第九章吸光光度法解析
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吸光光度法知识点
第九章吸光光度法知识点吸光光度法是基于分子对光的选择性吸收而建立的一种分析方法，包括比色法、紫外一可见吸光光度法、红外光谱法等。
1．吸光光度法的基本原理①物质对光的选择性吸收：当光照射到物质上时，会产生反射、散射、吸收或透射。
若被照射的物质为溶液，光的散射可以忽略。
当一束白光照射某一有色溶液时，一些波长的光被溶液吸收，另一些波长的光则透过，溶液的颜色由透射光的波长所决定。
吸收光与透射光互为补色光(它们混合在一起可组成白光)。
分子与原子、离子一样，都具有不连续的量子化能级，在一般情况下分子处于最低能态(基态)。
当入射光照射物质时，分子会选择性地吸收某些频率的光子的能量，由基态跃迁到激发态(较高能级)，其能级差E激发态一E基态与选择性吸收的光子能量hv的关系为Hv=E激发态一E基态分子运动包括分子的转动、分子的振动和电子的运动。
分子转动、振动能级间隔一般小于1 eV，其光谱处于红外和远红外区。
电子能级间的能量差一般为1～20 eV，由电子能级跃迁而产生的吸收光谱位于紫外及可见光区，其实验方法为比色法和可见-紫外吸光光度法。
②吸收曲线：以波长为横坐标，以吸收光的强度为纵坐标绘制的曲线，称为吸收光谱图，也称吸收曲线。
它能清楚地描述物质对不同波长的光的吸收情况。
③光的吸收定律——朗伯一比尔定律：当一束平行单色光垂直通过一厚度为b、非散射的均匀吸光物质溶液时，吸光物质吸收光能，致使透射光强度减弱。
若用I。
表示入射光强度，I t表示透射光强度，I。
与I t之比称为透光率或透光度T，T=I。
/I t，吸光物质对光的吸收程度，还常用吸光度A表示，A=lgT=log I。
/I t。
实验证明，当一束平行单色光垂直照射某一均匀的非散射吸光物质溶液时，溶液的吸光度A与溶液浓度c和液层厚度b的乘积成正比，此即朗伯一比尔定律，其数学表达式为A=lgT=log I。
/I t =abc式中，a为吸收系数。
溶液浓度以g·L-1为单位、液层厚度以cm 为单位时，a的单位为L·g-1·cm-1。
9吸光光度法全解
A= e bc
e ——摩尔吸光系数 单位: L· mol-1 · cm-1
摩尔吸光系数e
表示吸光物质浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时溶液的 吸光度。 e 值越大，溶液的吸光能力越强，显色反应的灵敏度越 高。 e <104 为低灵敏度; e 104～105 为中等灵敏度; e >105为高灵敏度。
9.1.2 物质对光的选择性吸收
M + h M*
M + 热
基态 激发态 E1 （E） E2
M + 荧光或磷光
单色光：具有同一波长的光。 复合光：由不同波长光组成的混合光，如日光。 互补光：白光可由两种颜色的光混合而成，这两种光称 为互补色光。 物质的颜色：对不同波长的光选择性吸收，反射光的颜 色。 溶液的颜色：吸收光的互补光色，透过光的颜色。
A
N(CH3)2
多元络合物
混配化合物 Nb-5-Br-PADAP-酒石酸 V-PAR-H2O 离子缔合物 AuCl4--罗丹明B 金属离子-配体-表面活性剂体系 Mo-水杨基荧光酮-CTMAB
9.4.3 显色条件
1. 显色剂用量 适当过量
M
+
R
= MR
(被测组分) (显色剂) (有色配合物)
R过量，反应完全， MR稳定，A值稳定。
黄 橙 红
绿
青 青蓝
蓝 互补色光
白光
紫
硫酸铜溶液，吸收黄光呈现蓝色。 高锰酸钾溶液，吸收绿光呈现紫色。
互补色
吸收光
物质的颜色
黄绿 黄 橙 红 紫红 紫 蓝 绿蓝 蓝绿
颜色 紫 蓝 绿蓝 蓝绿 绿 黄绿 黄 橙 红
波长范围 ( ,nm) 400-450 450-480 480-490 490-500 500-560 560-580 580-600 600-650 650-750
第九章 吸光光度法
