乳酸菌的分离纯化与鉴定
乳品中乳酸菌的分离鉴定与发酵性能评价
乳品中乳酸菌的分离鉴定与发酵性能评价在乳品加工过程中，乳酸菌是一类重要的微生物，具有良好的发酵性能和健康益处。
因此，对乳品中的乳酸菌进行分离、鉴定和评价其发酵性能是十分必要的。
一、乳酸菌的分离鉴定乳酸菌是一类厌氧菌，广泛存在于自然界的各种环境中，包括土壤、水体和植物表面等。
在乳品中，乳酸菌是一类重要的有益菌群，具有促进消化、增强免疫力等益生作用。
为了分离出乳酸菌，首先需要选择适宜的培养基。
常见的培养基有MRS培养基、M17培养基等，这些培养基中含有适宜乳酸菌生长的营养成分，并能抑制其他菌群的生长。
从乳品中分离乳酸菌的步骤一般包括：制备样品的稀释液、在选择的培养基上涂布样品、进行培养和筛选。
分离出的单菌落需要进行单菌株的纯化，通过反复传代培养可获得纯系的乳酸菌菌株。
对分离出的乳酸菌菌株进行鉴定是非常重要的。
常见的鉴定方法包括形态学观察、生理生化特性测试、16S rRNA基因序列分析等。
其中，16S rRNA基因序列分析是目前最常用的方法，可以准确鉴定细菌的种属。
二、乳酸菌的发酵性能评价乳酸菌作为发酵剂广泛应用于乳品工业中，因此对其发酵性能的评价非常重要。
乳酸菌的发酵性能包括发酵速度、产酸能力、抗菌活性等指标。
发酵速度是评价乳酸菌发酵性能的一个重要指标。
乳酸菌能够将乳糖转化为乳酸，因此通过测定乳糖消耗速度可以评价乳酸菌的发酵速度。
一般来说，发酵速度较快的乳酸菌对应的产品品质也较好。
产酸能力是评价乳酸菌发酵性能的另一个重要指标。
通过测定发酵产物中的乳酸含量可以评价乳酸菌的产酸能力。
产酸能力强的乳酸菌可以更好地发挥酸奶等乳品的保质期延长和营养价值的提升。
除了乳酸的产酸能力，乳酸菌还具有抗菌活性。
乳酸菌能够分泌有抑制其他有害菌生长的物质，对于维持肠道菌群平衡具有重要作用。
因此，评价乳酸菌的抗菌活性也是一项重要的指标。
综上所述，乳品中乳酸菌的分离鉴定和发酵性能评价是乳品加工过程中不可或缺的一环。
通过合理的分离鉴定方法和科学的评价指标，能够筛选出优良的乳酸菌菌株，并确保乳品的品质和安全。
酸奶中乳酸菌的分离检测及纯化
（4）、乳酸菌的检测、纯化培养
(1)、初步检测
恒温培养48小时过后，取出培养平板；选择菌落分布 较好的平板，先对其菌落形态进行观察，初步找出乳酸菌 菌落。乳酸菌的菌落很小，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙， 在产酸菌落周围还能产生CaCO3的溶解圈，如出现圆形稍扁 平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。
2、革兰氏染色结果
革兰氏染色结果为蓝紫色，证乳酸菌为革兰氏阳性菌
3、脱脂乳试管检测乳酸杆菌
试管中脱脂牛乳凝固，证为乳酸杆菌
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
另留一管不稀释留作对照（CK）
（2）、分离方法
A．平板划线 接种环挑取10-1菌液，按无菌操作对标有”10-1”的3个平板进
行划操作；划线完毕后，盖上皿盖，倒置放在40℃恒温培养箱中培 养48小时。
B．平板涂布 用无菌移液管分别吸取10-5、10-6、10-7和无菌生理
将7只装9ml无菌水的无菌试管，依次编号1--7，再用无菌移液管 吸10-1的菌悬液1ml放入依次装有9ml无菌水的试管1--6中，稀释混匀 便得到10-2～10-7的稀释液。
酸奶菌悬液的配制
10ml
1.0ml
1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水
（2）、乳酸菌的分离纯化培养
选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40℃ 培养8-24h若牛乳出现凝固，无气泡，显酸性，涂 片镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色显阳性， 则可将其连续传代3次，最终选择出在3-6h能凝固 的牛乳管，作菌种待用。
