锌指蛋白395的生物信息学分析叶俊华

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锌指蛋白核酸酶的作用原理及其应用

。该项技术已经被成功用于动植物基
因改造实验中 , 研究者根据靶 DNA 序列设计特异性的锌指蛋白 , 然后用锌指蛋白核酸酶 (Zinc finger
收稿日期 : 201007; 修回日期 : 20101107 基金项目 : 国家转基因重大专项与教育部创新团队项目 ( 编号： IRT0831)资助作者简介 : 钟强 , 博士 , 研究方向：生物信息学。 E-mail: zqiang320@ 通讯作者 : 赵书红 , 教授 , 博士 , 研究方向：动物分子生物学与育种。 E-mail: shzhao@
HEREDITAS (ຫໍສະໝຸດ eijing) 2011 年 2 月 , 33(2): 123― 130 ISSN 0253-9772
综述
DOI: 10.3724/SP.J.1005.2011.00123
锌指蛋白核酸酶的作用原理及其应用
钟强 , 赵书红
华中农业大学农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室 , 农业部猪遗传育种重点开放实验室 , 武汉 430070
Keywords: zinc finger domain; zinc finger protein; zinc finger nucleases; homologous recombination; gene targeting
锌指蛋白核酸酶是人工改造的蛋白 , 它利用了锌指结构域对 DNA 序列的特异性识别来达到准确定位靶点的目的 , 同时利用核酸酶的 DNA 水解活性 , 使靶 DNA 双链断裂 , 然后利用细胞的修复机制 , 引入基因突变
摘要: 锌指蛋白核酸酶 (Zinc finger nucleases, ZFN) 因其能特异性识别并切割 DNA 序列以及可设计性 , 被