发生相互作用。 假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L)时才基本符合。 当溶液浓度c >10 －2 mol/L 时，吸光质点间可能发 生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。 故：朗伯—比耳定律只适用于稀溶液。 溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的 形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化 ，影响吸光度。
度的乘积成正比。 朗伯——比耳定律不仅适用于有色溶液，也适 用于其它均匀、非散射的吸光物质(包括液体、气 体和固体)，是各类吸光光度法的定量依据。
A bc
式中，A：吸光度，描述溶液对光的吸收程度； b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位； c：溶液的摩尔浓度，单位mol· －１； L
无线电波 11000m
光谱名称 波长范围 X射线 0.1—10nm 远紫外光 10—200nm
跃迁类型
辐射源
分ห้องสมุดไป่ตู้方法 X射线光谱法
真空紫外光 度法
K和L层电子 X射线管 中层电子 氢灯 氢灯 钨灯
碳化硅热棒
近紫外光 200—400nm 价电子 可见光 400—750nm 价电子
近红外光 0.75—2.5μ m 分子振动 中红外光 2.5— 分子振动 5.0μ m
A总 lg(I01 I02 ) /(I01 10
1bc
I02 10
2bc
)
讨论: A总 lg(I0 I0 ) /(I0 10
1 2 1
1bc
I02 10
2bc
)
(1) 1= 2 = 则： A总 ＝lg（Ｉo/Ｉt）＝ bc
(2) 若 2≠ 1 ；A与C则不成直线关系。 2与 1
I0 A lg I t A Kbc
第九章吸光光度法(简)
解 已知T=0.501，则A=－lgT=0.300，b=2.0cm,
c
25.0 10 6 g 50.0 10 3 L
5.00 10 （4 g L1)
则根据朗伯—比尔定律 A=abc，
a
A bc
0.300 2.0cm 5.00 10 4 g
L1
3.00
10 2 L.g -1.cm1
III
III 0.0006mg/mL
0.3
0.2
II
I
0.1
0.0
400
500
600
/nm
１，１０－邻二氮杂菲亚 铁溶液的吸收曲线
吸收光谱或吸收曲线
max
KMnO4溶液的吸收曲线
(cKMnO4:a<b<c<d)
KMnO4溶液
对波长525nm附近的绿 色光吸收最强，而对紫 色光吸收最弱。光吸收 程度最大处的波长叫做
实验确定 4.溶剂 5.干扰的消除
三 显色剂
1 无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵等。 2 有机显色剂：种类繁多 （1）偶氮类显色剂：性质稳定、显色灵敏度高、选择 性好、对比度大，应用最广泛。偶氮胂III、PAR等。 （2）三苯甲烷类：铬天青S、二甲酚橙等
§9－4 吸光度测量条件的选择
一 选择适当的入射波长
2.由于溶液本身的原因所引起的偏离
朗伯—比尔定律是建立在 均匀、非散射的溶液这个基础 上的。如果介质不均匀，呈胶 体、乳浊、悬浮状态，则入射 光除了被吸收外，还会有反射 、散射的损失，因而实际测得 的吸光度增大，导致对朗伯— 比尔定律的偏离。
3. 溶质的离解、缔合、互变异构及化学变化
其中有色化合物的离解是偏离朗伯—比尔定律的主
第9章吸光光度法(2)。
60nm
二、 显色条件的选择
吸光光度法是测定待测物质的吸光度或显色 反应平衡后溶液的吸光度，因此为了得到准确的 结果，必须控制适当的条件，使显色反应完全和 稳定。
显色条件包括: 溶液酸度，显色剂用量，显 色时间，显色温度，有机络合物的稳定性及共存 离子的干扰等。
1、溶液酸度（pH值及缓冲溶液）
在相同条件下测的试液的吸光度， 从工作曲线上就可查到试液的浓 度, 该方法称为工作曲线法。 注意什么？ a. 标准溶液浓度必须在线性范围内，即符合A= bc