乳酸菌鉴定
都要求无菌操作菌种的分离取lmL卤汁以10倍递增稀释方法（一份酸奶，九份无菌水，再取一份第一只管中溶液，加九份无菌水，依次类推），将其稀释至1/10～10的-10次幂（我打不上去），然后从不同浓度稀释液中分别取lmL倾注在平皿中，再倒入培养基相混合，待培养基凝固后倒置于30~C 恒温下培养48h。
挑取长势良好的单个茵落划线分纯，直至纯化(茵落单个大小一致，革兰氏染色镜检，茵体一致)。
结果分离得到3株不同菌株，分别编号为菌株1、菌株2、菌株3。
再分别转移到试管斜面上进行保存。
分离用培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1 000 mL，琼脂20g，pH7．0—7．2；保存用斜面培养基：酵母膏1％，碳酸钙2％，葡萄糖1％，琼脂2％，pH 7．0。
培养条件将分离出的菌株1、菌株2、菌株3分别接种在上述4种不同的培养基上，在30℃恒温条件下培养48h后观察并测定其培养结果。
测定方法菌落总数采用逐级稀释法来计数；pH值用pHS一2C酸度计测定；乳酸定性及含量测定依据食品检验技术1I．2．1乳酸菌的分离与筛选的试验程序自然发酵酸菜汁液一稀释一培养一挑起单菌落染色、镜检一挑选革兰氏阳性球菌单菌落一Ⅲ号培养基一挑选溶钙圈大的球菌反复在Ⅲ号培养基上几次纯化筛选一单菌落优良菌株一试管穿刺低温保存。
1．2 1．2 乳酸菌的鉴定用光学显微镜、放大镜进行乳酸菌的形态特征鉴定。
生理生化特征鉴定：产乳酸定性试验——乳酸纸层析法0- 、过氧化氢酶(接触酶)反应⋯、明胶水解反应、硫化氢反应、乳酸菌发酵营养型试验0 、耐盐、酸、温度试验。
1．2．I．3 乳酸菌的保存⋯采用定期移植低温保藏法。
培养基配方：葡萄糖1％、蛋白胨0 2％、l(}l2PQ|0．2％、琼脂20％、pH值7 0，分装试管，121。
c灭菌30min。
将使用对数生长期后期的细胞进行穿刺培养，然后密封存于冰箱玲藏室内(5qc左右)，2个月移植1次。
1．2．2 分离乳酸菌的生理特点试验1 2 2．1 最适生长温度的测定OD值以同温下不接种培养基作对照，定期取出接种培养基在721分光光度计上，用最大吸收光波长=6001RIifl测定。
乳酸菌的分离与纯化实验报告
乳酸菌的分离与纯化实验报告一、实验目的：1. 掌握乳酸菌的分离与纯化方法；2. 学习乳酸菌的形态特征及生长特性；3. 熟悉微生物实验室操作规范和安全注意事项。
二、实验原理：乳酸菌属于革兰氏阳性细菌，可以利用革兰染色方法进行初步鉴定。
乳酸菌的形态特征有很大差异，有的呈短杆状、短圆柱状，有的呈梭形或球形。
乳酸菌的培养基选择要根据实验目的而定，一般常用的是MRS培养基。
常规乳酸菌分离方法有两种：血漂白法和渐进稀释法。
血漂白法是用过氧化氢或次氯酸钠等对血液进行漂白处理后加入培养基进行分离，由于血液中含有多种抑菌物质，故需漂白处理后方能使用。
渐进稀释法则是将混菌液逐步稀释后按一定比例接种于选定的培养基上，经过多次传代，可得到单一的菌落。
三、实验步骤：1. 取适量样品加入1ml生理盐水中，充分摇匀。
2. 再从上述稀释液中取出1ml加入9ml生理盐水中，得到10-2悬液。
3. 再抽取1ml悬液加入9ml生理盐水中，得到10-3悬液。
4. 分别取适量的10-2和10-3悬液接种于MRS培养基上，并分别转移多次，培养时间一般为24-48小时，必要时可延长到72小时。
5. 分离菌落后进行鉴定。
四、结果及分析：实验结果显示，经过分离培养，从10-2和10-3悬液中分别分离出了多个菌落，经过重复转移，逐步稀释，最终获得了单一的菌落，可见分离培养方法的有效性和行之有效的可行性。
鉴定乳酸菌的一般方法包括形态学鉴定、生化特性鉴定和分子生物学鉴定等。
形态学鉴定包括形态、大小、形状和染色等方面；生化特性鉴定则主要包括代谢途径、酸产生量和果糖发酵能力等；分子生物学鉴定则是通过特异性引物扩增菌株中的核酸，进行分子水平鉴定。
