蛋白相互作用Pull-Down实验
GST pulldown实验技术
➢ 3、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋 白（IPTG 0.5mM，28℃，200 rpm培养10~16小时）;
➢ 4、诱导适当时间后，4℃，5000 rpm/min离心10min后弃上清 （如需要该步沉淀能保存在-80℃）；
GST pull-downFra bibliotek示意图Western Blot
GST pull-down应用
Western Blot
用于验证两个已知蛋白的相互作用 筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
GST pull-down流程
GST-A融合蛋白的制备 • B蛋白的制备 • 体外蛋白的结合 • Western blot检测
Western Blot
➢ 1.1 GST-A融合蛋白的表达
➢ 5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； ➢ 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性
蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬液超声6~9min可透明）; ➢ 7、12000 rpm/min，4℃离心10min，将上清转移至新的离心管，
B蛋白的来源： ➢ 1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达与纯化 ➢ 1.2 (HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表达
Western Blot
➢ 1.1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达
➢ 1、活化冻存菌种His和His-B：按1: 50比例将表达蛋白的冻存菌 液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备
GST pull-down实验
百泰派克生物科技
GST pull-down实验
GST pull-down实验原理
Pull-down（拉下实验）是一种体外亲和纯化蛋白的技术，Pull-down技术利用被亲和试剂标签（如谷胱甘肽-S-转移酶、组氨酸六肽、生物素）标记的已知的蛋白特异性识别混合体系中的配体蛋白，以达到富集、分离、纯化某种配体蛋白质的目的，是体外研究蛋白与蛋白相互作用的有力工具。
当诱饵蛋白被谷胱甘肽S-转移酶（GST）标记时进行的Pull-down实验，称为GST pull-down实验，也称GST pull-down融合蛋白沉降技术。
GST pull-down可用于证实已知的蛋白或肽的相互作用，也可以用来发掘未知的蛋白或肽的相互作用。
GST pull-down实验应用
了解蛋白质间的相互作用可进一步探究某项生理活动的分子机制，GST pull-down 技术在研究不同生物体内蛋白相互作用方面得到了广泛的应用。
GST pull-down技术联合高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)可对相互作用蛋白进行定性定量分析，研究蛋白互作网络及由此介导的信号通路和调节机制。
百泰派克生物科技提供基于质谱的GST pull-down蛋白互作分析一站式服务，后续基于液质联用技术（LC-MS/MS）对IP、Co-IP样品及GST融合蛋白Pull-down等纯化样本中的蛋白/蛋白混合物的质谱鉴定。
欢迎免费咨询152-****7680。
pull down 实验方法
.；.Pull Down实验流程1. 混合两种预测相互作用的蛋白。
（Protein-A-GST & Protein-B-HIS，下面实验用GST 树脂IP，用Western Blot检测HIS；反之亦然。
如果是纯化后的蛋白，需要进行偷袭或者使用超滤离心管为蛋白更换溶液，之后才能继续Pull Down。
）2. 加入1 mL Binding Buffer。
Binding Buffer：50 mM Tris.HCl （pH7.50.）100 mM NaCl0.25% Triton-X 10035 mM β-Me（巯基乙醇）3. 将混合蛋白在4℃条件下旋转结合2-4 h。
4. 加入20-30 μL GST-Bind TM Resin结合2-4 h。
5. 4 ℃，150-200 g 离心2 min，吸弃上清（小心！不要吸弃底部沉淀）。
第一次弃去的上清样品记为Washing- Protein-A/ Protein-B，用于SDS-PAGE电泳时的对照。
6. 加入1 mL Binding Buffer，4 ℃条件下旋转混匀5-10 min，4 ℃，150-200 g 离心2 min，吸弃上清。