b. 试液的吸光度必须在标准曲线范围内，即A1≤ Ax ≤An
五、光度分析法的误差（准确度）
对朗伯－比尔定律的偏离
在实际分析中，常会发现标准曲线发生弯曲，尤其当溶液
2.有机显色剂
有机显色剂分子中含有某些含不饱和键的基 团如偶氮基、对醌基和羰基等生色团（ chromophoric group）和含孤对电子的基团如氨 基 、 羟 基 和 卤 代 基 等 助 色 团 （ auxochrome group）。
生色团：－N＝N－，－N＝O，
O
C=S,－N
（共轭双键）πe
为避免铁的干扰，可以选择波 长 520 nm进行测定，虽然而测镍的 灵敏度有所降低，但酒石酸铁不干 扰镍的测定。
二、参比溶液的选择
为什么要使用参比溶液？ 目的：扣除非待测组分（吸收池和各种试剂）对光的吸收， 使测得的的吸光度真正反映待测物对光的吸收。
测定时，采用两个材质、厚度相同的比色皿进行测量，其中 一个作为参比池，装入参比溶液，调节仪器使透过参比池的吸光 度为零。则测得待测溶液的吸光度为：
显色剂的用量来消除干扰。 g. 采用预先分离的方法。
三、三元配合物在光度分析中的应用特性简介（自学）
§9-6 吸光光度法的应用
§9-6 吸光光度法的应用
吸光度差与这两种溶液的浓度差成正比。以把空 白溶液作为参比的稀溶液的标准曲线作为ΔA和Δc的标 准曲线，根据测得的ΔA求出相应的Δc值，从cx=co+c可 求出待测试液的浓度，这就是示差吸光光度法定量的 基本原理。
Hale Waihona Puke Ax cxbA0 c0b
A相对 A Ax A0 b(cx c0 ) bc bc相对
§9-6 吸光光度法的应用
1 示差吸光光度法（differential）
（1）示差吸光光度法的原理 吸光光度法一般仅适用于微量组分的测定，当待 测定组分浓度过高或过低，会引起很大的测量误差， 导致准确度降低。示差吸光光度法可克服这一缺点。 目前，主要有高浓度示差吸光光度法、低浓度示差吸 光光度法和使用两个参比溶液的精密示差吸光光度法。 它们的基本原理相同，且以高浓度示差吸光光度法应 用最多，仅介绍高浓度示差吸光光度法。
§9-6 吸光光度法的应用
4 络合物组成的测定
（2）连续变化法(又称等摩尔系列法)
cM+cR=c，改变 cM和cR的相对量，
配制一系列溶液，在有色络合 物的最大吸收波长处测量这一 系列溶液的吸光度。当溶液中 络合物MRn 浓度最大时， cR/cM 比值为n。 当 cM/c为0.5时，络 合比为1:1；当 cM/c 为0.33， 络合比为1:2；当 cM/c=0.25时， 络合比为1:3。
连续变化法
§9-6 吸光光度法的应用
3 弱酸和弱碱解离常数的测定
HB==H++B-
( AHB A) pKa lg pH ( A AB )
作图法求pKa
§9-6 吸光光度法的应用
4 络合物组成的测定
吸光光度法讲解
吸光光度法讲解吸光光度法是一种广泛应用于化学分析和生物科学研究中的定量分析方法。
它通过测量样品溶液对特定波长的光的吸收程度来定量分析物质的浓度。
吸光光度法基于光的著名的“比尔-朗伯定律”，该定律描述了物质溶液对光的吸收与其浓度之间的关系。
通过测量光的吸收度，我们可以推算出浓度。
吸光光度法的基本原理是根据物质溶液对特定波长的光的吸收程度与溶液中物质的浓度之间的线性关系。
具体来说，当光通过物质溶液时，物质分子或离子会吸收光的能量，使光强度降低。
根据比尔-朗伯定律，光的吸光度（A）与物质的浓度（c）之间存在如下关系：A=εlc，其中ε是吸光度的摩尔吸光系数，l是光程长。
通过测量光的吸光度和已知的吸光度摩尔吸光系数，我们可以计算出溶液中物质的浓度。
在实践中，吸光光度法通常使用分光光度计来进行测量。
分光光度计可以发射一束特定波长的光，并测量光通过样品溶液前后的光强度差异。
这种差异可以转化为吸光度，并用于计算物质的浓度。
吸光光度法有许多应用领域。
在化学分析中，吸光光度法可以用于分析金属离子、化学物质的浓度、酸碱度等。