ZFN基因编辑技术的原理与应用

ZFN基因编辑技术的原理与应用随着科技的快速发展，基因编辑技术在生物学和医学研究中发挥着越来越重要的作用。

在众多基因编辑技术中，ZFN（锌指核酸酶）基因编辑技术因其高效性和精准性在科学界备受关注。

本文将介绍ZFN基因编辑技术的原理以及在生物技术和医学领域中的应用。

ZFN技术以锌指蛋白为基础，借助DNA的序列特异性结合能力来指导特定基因的编辑。

锌指蛋白是一种含有锌指结构域的转录因子。

每个锌指结构域由30个氨基酸组成，能够识别特定的DNA序列。

通过设计锌指蛋白，可以选择性地靶向到目标DNA序列，并与DNA序列发生稳定的非共价相互作用。

ZFN基因编辑技术的实质是将特定的锌指蛋白与核酸内切酶融合形成一种酶-蛋白质复合体。

这种复合体能够通过识别目标基因的DNA序列，并在目标序列上形成DNA双链断裂。

在细胞修复过程中，通过非同源末端连接或同源重组的机制，可以实现对目标基因的精确编辑。

这种酶-蛋白质复合体可以通过基因转染技术导入到细胞中，使其具有特定目的的基因编辑能力。

ZFN基因编辑技术在生物技术领域有着广泛的应用。

首先，它可以用于研究基因功能和疾病发生机制。

通过编辑特定的基因，可以研究其功能和相互作用，并探索基因突变对疾病的影响。

其次，ZFN技术可以用于基因组的精确修饰。

通过定点突变或插入特定序列，可以改变目标基因的功能，用于改良农作物、生产工业酶、制造药物等。

此外，ZFN技术还可以用于模拟疾病模型。

通过编辑目标基因，可以模拟特定疾病的基因变异，从而更好地理解疾病的机制并开发有效的治疗方法。

除了在生物技术领域的应用外，ZFN基因编辑技术还具有巨大的潜力用于临床治疗。

目前，该技术已被用于修复基因突变导致的遗传病。

例如，使用ZFN技术可以修复造血干细胞中的基因缺陷，用于治疗遗传性疾病如血友病和免疫缺陷病。

此外，ZFN技术还可以用于癌症治疗。

通过编辑癌细胞中的靶基因，可以恢复抑癌基因的功能，抑制肿瘤的生长和扩散。

蛋白质INSM1中的锌指结构域ZF(4-5)的表达、纯化与表征

蛋白质INSM1中的锌指结构域ZF(4-5)的表达、纯化与表征王华谱;朱勤俊;刘买利;杨运煌;岳霞丽【摘要】Human insulinoma-associated protein 1 (INSM1) is a transcriptional regulator recognizing sequence-specific DNA through its C-terminal zinc finger (ZF) domains. INSM1 contains five zinc finger domains, whose structures are still not known; therefore, the mechanisms through which it recognizes DNA also remain unclear. In this study, we designed the recombinant plasmid pET-32m-INSM1(424-497), which can express the truncated INSM1 fragment containing the zinc finger domains 4 and 5 [i.e., ZF(4-5)]. Expression and purification of ZF(4-5) were explored in order to achieve high protein yield for further structural and functional study. Nuclear magnetic resonance (NMR) and circular dichroism (CD) spectra revealed that chelation of Zn2+ to C2H2 in the ZF(4-5) was important for its structural stability, and also confirmed that the active-sites, Zn2+-chelated histidines, had the δ -tautomeric form.%胰岛素瘤相关蛋白1(INSM1)是一类转录调节蛋白,通过其C-端的锌指结构域(氨基酸250-510)来识别序列特异性的DNA分子.INSM1的C-端包含有5个串联的锌指结构域,然而这些结构域的结构及其如何识别DNA的分子机制目前仍不清楚.通过重组构建的质粒pET-32m-INSM1(424-497)表达的蛋白质(氨基酸424-497)包含了最后两个锌指结构域4和5,简称为ZF(4-5).该文详细研究了蛋白质ZF(4-5)的诱导表达条件,得到了较高产率的纯化蛋白.核磁共振(NMR)谱和圆二色谱(CD)揭示了Zn2+对稳定锌指蛋白结构的必要性,以及C2H2-Zn2+结合的组氨酸呈现为δ-异构方式.【期刊名称】《波谱学杂志》【年(卷),期】2017(034)001【总页数】7页(P1-7)【关键词】液体核磁共振(solutionNMR);锌指蛋白;表达与纯化;结构与功能【作者】王华谱;朱勤俊;刘买利;杨运煌;岳霞丽【作者单位】华中农业大学理学院,湖北武汉 430070;波谱与原子分子物理国家重点实验室,武汉磁共振中心(中国科学院武汉物理与数学研究所),湖北武汉 430071;波谱与原子分子物理国家重点实验室,武汉磁共振中心(中国科学院武汉物理与数学研究所),湖北武汉 430071;波谱与原子分子物理国家重点实验室,武汉磁共振中心(中国科学院武汉物理与数学研究所),湖北武汉 430071;波谱与原子分子物理国家重点实验室,武汉磁共振中心(中国科学院武汉物理与数学研究所),湖北武汉430071;华中农业大学理学院,湖北武汉 430070【正文语种】中文【中图分类】O482.53人体内胰岛素瘤相关蛋白1（INSM1）是一类含有C2H2-型的锌指（zinc finger）结构域，能够识别特定碱基序列的转录调节因子[1]．锌指结构域蛋白简称锌指蛋白，由氨基酸残基与Zn2+结合形成具有指状空间构型的结构．