7. 重复步骤6，用1 mL Binding Buffer 清洗5-6次。
8. 最后一次清洗后留有20-30 μL 液体，加入适量的Loading Buffer，95℃金属浴5-10 min，150-200 g 离心5 min，样品记为上样跑SDS-PAGE电泳。
电泳样品顺序：Marker，Protein-A-GST，Protein-B-HIS，Washing- Protein-A/ Protein-B，Pull Down- Protein-A/ Protein-B此次电泳的目的，一是初步检测两个蛋白是否互作，二是可以为后面正式实验所需蛋白量提供参考。
用于正式检测两个蛋白是否互作电泳顺序如下：（input，蛋白量为后两者的1/10）Marker，Protein-B-HIS ，GST+ Protein-B-HIS，Protein-A-GST+ Protein-B-HISMarker，Protein-A-GST ，HIS+ Protein-A-GST，Protein-B-HIS+ Protein-B-GST9. 转PVDF膜，350 mA 恒流，2 h 左右。
深入解析pull down实验：从技术原理到生物学意义
深入解析pull down实验：从技术原理到生物学意义蛋白质在细胞内发挥着关键的生物学功能，它们之间的相互作用是细胞内信号传递和调控的基础。
为了揭示蛋白质互作网络，科学家们发展了许多实验技术，其中pull down实验是一种被广泛应用的方法。
本文将从技术原理和生物学意义两个方面，深入解析pull down实验。
1.技术原理：Pull down实验基于亲和层析原理，利用蛋白质之间的特异性相互作用，通过诱捕靶蛋白及其相互作用伙伴，进而对其进行分离和鉴定。
该实验通常包括以下步骤：1.1选择适当的亲和剂：亲和剂是一种具有高亲和力的分子，用于捕获目标蛋白及其互作伙伴。
常见的亲和剂包括抗体、蛋白结构域和配体。
1.2亲和剂的固定：将选择的亲和剂固定在固相支持物上，如琼脂糖糖珠或磁珠。
固定亲和剂的选择应考虑其特异性、亲和力和稳定性。
1.3样品处理：将细胞提取物或组织溶液与亲和剂固相进行孵育，以使目标蛋白及其互作伙伴与亲和剂结合。
1.4洗脱和分析：通过洗脱步骤去除非特异性结合的蛋白质，并将目标蛋白及其互作伙伴从亲和剂上洗脱。
洗脱后的样品可以进行质谱分析、免疫印迹等方法进一步鉴定和定量。
2.生物学意义：Pull down实验在生物学研究中具有重要的意义。
通过该实验，我们可以获得以下信息：2.1互作伙伴的识别：通过pull down实验，我们可以鉴定特定蛋白质的互作伙伴，揭示蛋白质相互作用网络，有助于理解细胞信号传递和调控的机制。
2.2功能分析：通过确定互作伙伴，我们可以推断目标蛋白的功能和调控途径。
例如，某个蛋白质的互作伙伴可能是其底物、调控因子或抑制剂。
2.3蛋白质复合物的研究：pull down实验可用于研究蛋白质复合物的组成和结构。
通过确定复合物成员及其相互作用方式，我们可以深入了解复杂的蛋白质互作网络。
Pull down实验是一项强大的实验技术，用于揭示蛋白质之间的相互作用和功能。
通过该实验，我们可以更好地理解生物体内的分子相互作用机制，并为药物研发和疾病治疗提供重要的基础。
GST pull-down实验技术
Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备
1.1 GST-A融合蛋白的表达 1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
1、活化冻存菌种GST和GST-A：按1: 50比例将表达蛋白的冻存 菌液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
GST pull-down 示意图
Western Blot
GST pull-down应用
Western Blot
用于验证两个已知蛋白的相互作用 筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
GST pull-down流程
GST-A融合蛋白的制备 • B蛋白的制备 • 体外蛋白的结合 • Western blot检测
3、在管中加入预冷的200微升PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以 免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤 一次， 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清;
4、重复步骤3三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸 净但不吸走珠子），即获得结合有GST-A融合蛋白的Sepharose；