它可以通过配备合适的试剂和仪器来满足不同的分析需求。
在生物科学研究中，吸光光度法被广泛应用于测量DNA、蛋白质和酶的浓度。
通过测量DNA和蛋白质在特定波长下的吸光度，可以确定它们的浓度，进而研究其相互作用、结构和功能。
吸光光度法还可以用于测量酶的活性，通过测量酶和底物之间的反应，可以确定酶的催化能力。
吸光光度法有许多优点。
首先，它是一种快速、简单和经济的分析方法。
与其他方法相比，吸光光度法仪器简单、成本低，且操作方便。
其次，吸光光度法具有较高的选择性和灵敏度。
通过选择合适的波长和试剂，可以实现对特定物质的高度选择性测量。
此外，吸光光度法对微量物质的测量也非常敏感，可以达到微克或纳克级别的浓度测量。
然而，吸光光度法也存在一些限制。
首先，该方法对于有色的物质比较适用。
对于无色物质，需要经历一系列的试剂反应使其形成有色产物，才能进行吸光度测量。
分析化学第九章吸光光度法
3. 分光光度计及其基本部件：
光源－单色器－比色皿（吸收池）－检测器－显
（1）光源 : 钨丝灯:可见、红外 400－1000nm氢灯或 氘灯：紫外 160－350nm （2）单色器： a.滤光片：有机玻璃片或薄膜，利用颜色互补原理。 b.棱镜：根据物质的折射率与光的波长有关。玻璃 棱镜:可见,石英棱镜:紫 外、可见。 c.光栅：在玻璃片或金属片上刻划均匀的线，1200 条/mm, 衍射、干涉原理。
吸收光谱有原子吸收光谱和分子吸收光谱 单色 单一波长的光 光 光 复合光 由不同波长的光组合而成的光
两种不同颜色的单色光按一定的强度比 光的互补 例混合得到白光，那么就称这两种单色 光为互补色光
光的互补示意图
KMnO4溶液的 吸收曲线 (cKMnO4:a<b<c <d)
分子、原子、离子具有不连续的量子化能级，仅 能吸收当照射光子的能量hv与被照射粒子的 E激 － E基 ＝（hv）n因为不同物质微粒的结构不同， 共有不同的量子化能级，其能量差也不相同,因此 对光的吸收具有选择性。若固定某一溶液的浓度 C 和液层厚度 b ，测量不同 λ下的 A ，以吸光 度 A 对吸收波长λ 作图，就得到－吸收曲线， 即吸收光谱。 初步定性分析：不同物质吸收曲线的形状与最大 吸收波长不同。 定量分析：不同 C 的同一物质在吸收峰附近的 A 随 C ↑而增大，吸收曲线是吸光光度法中选择测 定波长的主要依据。
3.温度：通过实验确定温度范围，通常在室温下 进行。 4.溶剂：一般螯合物在有机溶剂中溶解度大，提高 显色反应的灵敏度。如Cu(SCN)42－在水中大 部分离 解，几乎无色；在丙酮中呈蓝色。
5.显色时间：通过实验找出适宜的显色时间。
6.干扰组分：共存组分与显色剂生成有色络合物， 正干扰；生成无色络合物，负干扰。 干扰的消除：
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C
02:00:33
非单色光引起的对吸光定律的偏离 设入射光由 1 和 2 两种波长组成，溶液的吸光质点对 两种波长的光的吸收均遵从吸收定律
1
2
1 + 2
I 01 A1 lg 1bc I1 I 02 A2 lg λ 2bc I2
I1 I 01 10
λ 1bc
单色器
吸收池
检测器
显示
It A lg lg T bc I0
未考虑吸收池和溶剂对光子的作用
样品
02:00:33
It
注意 比较
入射光 I0
透射光 It
单波长单光束分光光度计
0.575
光源
单色器
吸收池
检测器
显示
02:00:33
单波长双光束分光光度计
光束分裂器 光源 单色器
比值
吸收池
02:00:33
讨论：
④不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度 A
有差异，在λ max处吸光度A 的差异最大。此特性可作作
为物质定量分析的依据。
⑤在λ max处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定
最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要