五、实验心得：本次实验通过乳酸菌分离、培养和鉴定的过程，使我对乳酸菌的形态特征、生长特性和鉴定方法有了更深入的了解。
同时，要时刻注意实验室的操作规范和安全问题，确保实验顺利进行。
在今后的实验中，我将更加重视实验操作的规范性和安全性。
蜜蜂蜜囊中乳酸菌资源的分离鉴定
蜜蜂蜜囊中乳酸菌资源的分离鉴定1. 引言蜂蜜是一种由蜜蜂从花中采集的花蜜经过加工而成的天然食品。
而在蜂巢中，蜂蛹孵化时会产生乳酸菌。
乳酸菌是一类对人体有益的微生物，具有调节肠道菌群、促进消化吸收等功能。
因此，研究蜂巢中乳酸菌资源对于开发新型功能性食品具有重要意义。
本文旨在通过分离和鉴定蜂巢中的乳酸菌资源，为进一步研究其应用提供基础数据。
2. 方法2.1 样品采集和处理从不同地区的养殖场采集新鲜的蜂巢样品，并将其放入无菌容器中。
将样品运回实验室后，在无菌条件下进行处理。
2.2 分离乳酸菌取适量的样品，在无菌条件下将其制成10倍稀释液，并进行连续稀释。
然后取适量稀释液接种于MRS琼脂培养基中，利用平板法进行分离。
2.3 纯化乳酸菌从培养基上挑选出单个菌落，通过多次传代，获得纯种乳酸菌。
将其接种于MRS液体培养基中，并在37°C恒温摇床上静置培养。
2.4 鉴定乳酸菌2.4.1 形态学特征观察取适量的培养液制成涂片，并在显微镜下观察乳酸菌的形态特征，包括细胞形状、大小和排列方式等。
2.4.2 生理生化特性检测利用常规生理生化方法对纯化的乳酸菌进行检测。
包括对气体生成、嗜热性、嗜酸性、产气和产色素等方面进行观察。
2.4.3 生物学试验采用API 50 CHL系统对乳酸菌进行生物学试验。
根据系统提供的方法和试剂，进行碳水化合物发酵、氧需求量、抗生素敏感性等方面的检测。
3. 结果与讨论3.1 分离乳酸菌经过连续稀释和平板分离，从蜂巢样品中成功分离出多个乳酸菌菌落。
3.2 鉴定乳酸菌3.2.1 形态学特征观察观察发现，乳酸菌呈短杆状或球状，大小约为0.5-2微米。
排列方式不规则。
3.2.2 生理生化特性检测乳酸菌在培养基中产生大量气泡，并且对高温和低pH值具有较好的适应能力。
在培养基上没有观察到产色素的现象。
3.2.3 生物学试验通过API 50 CHL系统检测，发现蜂巢中的乳酸菌能够利用多种碳水化合物进行发酵，并且对氧需求量较低。
乳酸细菌分类鉴定及实验方法
乳酸细菌分类鉴定及实验方法乳酸细菌是一类可以发酵果糖或蔗糖产生乳酸的革兰氏阳性细菌。
它们广泛存在于自然界中的土壤、水体、动物肠道、植物表面等环境中，并且在食品加工、乳制品、膳食补充剂等领域具有重要的应用价值。
分类鉴定乳酸细菌的方法主要包括传统分离鉴定和分子生物学方法，而实验方法主要包括培养、生理生化鉴定和分子鉴定等。
1.传统分离鉴定传统分离鉴定是通过培养、生理生化特性的观察和细菌形态学特征的分析来进行分类鉴定的方法。
一般的步骤包括：1.2分离：采用适当的培养基，如MRS培养基等，在适当条件下进行分离培养。
可以采用不同的稀释度和培养温度来增加分离率和适应性。
1.3纯化：从培养出的菌落中选择纯净的菌落进行纯化。
1.4形态学观察：观察细菌的形态学特征，如菌落形态、细胞形态、孢子形态等。
1.5生理生化特性鉴定：通过生理生化实验，如氧需氧性、产气、产酸、碱性产蛋白酶等特性的鉴定来进一步确定细菌的分类。
1.6比较分析：将鉴定结果与已知的乳酸菌进行比较分析，以确定菌株的分类。
2.分子生物学方法分子生物学方法是一种快速、准确的分类鉴定方法，可以通过检测细菌的DNA序列来进行鉴定。
常用的分子生物学方法包括PCR、16SrRNA测序和随机扩增多态性DNA(RAPD)等。
2.1PCR：PCR是通过扩增细菌DNA的特定区域来进行鉴定的方法。
首先，从培养的细菌中提取DNA。
然后，使用特定引物扩增目标区域的DNA，并通过凝胶电泳分析PCR产物的大小。
比较PCR产物的片段大小和带型模式，可以确定乳酸菌的分类。
2.216SrRNA测序：细菌的16SrRNA序列是一个高度保守的基因序列，可以用来进行细菌分类鉴定。
通过提取DNA，扩增16SrRNA基因片段，并进行测序，然后将测序结果与已知的乳酸菌序列比对，可以确定细菌的分类。