锌指蛋白广泛存在于真核生物体中，比如人类基因组中有将近1%的基因编码锌指蛋白．锌指蛋白在细胞分化[2]、神经发育[3]和胚胎发育[4]等生命过程中有非常重要的作用，并与黑色素瘤[5]、神经细胞瘤[6]和糖尿病肾病[7]等疾病相关．INSM1最初从人的胰岛素瘤中分离鉴定，后来发现在神经内分泌系统[8]、胰腺[9]和相关肿瘤[10]中都有表达，对神经内分泌系统和胰岛的正常发育起着重要的调控作用．人体内INSM1含510个氨基酸，分子量为52.9 k．INSM1的C-端包含有5个串联的C2H2-型的锌指蛋白结构域（zinc finger 1-5，图1）．应用PSI-BLAST进行序列比对分析（如图1所示），发现人体内INSM1的锌指结构域与黑猩猩（Pan troglodytes）的同源蛋白的氨基酸序列相似度高达99.4%，与小鼠（Mus musculus）、非洲爪蟾（Xenopus laevis）和斑马鱼（Danio rerio）的同源性分别为90.6%、55.6%和55.6%，表明INSM1的锌指结构域在物种进化过程中具有高度保守性．目前，研究表明含有5个完整锌指结构域ZF(1-5)的INSM1能结合序列特异性的双链DNA（TG/TC/TC/TT/AGGGGG/TCG/A）[11]．然而，各个锌指结构域的结构以及识别特异性DNA的分子机制仍不清楚．为深入理解INSM1中的锌指结构域与序列特异性DNA的相互作用，我们尝试构建了包含不同锌指区间的质粒，比如ZF(1-3)、ZF(2-3)和ZF(4-5)等，来制备相应的锌指结构域样品．在成功克隆包含ZF(4-5)的质粒pET-32m-INSM1(424-497)的基础上，本文报道了对该蛋白的诱导表达和纯化，以及Zn2+对蛋白质结构域稳定性的影响．15N标记的ZF(4-5)的核磁共振（NMR）谱图表明该结构域具有折叠的三维空间结构．本工作为后续的ZF(4-5)结构和功能研究奠定了良好的前期基础．1.1 ZF(4-5)的克隆、表达与纯化采用聚合酶链反应（PCR）方法从HepG2肝癌细胞cDNA扩增出INSM1(424-497)基因，上游引物为5'-GGATCCGGCGACGGCGAGGGGG-3'，下游引物为5'-GGATCCTATCTGTTTTCGGATGG GTGGCAC-3'．扩增条件为98 ℃变性10 s，60 ℃退火15 s，68℃延伸30 s，共30个循环后结束反应．将N端含有His-tag （MHHHHHHSSGLVPRGS）的pET-32m(+)载体和扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳，胶回收后用BamH I酶切．回收酶切产物，用T4连接酶连接后转化至大肠杆菌DH5a，挑取单克隆菌落，筛选阳性克隆，提取重组质粒，进行序列测定．转化测序正确的重组质粒pET-32m-INSM1(424-497)到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落接种到5 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37 ℃、220 r/min的摇床中培养8 h，离心重悬后加入到100 mL M9液体培养基中，在37 ℃、220 r/min的摇床中过夜培养．将100 mL菌液全部转入到1 L的M9培养基中继续在37 ℃、220 r/min的摇床中培养至光密度值（OD）为0.6，向菌液中加入最终浓度为0.1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）进行诱导，17 ℃诱导20 h收菌．ZF(4-5)分别在传统的M9培养基和含0.25 mmol/L ZnCl2的M9培养基中进行表达，15N标记的ZF(4-5)通过加入含0.25 mmol/L ZnCl2和15NH4Cl（购自Cambridge Isotope Laboratories, Inc.）的M9培养基表达．采用缓冲溶液[含200 mmol/L NaCl、20 mmol/L磷酸缓冲盐溶液（PBS）、0.05% β-巯基乙醇，pH 7.0]超声裂解细胞，对表达的蛋白先进行Ni2+柱（GE Healthcare）分离纯化，然后进一步经分子筛层析柱（GE Healthcare）纯化．1.2 圆二色谱分析室温条件下在Chirascan 圆二色谱（CD）仪上进行远紫外圆二色谱（Far-UV CD）实验，氮气吹扫190～260 nm波长范围，石英比色皿光程为2 mm，扫描速度为50 nm/min，扫描3次，累加求平均值．二级结构计算采用软件CDNN Program（version 2.0）．1.3 NMR谱分析1.3.1 2D1H-15N HSQC和1H-15N HMQC谱用于NMR实验的缓冲溶液含100 mmol/L NaCl、20 mmol/L 2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）、0.02% NaN3、10 mmol/L二巯基苏糖醇（DTT）、5 mmol/L CaCl2、10% D2O，pH 6.5，15N-ZF(4-5)的浓度为0.5 mmol/L．2D1H-15NHSQC直接维（1H）和间接维（15N）谱宽分别为9 000 Hz和18 000 Hz，两维中心分别位于δH4.70和δN118.0，采样数据点阵t2× t1= 1 024 × 96，累加次数为4．2D1H-15N HMQC直接维（1H）和间接维（15N）谱宽分别为9 000 Hz和96 000 Hz，两维中心分别位于δH4.70和δN200.0，采样数据点阵t2×t1= 1 024 × 256，累加次数为64．1.3.2 旋转相关时间（τc）测量采用1D的1H-15N HSQC测定ZF(4-5)中骨架的15N的纵向弛豫时间（T1）和横向弛豫时间（T2）. T1和T2测定实验各选取10个不同的弛豫恢复时间，分别为0.05 s、0.10 s、0.20 s、0.30 s、0.40 s、0.60 s、0.80 s、1.00 s、1.50 s和2.00 s（T1）；0.01 s、0.03 s、0.05 s、0.07 s、0.09 s、0.11 s、0.13 s、0.17 s、0.21 s和0.25 s（T2）．