1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
5、如果用于检测，在Sepharose 加入15~20微升1×蛋白电泳上 样缓冲液，于沸水中煮5~10min。
6、12000 rpm/min离心5min，取上清做SDS-PAGE和WB检测。
2. B蛋白的制备
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性
GST融合蛋白Pull-down技术结合质谱联用的蛋白互作分析
百泰派克生物科技
GST融合蛋白Pull-down技术结合质谱联用的蛋
白互作分析
GST融合蛋白Pull-down技术也称GST pull-down或GST pull-down融合蛋白沉降
技术，是在GST融合蛋白以及Pull Down技术的基础上发展起来的研究体外蛋白质与蛋白质相互作用的技术，实质上是一种利用谷胱甘肽S-转移酶（GST）作为亲和
标签进行的Pull-down实验。
该技术利用基因重组技术得到GST标记的融合蛋白，再利用GST对谷胱甘肽（GSH）偶联磁珠的亲和性将带GST标记的融合蛋白与谷胱甘肽偶联磁珠结合，当与融合蛋白有相互作用的靶蛋白通过载有该磁珠的层析柱或与该磁珠混合时，靶蛋白就会与融合蛋白产生吸附而从蛋白混合液中分离出来，通过纯化洗脱就可以得到与融合蛋白相互作用的靶蛋白。
被GST拉下的靶蛋白利用质谱技术进行进一步分析，即GST pull-down结合质谱分析技术，可以实现靶蛋白的定性鉴定和确认，该蛋白可以是已知的也可以是未知的，因此，可以用于验证两种已知蛋白之间可能存在的相互作用以及寻找能与已知的融合蛋白发生相互作用的未知蛋白分子。
百泰派克生物科技基于先进MALDI-TOF质谱系统与LC-MS/MS质谱系统提供专业准
确的GST融合蛋白Pull-down技术结合质谱联用的蛋白互作分析服务技术包裹研究体外强烈或者稳定的蛋白质间相互作用，鉴定两种已知的感兴趣蛋白质可能存在的直接相互作用，寻找可能与目标蛋白存在相互作用关系的未知蛋白，还可用于表征蛋白相互作用的条件，欢迎免费咨询。
进阶实验：探索蛋白Pull Down在蛋白组学研究中的应用
进阶实验：探索蛋白Pull Down在蛋白组学研究中的应用蛋白质是生命体中最基本的分子，它们在细胞中扮演着重要的角色。
蛋白质的功能和相互作用是生命体系中许多生物学过程的基础。
因此，研究蛋白质的相互作用对于理解生物学过程和疾病的发生机制至关重要。
在这方面，蛋白Pull Down实验是一种常用的技术，它可以用于研究蛋白质之间的相互作用。
本文将介绍蛋白Pull Down实验的原理、步骤和在蛋白组学研究中的应用。
图1。
一、蛋白Pull Down实验的原理蛋白Pull Down实验是一种用于研究蛋白质之间相互作用的技术。
该技术基于亲和层析的原理，利用亲和剂将目标蛋白质结合到固相材料上，然后用该材料从混合物中富集与目标蛋白质相互作用的蛋白质。
最终，富集的蛋白质可以通过质谱分析等方法进行鉴定和定量。
蛋白Pull Down实验可以用于研究多种蛋白质之间的相互作用，包括蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA、蛋白质与RNA等。
该技术的优点在于它可以在原位研究蛋白质之间的相互作用，而不需要对蛋白质进行任何修饰或标记。
二、蛋白Pull Down实验的步骤蛋白Pull Down实验通常包括以下步骤：1.制备亲和剂：选择适当的亲和剂，将其结合到固相材料上。
常用的亲和剂包括抗体、蛋白质结合域和核酸结合域等。
2.样品制备：将样品加入到亲和剂结合的固相材料中，使其与亲和剂结合。
3.洗涤：用缓冲液洗涤固相材料，去除非特异性结合的蛋白质。
4.富集：用洗涤缓冲液洗涤固相材料，去除非特异性结合的蛋白质。
5.分析：将富集的蛋白质进行鉴定和定量，常用的方法包括质谱分析、Western blotting等。
三、蛋白Pull Down实验在蛋白组学研究中的应用蛋白组学是研究蛋白质组成、结构和功能的一门学科。
蛋白Pull Down实验是蛋白组学研究中常用的技术之一。
它可以用于研究蛋白质之间的相互作用，从而揭示蛋白质网络的结构和功能。
在蛋白组学研究中，蛋白Pull Down实验可以用于以下方面的应用：1.蛋白质相互作用网络的构建：蛋白Pull Down实验可以帮助研究人员鉴定蛋白质之间的相互作用关系，从而构建蛋白质相互作用网络。
pulldown实验原理
pulldown实验原理Pulldown实验是一种常用的分子生物学实验技术，用于研究蛋白质与DNA或RNA之间的相互作用。
该实验原理基于核酸的亲和性纯化技术。
在Pulldown实验中，我们需要准备两种重要的试剂：目的蛋白和亲和填料。
目的蛋白是我们想要研究的蛋白质，而亲和填料则是用于显示目的蛋白与核酸相互作用的亲和性表位。
通常，亲和填料有两种类型：固定填料和亲和标记填料。
固定填料是通过共价键结合到固定材料上，如琼脂糖珠。
而亲和标记填料则是具有荧光或放射性同位素等标记，以便于后续的蛋白质分析。