2.3RAPD：RAPD是一种无须事先了解目标序列的技术，它利用随机引物扩增细菌DNA的多态位点，通过凝胶电泳分析不同样品间的DNA带型模式，来进行菌株分类。
酸奶中乳酸菌的分离检测及纯化ppt课件
【实验材料、仪器与试剂】
实验材料：市售乳酸饮料或酸奶。 实验仪器：保温箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、 培养皿、试管、涂布器、酒精灯等。 实验试剂：脱脂乳试管、脱脂奶粉、5%蔗糖水、 1.6%溴甲酚紫、95%乙醇溶液、酵母膏、 琼脂、无菌水
【实验步骤】
1、1.6%溴钾酚紫牛乳培养基的制备
2、脱脂乳试管的制备
3、酸奶中乳酸菌的分离 4、乳酸菌的检测、纯化培养
（1）、1.6%溴甲酚紫牛乳培养基的制备
配料： （A）液：脱脂奶粉100g，水500ml，加入1.6%溴甲酚紫、乙醇溶液1ml， 80℃灭菌20min。 （B）液：酵母膏10g，水500ml，琼脂20g ，pH6.8， 121℃湿热灭菌20min。 操作： （1）、按照配方正确称取所需药品放于烧杯中，在搪瓷杯中加入所需水 量，玻棒搅匀，加热溶解，用1N NaOH或1N HCl调pH，加琼脂溶化，加 热过程要不断搅拌，可适当补水。琼脂完全溶解后 倒入250mL的锥形 瓶中，贴上标签，在高压锅中灭菌20min。 （2）、灭好菌的A液和B液趁热充分混合，并在酒精灯的附近趁热倒平板 。
10ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml
10-1
花园酸奶 90ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
另留一管不稀释留作对照（CK）
（2）、分离方法
A．平板划线 接种环挑取10-1菌液，按无菌操作对标有”10-1”的3个平板进 行划操作；划线完毕后，盖上皿盖，倒置放在40℃恒温培养箱中培 养48小时。
B．平板涂布
乳酸菌分离鉴定及试验方法
乳酸菌分离鉴定及试验方法一、引言乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的微生物，具有重要的生物学功能和应用价值。
乳酸菌可以通过发酵作用，将葡萄糖、果糖等碳源转化为乳酸和其他有机酸，同时还会产生一些对人体有益的物质，如维生素、酶、抗生素等。
乳酸菌在食品工业、医药工业、农业等领域具有重要的应用前景。
乳酸菌的分离鉴定及试验方法对于深入研究乳酸菌菌种的特性、功能以及在不同领域中的应用具有重要意义。
本文将介绍乳酸菌的分离鉴定及试验方法，旨在为相关研究人员提供参考和指导。
二、乳酸菌分离方法1. 采样乳酸菌的分离首先需要进行采样工作。
可以从发酵食品、乳制品、蔬菜、水果、土壤、肠道等多种来源进行采样。
在采样过程中应注意样品的新鲜性和卫生性，避免外部污染对实验结果造成影响。
2. 培养基的选择乳酸菌可以利用多种培养基进行分离和培养，常用的培养基有MRS培养基、乳清培养基等。
根据具体的分离目的和需求选择适合的培养基。
3. 分离将采样得到的样品进行系列稀释，取适量的稀释液均匀涂布在含有适当培养基的琼脂平板上，培养温度一般在30-37摄氏度之间，培养时间约48-72小时。
4. 纯化观察培养基上的菌落形态，选择典型的菌落进行分离单菌培养，通过多次传代稀释可以纯化获得纯种的乳酸菌。
5. 形态观察利用显微镜对分离得到的菌株进行形态学观察，包括细胞形状、大小、排列方式等。
三、乳酸菌鉴定方法1. 生理生化鉴定通过对分离得到的菌株进行生理生化特性的研究，包括乳酸发酵能力、氧耐受性、温度、pH值的适应能力等，可以初步判断乳酸菌的种属。
2. 生化试剂法利用生化试剂对乳酸菌进行鉴定，如气体发生试验、氧化还原酶试验、酶活性试验等。
3. 分子生物学鉴定通过PCR扩增乳酸菌的16S rRNA基因序列，测序后与数据库比对，确定乳酸菌的种属分类。
四、乳酸菌试验方法1. 发酵活性测定通过测定菌株在不同条件下的发酵活性，如发酵速率、产酸速率、产酶能力等。