旋转相关时间（cτ）计算公式如下[12]：(1)式中，T1和T2为ZF(4-5)骨架15N的纵向弛豫时间和横向弛豫时间，Nν为NMR实验时15N的进动频率（Hz）．上述所有NMR实验在Bruker Avance III 600 MHz NMR谱仪上测定，实验温度为298 K．NMR实验数据用NMRPipe软件进行变换处理[13]，采用Sparky软件进行分析[14]．2.1 ZF(4-5)的诱导表达与纯化图2为蛋白质ZF(4-5)在大肠杆菌（E. Coli.）中诱导表达和纯化的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）胶图．在M9培养基中经过IPTG诱导，仅能观察到非常微弱的蛋白质条带（-ZnCl2），表明ZF(4-5)基本不表达．当在M9培养基中加入0.25 mmol/L的ZnCl2后，ZF(4-5)诱导表达明显增强（+ZnCl2）．诱导表达的目标蛋白为可溶性蛋白，经过Ni2+柱和分子筛层析柱的先后纯化，蛋白产率可达20.0 mg/L．研究结果表明，外源性的Zn2+对ZF(4-5)的诱导表达是不可缺少的．2.2 Zn2+对ZF(4-5)结构稳定性的影响图3(a)为15N标记的ZF(4-5)的2D1H-15N HSQC谱，ZF(4-5)浓度为0.5 mmol/L，信号累加次数为4．从图中可以观测到：（1）1H-15N交叉峰具有很高的信噪比；（2）骨架1H-15N交叉峰的数目大致与该蛋白的氨基酸数目对应；（3）交叉峰两维的展宽分别为δH6.50～10.00和δN104.0～128.0；（4）各个交叉峰的强度相对均一．实验结果表明ZF(4-5)具有相对单一的构象和已折叠的二级和三级结构，可应用液体NMR方法解析其三维空间结构．氨基酸序列相似性分析表明ZF(4-5)包含两个C2H2-型锌指结构域，电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）实验（赛默飞世尔科技上海金桥实验室）进一步证实了实验表达的ZF(4-5)中存在结合态的Zn2+（未显示的实验数据）．然而，Zn2+对ZF(4-5)结构稳定性的影响尚需验证．首先，在15N-ZF(4-5)中加入浓度高达10.0 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），加入过程中样品保持澄清透明，无沉淀出现．2D1H-15N HSQC谱如图3(b)所示，发现1H-15N交叉峰的信噪比依然很高，然而在1H和15N两维展宽程度显著降低，呈现出无规则卷曲或仅含有少量二级结构的蛋白质谱峰特征．实验结果表明过量的EDTA虽然从ZF(4-5)中置换出Zn2+，没有直接导致蛋白的聚集沉淀，但是明显改变了蛋白质的折叠．其次，对加入过量EDTA的ZF(4-5)样品进一步进行了CD谱分析．实验结果如图3(c)所示，未加入EDTA的蛋白样品的Far-UV CD曲线（实线），在208 nm和222 nm附近有两个负吸收峰，该信号为α-螺旋的特征吸收峰．过量EDTA加入的样品的Far-UV CD曲线（虚线）发现前述α-螺旋的两个特征吸收峰消失，在203 nm附近出现一个更强的负吸收峰，该信号为蛋白质呈现无规则卷曲时的特征吸收峰．因此，Far-UV CD实验结果表明，当ZF(4-5)中的Zn2+被置换后，蛋白质的二级结构发生明显改变．因此Zn2+对维持该蛋白的稳定性有着重要的作用．2.3 ZF4-5在溶液中聚集态的表征蛋白质旋转相关时间（cτ）可以通过其骨架15N的横向和纵向弛豫时间估计[12]．研究表明，当蛋白质分子量在20 k以下时，分子量与cτ呈线性相关[15]．图4(a)和4(b)分别为ZF(4-5)的骨架15N的横向和纵向弛豫时间测量，最后计算的cτ为7.3 ns．图4(c)的相关性分析表明，ZF(4-5)的cτ所对应的分子量为9.6 k，与ZF(4-5)单体分子量相吻合，表明该蛋白质样品在研究状态下以单体为主要存在形式．2.4 ZF(4-5)中与Zn2+结合的His的互变异构体分析图1中氨基酸序列相似性分析表明，ZF(4-5)含有两个可与Zn2+结合的C2H2-型结构域．已有研究表明，在His咪唑环中的2D1H-15N HMQC谱中，可观测1H 与15N（2JHN或3JHN）的化学位移值的大小与谱峰强度，能够区分组氨酸的两个互变异构体，即δ-/ε-的异构体[16]．图5(a)为15N标记的ZF(4-5)的2D1H-15N HMQC谱，与Zn2+结合的4个His（H459、H464、H487和H492）咪唑环上通过2JHN或3JHN的1H-15N的交叉峰均已归属．这些交叉峰的信号模式表明这4个His都呈现为δ-异构体，即氢原子结合在δN上[图5(b)，δ1]．因此，ZF(4-5)中的Zn2+是与εN螯合的，图5(b)展示了C2H2-Zn2+的结合模式．本文通过对锌指蛋白INSM1的ZF(4-5)的诱导表达和纯化研究，得到了与Zn2+螯合的具有稳定三级结构的蛋白质样品，Zn2+对维持该蛋白结构的稳定性是必不可少的．对蛋白质样品进一步表征分析，该蛋白质在研究条件下主要呈现为单体，适合于NMR结构解析．该锌指结构域的三维空间结构及其与序列特异性的DNA结合的研究正在进行之中．【相关文献】[1] BEERLI R R, BARBAS C F. Engineering polydactyl zinc-finger transcription factors[J]. Nat Biotechnol, 2002, 20(2)： 135-141.[2] CHOMETTE D, FRAIN M, CEREGHINI S, et al. Krox20 hindbrain cis-regulatory landscape：interplay between multiple long-range initiation and autoregulatory elements[J]. Development, 2006, 133(7)： 1253-1262.