期第 10 页，共 21 页下一页 返回。