2. 抗菌活性测定测定乳酸菌对一些有害菌的抑菌作用，判断其在抗菌方面的潜力。
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乳酸菌的分离、纯化与鉴定第一部分:乳酸菌的分离、纯化一、实验器材:1、实验药品新鲜乳酸饮料(市售)、脱脂奶粉、蔗糖、1、6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄)、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙;0、4gNaOH固体、4、2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g;2、仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿(φ9或φ12)、试管、300ml三角瓶(带玻珠)、移液管、天平、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。
二、实验步骤:1、培养基配制(BCG牛乳培养基):(A)溶液:取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1、6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml,混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min;(1、6%溴甲苯酚绿(BCG)乙醇溶液用1、6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中,再加水至100ml制成)(B)溶液:酵母膏10g,水500ml,CaCO3 10g,琼脂20g,加热溶解,用精密pH试纸调节pH到6、8,分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min。
以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。
2、药品配制2、1 结晶紫:结晶紫乙醇饱与液(结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中)20ml,1%草酸氨水溶液80ml。
将两液混匀,放置24小时后过滤即可。
2、2 卢哥氏碘液:碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。
先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后加入碘使之完全溶解,再加入蒸馏水300ml即成。
2、3 蕃红溶液:番红2、5g,95%乙醇100ml,溶解后存于密闭的棕色瓶中。
用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。
2、4 0、1%的吕氏美蓝染液:A液:美蓝0、3g,95%乙醇300ml;B液:0、01% KOH 100ml。
混合A与B液即成,按1:100稀释即可。
2、4 生理盐水:称取9g氯化钠,溶解在少量蒸馏水中,稀释到1000毫升。
3、菌悬液的配制取1洁净三角瓶,盛以225ml生理盐水;7只洁净试管,各盛9ml的生理盐水;加塞包扎于在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min,得到无菌生理盐水。
将酸奶样品搅拌均匀,用无菌移液管吸取样品25ml加入盛有225ml无菌生理盐水的三角瓶中,在旋涡均匀器上充分振摇,使样品均匀分散,即为10-1的样品稀释液;将7只装9ml生理盐水的无菌试管,依次标记 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7,再用无菌移液管吸10-1的菌悬液1ml放入依次装有9ml无菌水的试管中,稀释混匀便得到10-2稀释液,如此重复依次制得10-3～10-7的稀释液。