[3] LEE S K, JURATA L W, FUNAHASHI J, et al. Analysis of embryonic motoneuron gene regulation： derepression of general activators function in concert with enhancerfactors[J]. Development, 2004, 131(14)： 3295-3306.[4] XUE L, CHEN X, CHANG Y, et al. Regulatory elements of the EKLF gene that direct erythroid cell-specific expression during mammalian development[J]. Blood, 2004, 103(11)：4078-4083.[5] SLUTSKY S G, KAMARAJU A K, LEVY A M, et al. Activation of myelin genes during transdifferentiation from melanoma to glial cell phenotype[J]. J Biol Chem, 2003, 278(11)：8960-8968.[6] TOMMERUP N, VISSING H. Isolation and fine mapping of 16 novel human zinc finger-encoding cdnas identify putative candidate genes for developmental and malignant disorders[J]. Genomics, 1995, 27(2)： 259-264.[7] HALAMA N, YARD-BREEDIJK A, VARDARLI I, et al. The Kruppel-like zinc-finger gene ZNF236 is alternatively spliced and excluded as susceptibility gene for diabetic nephropathy[J]. Genomics, 2003, 82(3)： 406-411.[8] PARLIER D, ARIZA A, CHRISTULIA F, et al. Xenopus zinc finger transcription factor IA1 (Insm1) expression marks anteroventral noradrenergic neuron progenitors in Xenopus embryos[J]. Dev Dynam, 2008, 237(8)： 2147-2157.[9] GIERL M S, KAROULIAS N, WENDE H, et al. The zinc-finger factor Insm1 (IA-1) is essential for the development of pancreatic beta cells and intestinal endocrine cells[J]. Gene Dev, 2006, 20(17)： 2465-2478.[10] BRESLIN M B, ZHU M, LAN M S. NeuroD1/E47 regulates the e-box element of a novel zinc finger transcription factor, IA-1, in developing nervous system[J]. J Biol Chem, 2003, 278(40)： 38991-38997.[11] BRESLIN M B, ZHU M, NOTKINS A L, et al. Neuroendocrine differentiation factor, IA-1, is a transcriptional repressor and contains a specific DNA-binding domain： identification of consensus IA-1 binding sequence[J]. Nucleic Acids Res, 2002, 30(4)： 1038-1045. [12] KAY L E, TORCHIA D A, BAX A. Backbone dynamics of proteins as studied by15N inverse detected heteronuclear NMR spectroscopy：application to staphylococcal nuclease[J]. Biochemistry, 1989, 28(23)： 8972-8979.[13] DELAGLIO F, GRZESIEK S, VUISTER G W, et al. NMRPipe： a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes[J]. J Biomol NMR, 1995, 6(3)： 277-293.[14] GODDARD T D, KNELLER D G. SPARKY 3. University of California, San Fransisco.[J]. 2008.[15] ROSSI P, SWAPNA G V, HUANG Y J, et al. A microscale protein NMR sample screening pipeline[J]. J Biomol NMR, 2010, 46(1)： 11-22.[16] PELTON J G, TORCHIA D A, MEADOW N D, et al. Tautomeric states of the active-site histidines of phosphorylated and unphosphorylated IIIGlc, a signal-transducing protein from Escherichia coli, using two-dimensional heteronuclear NMR techniques[J]. Protein Sci, 1993, 2(4)：543-558.。