Pulldown实验的步骤如下：1.准备目的蛋白：我们首先需要克隆目的蛋白的基因，并将其表达在适当的表达系统中，如大肠杆菌。
通过分析蛋白质序列，我们可以知道目的蛋白背后的结构和功能。
2.准备亲和填料：根据目的蛋白的特性，选择适当的亲和填料。
例如，如果目的蛋白是DNA结合蛋白，我们可以使用DNA纯化填料，如聚腺酸。
如果目的蛋白是RNA结合蛋白，我们可以使用RNA纯化填料。
3.将目的蛋白和亲和填料结合：将目的蛋白与亲和填料一起孵育，以使它们发生特异性的相互作用。
这可以通过混合目的蛋白和亲和填料，在适当的缓冲液中进行几个小时的孵育来完成。
4.固定亲和复合物：使用试剂将亲和复合物固定在固定剂上，如琼脂糖珠。
这可以通过将珠子加入到反应中，然后对混合物进行旋转和洗涤来完成。
5.洗涤亲和复合物：通过多次洗涤琼脂糖珠，去除非特异性结合的蛋白质和其他杂质。
这可以通过多次旋转珠子和加入适当的洗涤缓冲液来完成。
6. 蛋白质分析：现在我们已经得到了特异性的目的蛋白-亲和填料复合物。
我们可以通过热变性、SDS-、Western blotting等方法对复合物进行分析和检测。
这些分析方法可以帮助我们确定目的蛋白质与DNA或RNA的相互作用。
通过Pulldown实验，我们可以研究蛋白质与DNA或RNA之间的相互作用，从而深入了解生物分子的功能和结构。
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蛋白相互作用Pull-Down实验
实验原理：Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。
是确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。
Pull-Down实验可用来检测已知的蛋白相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用。
用作诱饵的蛋白是重组蛋白，会含有一个用于纯化的亲和标签。
这个融合标签就是用于Pull-Down实验的基础。
最常见的标签为谷胱甘肽S-转移酶（GST）和多组氨酸（6×His）。
其分别使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金属螯合物亲和配体（如Ni2+和Co2+）。
实验准备：
实验仪器：谷胱甘肽琼脂糖凝胶（镍离子琼脂糖凝胶）、离心机、
实验材料：表达的含标签的纯化蛋白、细胞裂解液
实验试剂：Binding Buffer/Washing Buffer: 4.2mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、140mM NaCl、10mM KCl
SDS loading Buffer: 50mM Tris-Cl(pH6.8)、2%SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油、10mM DTT
裂解缓冲液：20mM Tris-Cl(pH8.0)、200mM NaCl、1mM EDTA（pH8.0）、0.5% Nonidet P-40 使用前加入加入蛋白酶抑制剂。
（蛋白酶抑制剂：2ug/ul抑肽酶（aprotinin）、1ug/ul白胃素（leupeptin）、0.7ug/ml胃酶抑素（pepstatin）、25ug/ml苯甲磺酰氟（PMSF））
实验方法：
方法一：
1、预清除细胞裂解液：
将细胞裂解液与50ul的50%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液和25ug GST在4℃混合孵育2h。
离心机12,000g在4℃离心2min。
将上清转移至新的离心管中。
2、探测细胞裂解液
两个含等量预清除细胞裂解液及50ul谷胱甘肽琼脂糖球珠的微量离心管。
在一管中加约10ug的GST蛋白，另一管中加约10ug的GST融合探针蛋白。
两个反应中加入的探针和对照蛋白质的量应该是等摩尔的。
将离心管在4℃翻转混合孵育2h。
最大速度在4℃离心样品2min。
在新的微量离心管中收集上清。
用1ml冰冷的裂解液洗球珠。
在离心机上以最大速度离心1ml。
弃去上清。
重复洗三次。
加入50ul 20mmol/L的还原型谷胱甘肽到球珠中，洗脱GST融合蛋白及任何与其结合的蛋白质。
在离心机上最大速度离心2min。
将洗脱蛋白质与等体积的2×SDS-PAGE上样buffer混合。
3、检测相互作用蛋白质
将样品煮沸4min，进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。
方法二：
1、5ug目的GST融合探针蛋白和GST蛋白分别和谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠在4℃孵育结合30min。