4、倒平板取无菌平板12个,编号标明10-1、10-5、10-6、10-7各三套;将经高温消毒的培养基冷却到50℃左右,按无菌操作法倒12只平板,每皿约15ml;平置使培养基均匀分布在皿底,待凝固。
5、分离方法A.平板划线接种环挑取10-1菌液,按无菌操作对标有”10-1”的3个平板进行划操作;划线完毕后,盖上皿盖,倒置放在40℃恒温培养箱中培养48小时。
B.平板涂布用三支1ml无菌移液管分别吸取10-5、10-6与10-7的稀释菌悬液各1ml,对号接种于与之对应的3个无菌平板中,每个平皿放0、1ml;尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀,平放于试验台上20 Min;然后倒置于40℃恒温箱中培养48小时。
6、脱脂乳试管的配制与灭菌直接选用脱脂乳液或按脱脂奶粉10克与蔗糖5克,水95克(蔗糖与水的比例在1:10的范围内)的比例配制,装量以试管的1/3为宜,115℃灭菌15min。
7、菌落观察恒温培养48小时过后,取出培养平板;选择菌落分布较好的平板,先对其菌落形态进行观察,初步找出乳酸菌菌落。
乳酸菌的菌落很小,大约1~3 mm,园形隆起,表面光滑或稍粗糙,呈乳白色、灰白色或暗黄色;在产酸菌落周围还能产生CaCO3的溶解圈。
40℃培养48h,如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。
8、乳酸菌的分离纯化选取乳酸菌典型菌落转致脱脂乳试管中,40℃培养8~24h若牛乳出现凝固,无气泡,显酸性,涂片镜检细胞杆状或链球状,革兰氏染色显阳性,则可将其连续传代3次,最终选择出在3~6h能凝固的牛乳管,作菌种待用。
9、乳酸发酵及检查发酵:观察BCG培养基中乳酸菌菌落特征,选取长势比较好的菌落无菌操作下将乳酸菌接种于装有脱脂乳的试管中,40～42℃静止培养。
取干净载玻片一块,在载玻片中央加一滴生理盐水,无菌操作法取少量菌体涂片;结晶紫初染→碘液媒染→乙醇脱色→番红复染,干燥后用油镜观察,菌体被染成蓝紫色的就是乳酸菌;其中保加利亚乳杆菌呈杆状,成单杆、双杆或长丝状;嗜热链球菌,呈球状,成对或短链或长链状。
革兰氏阳性,无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌,记录测定结果。
第二部分:乳酸菌鉴定一、实验器材1、蛋白胨水培养基:蛋白胨 10 g , 氯化钠 5 g , 水 1000 ml , PH : 7、2 ~ 7、4121 摄氏度湿热灭菌 20 min2、糖发酵培养基:蛋白胨水培养基 1000 ml , 1、6%溴甲酚紫乙醇溶液 1~2 ml ,PH : 7、6 , 另配 20%糖溶液(葡萄糖,蔗糖)各 10 ml、3.有关试剂1、6 % 溴甲酚紫乙醇溶液 :溴甲酚紫 1、6 g 溶于100 ml 乙醇中,贮存于棕色瓶中保存备用。
吲哚试剂:对二甲基氨基苯甲醛 8 g , 95 % 乙醇 760 ml , 浓盐酸 160 ml、10 % 硫酸,2 % 高锰酸钾含氨的硝酸盐溶液 : 称取硝酸银 2 g , 蒸馏水 100 ml ,待硝酸银溶解后,取出10 ml 备用,向其余的90 ml 硝酸银中滴加氨水,即可形成很厚的沉淀,继续滴加氨水至沉淀刚刚溶解成为澄清溶液为止,再将备用的硝酸银慢慢滴入,则溶液出现薄雾,但轻轻摇动后,薄雾状的沉淀又消失,继续滴入硝酸银,直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。
二、鉴定试验1、形态与培养特征观察采用牛肉膏蛋白胨培养基,将已纯化后的甘油菌种活化后于37℃下培养20～24h ,并进行革兰氏染色及菌体形态与菌落特征的观察。
染色方法:涂片固定;草酸铵结晶紫染1分钟;自来水冲洗;加碘液覆盖涂面染约1分钟;水洗,用吸水纸吸去水分;加95%酒精数滴,并轻轻摇动进行脱色,20秒后水洗,吸去水分;蕃红染色液(稀)染2分钟后,自来水冲洗。
干燥,镜检。