锌指蛋白结构及功能研究进展

锌指蛋白结构及功能研究进展
赵楠;赵飞;李玉花
【期刊名称】《生物技术通讯》
【年(卷),期】2009(020)001
【摘要】锌指蛋白是一类具有手指状结构域的转录因子,对基因调控起重要的作用.根据其保守结构域的不同,可将锌指蛋自主要分为C2H2型、C4型和C6型.锌指通过与靶分子DNA、RNA、DNA-RNA的序列特异性结合,以及与自身或其他锌指蛋白的结合,在转录和翻译水平上调控基因的表达.我们简要综述了近年来锌指蛋白结构、分类及其与核酸及蛋白质相互作用等方面的研究进展.
【总页数】4页(P131-134)
【作者】赵楠;赵飞;李玉花
【作者单位】东北林业大学,生命科学学院,黑龙江,哈尔滨,150040;山东农业大学,园艺科学与工程学院,山东,泰安,271018;东北林业大学,生命科学学院,黑龙江,哈尔滨,150040
【正文语种】中文
【中图分类】Q513
【相关文献】
1.锌指蛋白结构域MIZ-1型包含蛋白基因研究进展 [J], 李璐璐;孙勇虎;刘红
2.锌指蛋白结构和功能研究进展 [J], 余晓丹;沈晓明;颜崇淮
3.Zn(Ⅱ)2Cys6锌指转录因子的结构和功能研究进展 [J], 梁甜甜; 王亦婧; 程晓婕;
曾斌; 贺斌
4.Zn(Ⅱ)2Cys6锌指转录因子的结构和功能研究进展 [J], 梁甜甜; 王亦婧; 程晓婕; 曾斌; 贺斌
5.tRNA修饰酶TiaS蛋白结构与功能研究及其锌指的潜在应用 [J], 董建树
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锌指蛋白ZNF598作为埃博拉病毒病治疗靶点的应用[发明专利]

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202210287712.0(22)申请日 2022.03.22(71)申请人中国人民解放军军事科学院军事医学研究院地址 100850 北京市海淀区太平路27号(72)发明人刘海楠　曹诚　刘萱　张迅　柏宇　(74)专利代理机构北京易捷胜知识产权代理事务所(普通合伙) 11613专利代理师齐云(51)Int.Cl.C12N 15/113(2010.01)A61K 45/00(2006.01)A61K 31/713(2006.01)A61P 31/14(2006.01)(54)发明名称锌指蛋白ZNF598作为埃博拉病毒病治疗靶点的应用(57)摘要本发明涉及锌指蛋白ZNF598(Gene ID:90850)作为埃博拉病毒病治疗靶点的应用，其特征在于，所述应用包括：采用能够抑制ZNF598表达的物质制备用于预防埃博拉病毒感染或治疗埃博拉病毒病的产品。

经实验证明，研究表明使用锌指蛋白ZNF598siRNA处理细胞后，细胞中埃博拉病毒复制显著降低，有效抑制了埃博拉病毒的增殖。

本发明还进一步筛选出了对ZNF598有显著敲低作用的siRNA，该siRNA具有更好的抑制埃博拉病毒增殖作用。

本发明为埃博拉病毒感染导致的急性传染病防治提供新的治疗策略。

权利要求书1页说明书5页序列表2页附图2页CN 114574491 A 2022.06.03C N 114574491A1.锌指蛋白ZNF598作为埃博拉病毒病治疗靶点的应用，其特征在于，所述应用包括：采用能够抑制ZNF598表达的物质制备用于预防埃博拉病毒感染或治疗埃博拉病毒病的产品。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述能够抑制ZNF598表达的物质包括但不限于ZNF598抑制剂、ZNF598 siRNA或敲除ZNF598表达的基因编辑工具。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ZNF598 siRNA为由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链退火形成的siRNA。

锌指结构：最普遍的核酸识别元件

锌指结构：最普遍的核酸识别元件赵志虎;马清钧【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2001(012)001【摘要】锌指是最大的DNA结合蛋白家族，是识别DNA最有效、最成功的一种结构元件。

其模块性结构特点及与核酸作用的相对简单性，使其成为研究蛋白核酸相互作用的理想材料，以及人为设计筛选新的核酸结合蛋白的最佳元件。

%Within the known classes of DNA binding proteins, t he zinc finger is the greatest family and are nature′s most successful designs for DNAbinding proteins. Owing to the modular nature and its simplicity of int eraction with nucleic acids, the zinc finger motif provides a good candidate for the study of proteinnucleic acids interaction and the rational design of site specific nucleic acids binding proteins.【总页数】6页(P36-41)【作者】赵志虎;马清钧【作者单位】军事医学科学院生物工程研究所;军事医学科学院生物工程研究所【正文语种】中文【中图分类】Q81【相关文献】1.光纤陀螺最简结构各元件对系统性能的影响 [J], 王政平;张延顺;史金辉;黄宗军;于鑫2.人工锌指核酸酶的电子设计与结构模拟 [J], 张勇;蒋泓;邓廷贤;粟文俊;杨莉珊;唐冬生3.识别序列为非回纹对称结构限制核酸酶的正确切割位点 [J], 颜炳学;李宁;吴常信4.用压电元件实时监测与识别板件结构约束刚度的变化 [J], 陈书婵;石立华5.锌指蛋白的核酸识别特异性研究进展 [J], 张书祥;赵志虎;马清钧因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