依据。
02:00:33
定性分析与定量分析的基础
02:00:32
9-1 吸光光度法基本原理
一、物质对光的选择性吸收
10-2 nm 10 nm
射 线 x 射 线
102 nm 104 nm
紫 外 光 红 外 光
0.1 cm 10cm
微 波
103 cm
105 cm
无 线 电 波
可
见
光
02:00:32
单色光、复合光、光的互补
单一波长的光 由不同波长的光组合而成的光 若两种不同颜色的单色光按一定的强度比 例混合得到白光，那么就称这两种单色光 为互补色光，这种现象称为光的互补。
显色条件的选择
吸光光度法是测定显色反应达到平衡后溶液
的吸光度，为了得到准确的结果，必须从研究平 衡着手了解影响显色反应的因素，控制适当的条 件，使反应完全和稳定。
02:00:33
显色反应的主要条件
显色的主要条件有以下几点： （1）显色剂用量 显色反应一般可以用下式表示： M + R ＝ MR 为了减少反应的可逆性，根据同离子效应，加 入过量的显色剂是必要的，但过量太多，有时 会有副反应产生，反而不利。
1. 比色法 2. 可见分光光度法 3. 紫外分光光度法
02:00:32
目视比色法 特点 利用自然光 比较吸收光的互补色光 准确度低（半定量） 不可分辨多组分
02:00:32
标准系列
未知样品
方法简便，灵敏度高
分光光度法（紫外-可见分光光度法） UV-VIS
0.575
光源 参比 I0
单色器
吸收池
检测器
绿 蓝绿 绿蓝 蓝
02:00:32
单色光 复合光 光的互补
黄绿 黄 橙 红
紫 紫红
光谱示意
复合光
表观现象示意
完全吸收
完全透过
吸收黄色光
02:00:33
光吸收原理
物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成了 物质对光的选择吸收基础。分子的紫外-可见吸收光谱是由电子 跃迁引起的，故又称电子光谱.
定性分析基础 物质对光的选择 吸收
A
B
A
max ( A) max ( B)
定量分析基础 在一定的实验条 件下，物质对光 的吸收与物质的 浓度成正比。
A
增 大
C
02:00:33
二、光吸收的基本定律-朗伯-比尔定律
透光率 （透射比）Transmittance
入射光 I0
透射光 It
透光率定义：
02:00:33
棱镜—根据光的折射现象进行分光
棱镜对不同波长的光具有不同的折射率，波长长的光， 折射率小；波长短的光，折射率大。
平行光经过棱镜后按波长顺序排列成为单色光；经聚焦
后在焦面上的不同位置上成像，获得按波长展开的光谱；
棱镜的光学特性可用色散率和分辨率来表征；
02:00:33
光栅
通过在平板玻璃或金属板上刻划出一道道等宽、等间 距的刻痕制成。常用的光栅刻痕密度每毫米为1200条、 1800条或2400条； 根据工作方式不同分为：
取值与浓度的单位相关 c：mol / L
K （或k）
摩尔吸光系数， L ·mol –1 ·cm -1
A cb
吸光系数， L ·g –1 ·cm -1
c： g / L
K a
A acb
比吸光系数 100mL ·g –1 ·cm -1
c：g / 100 mL K E1% 1cm
h
S3 S2 S1
E3 E2 E1
A
S0 E0 纯 电子能态 间跃迁 S2
h S1 S0
02:00:33
锐线光谱 A
分子内电子跃迁
带状光谱
吸收光谱（吸收曲线）
测量某物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长（）为 横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制吸光度随波长的变化 可得一曲线，此曲线即为吸收光谱。用来描述物质对不同 波长光的吸收能力。
02:00:33
吸收曲线的讨论：
①同一种物质对不同波长光的吸光度
不同。吸光度最大处对应的波长称为最