2、生长条件试验(1)耐盐性试验(NaCl 浓度:0、 85 、1、 20 与1、 71) (mol/ L) ;(2)耐酸碱试验(p H :4、 3 、5、 7 、6、 8 、8、 4 、8、 6 与8、 7) ;(3)温度梯度试验(温度: 10℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃与65℃) 。
分别将参试菌接种于以上处理的液体培养基中培养48 h ,记录生长状况。
3、厌氧生长测定将菌种接入营养肉汤平板后,用密封带包好放入CO2培养箱37℃培养2天后,观察生长情况,生长则为阳性。
含硝酸钾的营养肉汤加入2g硝酸钾入营养肉汤4、生理生化试验⑴过氧化氢酶测定将实验菌接种于PGY培养基斜面上,37℃培养20h—24h,取一环接种的培养物,涂于干净的载玻片上,然后在其上滴加3%－—15%的过氧化氢,有气泡则为阳性反应,无气泡为阴性反应。
蛋白胨、酵母膏、葡萄糖(PGY)培养基:蛋白胨10g,酵母膏5g ,葡萄糖1g,蒸馏水1L 。
(2)甲基红(M、R)试验接种实验细菌于PYG培养基,于37℃培养2天后,于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液,如呈红色,表示阳性。
(3)吲哚试验1)、试管标记:取装有蛋白胨水培养基的试管2支,分别标记乳酸菌与空白对照。
2)、接种培养:以无菌操作分别接种少量菌苔到标记乳酸菌的试管中,标记有空白对照的不接种,置37摄氏度恒温箱中培养24~48小时。
3)、观察记录:在培养基中加入乙醚1~2 ml ,经充分振荡,使吲哚萃取至乙醚中,静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面,此时沿管壁缓慢加入5~10滴吲哚试剂,如有吲哚存在,乙醚层呈玫瑰色,此为吲哚试验阳性反应,否则为阴性反应。
(4)、糖发酵试验1)、试管标记:取分别装有葡萄糖,蔗糖发酵培养液试管各2支,每种糖发酵试管中分别标记乳酸菌与空白对照。
2)、接种培养:以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中,每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。
将装有培养液的杜氏小管倒置试管中,置37摄氏度恒温培养箱中培养24小时,观察结果。
3)、观察记录:与对照管比较,若接种培养液保持原由颜色,其反映结果为阴性;如果培养液呈黄色,反映结果为阳性。
培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应,杜氏小管内没有气泡为阴性反应。
(5)、乳酸的检测选用已经分离的菌种做小型发酵实验,取发酵液的上清液约10 ml于试管中,加入10%硫酸1 ml ,再加2%高锰酸钾 1 ml ,此时乳酸转化为乙醛,把事先在含氨的硝酸银溶液中侵泡的滤纸条搭在试管口中,微火加热试管至沸,观察滤纸变化。
(6)乙酰甲基甲醇试验(V-P试验)接种新鲜的实验菌种于培养基中, 37℃培养2天后,取葡萄糖蛋白胨培养液1mL在其中加入1ml 10％的NaOH,混匀,再加入3－4滴2%氯化铁溶液。
数小时后,培养基表面的下层出现红色者,为阳性、(7)明胶液化实验将实验菌接种于明胶基础培养基中,置37℃培养,以一支未接种的试管作为对照。
将接种的与未接种的对照管置于冰箱或冷水中,等待对照管凝固后记录实验结果,反复观察对比多次。
如对照管凝固时,接种管液化为阳性反应,凝固为阴性反应明胶培养基成分:NaCl 5g,蛋白胨10g,牛肉膏3g,明胶120g,蒸馏水1000mL。
制法:在水浴锅中将上述成分溶化,不断搅拌。
溶化后调pH 7、2~7、4,121°C 灭菌30min。
(8)石蕊牛奶的反应牛奶中主要含有乳糖与酪蛋白,在牛奶中加入石蕊就是作为酸碱指示剂与氧化还原指示剂。
石蕊在中性时呈淡紫色,酸性时呈粉红色,碱性呈蓝色,还原时则自上而下地褪色变白。
观察其产酸、产碱、胨化、酸凝固、凝乳酶凝固、还原情况。