锌指蛋白HZF1基因功能和机制研究的开题报告

锌指蛋白HZF1基因功能和机制研究的开题报告一、研究背景锌指蛋白HZF1在细胞增殖、分化和凋亡等过程中扮演着重要的角色。

它含有多个锌指结构，能够与DNA结合并调节基因表达。

HZF1的功能包括维持细胞的稳定性和抵御各种外界刺激等。

同时，通过参与信号转导通路，HZF1也参与了许多疾病的发生和发展，如癌症、神经系统疾病等。

尽管HZF1的重要性已经被广泛认可，但其调控机制还有待深入研究。

目前已知HZF1的某些基因调控研究受到了微小RNA、蛋白质激活、DNA 甲基化等因素的影响，但具体的分子机制仍不清楚。

因此，对HZF1的进一步研究有助于深入了解基因调控的分子机制，并探索在疾病防治方面的应用。

二、研究目的通过RNAi和CRISPR/Cas9等技术，对HZF1的功能和调节机制进行研究，并探索其在疾病防治中的应用。

三、研究内容1. 构建RNAi和CRISPR/Cas9表达载体。

选用适当的导入载体，将RNAi和CRISPR/Cas9的基因片段克隆到载体中。

2. 鉴定载体的高效性。

通过细胞转染和DNA测序等方法，确定RNAi和CRISPR/Cas9的表达是否成功，并鉴定它们对HZF1的靶向效应。

3. 探究HZF1在基因调控中的作用。

利用RNAi和CRISPR/Cas9等技术，研究HZF1在基因表达、增殖、分化和凋亡等方面的作用，并探究其与其他分子因素之间的协同作用。

4. 分析HZF1在疾病发生和发展中的作用。

通过对HZF1在癌症、神经系统疾病等方面的作用进行分析，探索其在疾病防治中的应用价值。

四、研究意义HZF1作为一种调节基因表达的转录因子，具有广泛的生物学功能。

本研究旨在进一步研究HZF1在基因调控中的作用和机制，为深入理解基因调控的分子机制提供参考。

同时，通过对HZF1在疾病发生和发展中的作用进行研究，有望为治疗一些重要疾病提供理论依据和临床参考。

参与丝状真菌次级代谢Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白转录因子的生物信息学分析

基金项目：本研宄由国家自然科学基金 ( 3 1 7 6 0 4 9 4 ; 3 1 5 6 0 4 8 6 ) 、兰州理工大学博士基金 ( 2 0 1 4 G S O 2 2 6 1 )和兰州理工大学红柳优秀青年项目共同资助引用格式：W a n g Y 丄.，S h a n g M . M . ，Z h a n g W . W . ，a n d G u o X.J.，2021, Bioinformatics analysis o f Z n ( I I ) 2 C y s 6 zinc cluster protein tran，
蛋白跨膜、亚细胞定位、二级结构、三级结构和蛋白相互作用网络等。结果显示：它们均具有保守区域为
C X 2C X 6C X 6C X 2C X 6C 的锌指结构，且 N - 端都存在保守的 G A L 4 域，富含丝氨酸 (Ser),无明显跨膜结构
域，无信号肽，为定位于细胞核的亲水性不稳定蛋白，属于非分泌型蛋白。蛋白序列在多个氨基酸位点均存在
不同程度的磷酸化，其中丝氨酸发生磷酸化程度相对最高，在不同位置的磷酸化水平也不同。它们的二级结
构均主要以无规则卷曲为主，三级结构也较为相似。蛋白相互作用网络预测8 个转录因子的活性可以通过与
其他全局性转录因子或蛋白间的相互作用进行调节。本研宄的结果将为进一步研究丝状真菌次级代谢转录
/u m i g o /i w )中神经胶质毒素转录因子 G l i Z 、紫红曲霉(A/o ，ia«cu.s /)ur/)urei« ) 中橘霉素转录因子 C t n R 等 8 个参

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ZNF395的生物信息学分析
2006级本硕四班叶俊华指导老师：吴炳礼，许丽艳，李恩民
ZNF395, 全称为Zinc Finger Protein395, 又被称为PBF ，PRF1，DBP2，PRF-1，Si-1-8-14或DKFZp434K1210。