大吸收波长λ max ②不同浓度的同一种物质，其吸收曲 线形状相似λ max不变。而对于不同物质， 它们的吸收曲线形状和λ max则不同。 ③吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的 依据之一。
样品池 检测器
02:00:33
信号输出
9-3显色反应及显色条件的选择
显色反应
显色反应：将待测组分转变成有颜色化合物的反应
在吸光光度分析中所用到的显色反应主要有配位反应、 氧化还原反应等。
M
R
MR
（待测组分）
（显色剂）
（有色化合物）
用于吸光光度分析的显色反应应满足下列要求： ⑴ 选择性好，干扰少； ⑵ 灵敏度高； εmax=104-105 → 灵敏度高 εmax<103 → 灵敏度低 ⑶ 有色化合物的组成恒定； ⑷ 有色化合物的性质稳定 02:00:33 ⑸ 色差大 Δλ〉60nm
02:00:33
吸光度与显色剂用量关系
图是吸光度与显色剂用量关系的几种情况。
图2－11吸光度与显色剂用量的关系
从三个图中可以得到： 1) 可以选用的用量较宽 2) 可以选用的用量较窄 3) 表明随着显色剂用量的增加，吸光度也不断增大。
02:00:33
（2）溶液的酸度
溶液的酸度对显色反应的影响是多方面的 : 例如由于显色剂大多是有机弱酸，酸度影 响显色剂的离解，因而影响显色剂反应的完全 程度。 又如许多显色剂本身就是酸碱指示剂，配 位反应后的颜色必须与显色剂本身的颜色有显 著的不同。 二甲酚橙pH>6.3呈红紫色，pH<6.3呈黄色， 与金属配合物则呈红色，故只适合于pH<6.3的 条件。 02:00:33
02:00:33
3.样品室
样品室放置各种类型的吸收池 （比色皿）和相应的池架附件。吸 收池主要有石英池和玻璃池两种。 在紫外区须采用石英池，可见区一 般用玻璃池。
4.检测器
利用光电效应将透过吸收池的 光信号变成可测的电信号，常用的 有光电池、光电管或光电倍增管。
5. 结果显示记录系统
检流计、数字显示、微机进行 仪器自动控制和结果处理
02:00:33
基本组总结
紫外-可见分光光度计组件
光源
单色器
氢灯，氘灯，180 ~ 375 nm； 卤钨灯，250 ~ 2000 nm. 基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定 作用：将复合光色散成单色光 棱镜 玻璃， 350 ~ 2500 nm, 石英，185 ~ 4500 nm 光栅 平面透射光栅， 反射光栅 玻璃，光学玻璃，石英 作用：将光信号转换为电信号，并放大 光电管，光电倍增管，光电二极管，光导摄 像管（多道分析器） 表头、记录仪、屏幕、数字显示
100
T
A
50
A=∞ T% T = 100.0 % A = 0.0 T = 36.8 %
A
0.5
0
0
C
02:00:33
A = 0.434
A Kcb
K 比例常数
吸光系数 Absorptivity c 吸光物质的浓度： g/L, mol/L 入射光波长 温度
b 吸光液层的厚度，光程，cm
物质的性质
2.单色器
将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任
波长单色光的光学系统。
①入射狭缝：光源的光由此进入单色器； ②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；
③色散元件：将复合光分解成单色光；使不同波长的辐射
以不同的角度进行传播；棱镜或光栅； ④聚焦装置：透镜或 凹面反射镜，将分光 后所得单色光聚焦至 出射狭缝； ⑤出射狭缝。
（2）溶液的酸度
酸度还影响配合物的组成，Fe3+与磺基水杨酸 (Sal2-)的反应就是一个典型的例子。
pH=1.8～2.5 Fe3＋ ＋ Sal2－ ＝ Fe（Sal）＋ 紫红色
pH=4 ～ 8
pH=8 ～ 11.5 pH > 12
相互关系
02:00:33
1% E1 cm
10a 10
M
1% A E1 cm cb
吸光的加合性 多组分体系中，如果各组分之间无相互作用，其吸光度具 有加合性，即
A
Ai ibci b i ci
i i i
主要原因 非单色光 吸光质点的相互作用