2、结合GST融合探针蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠与100ul细胞裂解液结合在4℃作用4h。
3、3000rpm在4℃离心5min，除去上清。
4、用洗涤缓冲液重悬谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠，3000rpm在4℃离心5min，除去上清，重复5次。
5、取谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠进行SDS-PAGE电泳分析。
方法三：
实验试剂：PBS（140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4）Elution Buffer: 50mM Tris-Cl(pH8.0)、10mM还原型谷胱甘肽
0.154g溶解到50ml 50mM Tris-Cl(pH8.0)中配制Elution Buffer。
1、细胞裂解
取1ml细菌培养液离心去上清，加200ul细胞裂解液到菌丸，在室温下重悬并轻柔的混匀。
将其在室温下晃动孵育20-30min。
2、固定GST融合蛋白到柱子上
将谷胱甘肽琼脂糖凝胶颠倒混匀后取20ul到1.5ml离心管中，小心去除上
清，加250ul Binding Buffer或wash Buffer到凝胶中，混匀。
重复洗3次以上。
平衡好的凝胶用100ul Binding Buffer或wash Buffer重悬。
加200ul含GST 融合蛋白的细菌裂解液，在旋转的台子上室温下孵育30min。
小心移去上清，（保存以便分析，）将250ul Binding Buffer或wash Buffer加到凝胶中，轻柔混匀，在室温下孵育5min。
小心移去上清。
加入250ulBinding Buffer或Washing Buffer再次清洗，将凝胶用20ul Binding Buffer或wash Buffer 重悬。
3、捕获猎物蛋白
将5ul固定GST融合蛋白的凝胶中加入20ul含猎物蛋白的溶液，将155ul Binding Buffer或wash Buffer和20ul 10%BSA加入凝胶中，在室温下旋转孵育1h。
移去上清。
将400ul Binding Buffer或wash Buffer加入凝胶中，轻柔混匀，在室温下孵育5min，移去上清。
加400ul Binding Buffer或wash Buffer再次清洗凝胶。
小心移去上清。
分析：加20ul SDS-PAGE loading Buffer，在室温下混合5min。
取出上清用于分析。
His Pull-Down方法
实验试剂：
Binding Buffer: 20mM Tris-Cl(pH8.0)、150mM NaCl、20mM咪唑
Elution Buffer: 20mM Tris-Cl(pH8.0)、300mM NaCl、500mM咪唑实验步骤：
1、结合蛋白裂解后，经0.45um滤膜过滤，
2、与Ni-NTA树脂（1ml蛋白裂解液上清结合5ul树脂）4℃混合孵育3h。
3、待树脂沉淀后用10倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液洗去杂蛋白。
4、用6倍柱体积镍柱洗脱目的蛋白。
5、纯化后的蛋白用PBS和超纯水透析，冻干。
6、SDS-PAGE电泳分析
7、纯化的蛋白与Ni-NTA树脂冰浴作用2h，
8、10倍柱体积洗涤缓冲液洗涤，
9、然后加入过量100ug/ml蛋白溶液，冰浴作用2h，
10、用10倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液清洗，
11、加入1倍柱体积洗脱缓冲液洗脱，
12、洗脱蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定。
13、阴性对照为结合蛋白溶液加入Ni-NTA树脂中冰浴作用2h。
10倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液清洗，加入1倍柱体积洗脱缓冲液洗脱，
注意事项：
1、所有过柱的液体都要经过0.45um或0.22um的滤膜。
2、平衡柱子：
2.1 用3-5个柱体积蒸馏水洗柱
2.2 用3-5个柱体积的binding buffer平衡柱子。
3、洗柱：
如谷胱甘肽琼脂糖凝胶的柱子失去结合能力，需要洗去柱子上的杂质
3.1除去变性物质，用2个柱体积的的6M盐酸胍洗柱子，然后用5个柱体积
的PBS洗柱
3.2除去疏水性物质，用3-4个柱体积的70%乙醇或2个柱体积的含1%Triton
X-100的PBS洗柱，然后用5个柱体积的PBS洗柱
4、柱子的保存
用3-5个柱体积的超纯水洗柱后，用3-5个柱体积20%的乙醇洗柱后将柱子保存于4℃冰箱
5、Ni离子柱的洗柱程序和柱子的保存同带His标签融合蛋白纯化的步骤。