其氨基酸序列为
该基因包含了一个锌指motif 。

如下图所示：
280-305 YK C LWPN C GKVLRSIVGIKR H VKAL H
一个锌指motif 的三维结构如下：
ZNF395在染色体中的
定位为：chr8p21.1
（图
MASVLSRRLGKRSLLGARVLGPSASEGPSAAPPSEPLLEGAAPQPFTTSDDTP CQEQPKEVLKAPSTSGLQQV AFQPGQKVYVWYGGQECTGLVEQHSWMEGQ VTVWLLEQKLQVCCRVEEVWLAELQGPCPQAPPLEPGAQALAYRPVSRNID VPKRKSDA VEMDEMMAAMVLTSLSCSPVVQSPPGTEANFSASRAACDPWKE SGDISDSGSSTTSGHWSGSSGVSTPSPPHPQASPKYLGDAFGSPQTDHGFETDP DPFLLDEPAPRKRKNSVKVMYKCLWPNCGKVLRSIVGIKRHVKALHLGDTV DSDQFKREEDFYYTEVQLKEESAAAAAAAAAGTPVPGTPTSEPAPTPSMTGL PLSALPPPLHKAQSSGPEHPGPESSLPSGALSKSAPGSFWHIQADHAYQALPSF QIPVSPHIYTSVSW AAAPSAACSLSPVRSRSLSFSEPQQPAPAMKSHLIVTSPPR AQSGARKARGEAKKCRKVYGIEHRDQWCTACRWKKACQRFLD
1），全长513AA，包含两个内含子和九个外显子（图2），ZNF395及其邻近基因：
图1
ZNF395基因结构示意图：
图2
在获得ZNF395的基本信息后，为了进一步了解其功能，又做了几项的生物信息学分析：
1.在http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/上预测信号肽，得到SignalP-NN（图
3）和Signalp-HMM(图4)结果分析。

图3
图4
分析结果表明，该蛋白序列含有一段可疑的信号肽序列。

2.在http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/进行O型糖基化修饰预测，得到如
下结果：
从结果中可以看到，ZNF395的216，217，224，225，229，343，348，350，351，356，358，360等等部位可能发生糖基化修饰。

糖基化修饰位点相对较多。

3.在http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/上进行N型糖基化修饰预测，结果未发现N型糖基化修饰位点（图5）
图5
4.在/calc_mw_pi.html计算理论的分子量，等电点和磷酸化状态。

从图6可知，磷酸化状态下，锌指蛋白偏酸性，磷酸化位点越多，越偏酸性。

由于与锌指蛋白结合的DNA偏酸性，所以，ZNF395磷酸化时，失活，与DNA分离，去磷酸化后偏碱性，又能与DNA重新结合。

# Phosphates Molecular Weight Isoelectric Point
054951.5885 7.17
1 55029.5525 6.82
2 55107.5165 6.61
3 55185.4805 6.45
4 55263.444
5 6.31
5 55341.4085 6.20
6 55419.3725 6.09
7 55497.3365 5.99
8 55575.3005 5.90
图6
4.在http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/网站上预测ZNF395的磷酸化修
饰。

结果如图6所示，在图中我们可以知道，在ZNF395中，只有较多的磷酸化位点，其中丝氨酸为32个，苏氨酸为8个，酪氨酸未5个。

图6
在http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html上进行蛋白的二级结果预测。

α螺旋，β转角和无规则蜷曲所占的比例如图7所示。

图7
6. 在/predictNLS/中预测ZNF395的核定位信号，结果未发现核定位信号，从而进一步预测其亚细胞器的定位
(/cgi/var/nair/loctree/query), 它存在于胞浆/核内，在序列165-174为不完整的出核信号序列MDEMMAAMVL
7. 蛋白质功能域预测分析在ExPASy Proteomics Server：/和NCBI中均为找到ZNF395的功能域，原因可能未暂时未研究出来。

8. 进化分析
分别选取：人，黑猩猩，猕猴，小家鼠，褐家鼠，牛，马，狗，黑色短尾负
鼠，热带爪蟾，非洲爪蟾，红原鸡，鸭嘴兽，斑马鱼，海胆，黑青斑河豚，黑腹果蝇，致倦库蚊和赤拟谷盗线虫等物种，用clustal X 比对软件做序列比对分析。

然后用MEGA4软件做出ZNF395的基因进化树如图8。

从进化树中可以知道，ZNF395在高等哺乳动物中高度保守，聚类关系与物种的进化关系吻合；从▲出现脊椎动物与无脊椎动物的分化，但该基因在海胆中高度保守，出现在脊椎动物的聚类中
图8
十 ZNF395与疾病的关系
ZNF395能够识别乳突淋瘤病毒的E2结合位点，从而介导了乳突淋瘤的转录
抑制，现在已有一些国内企业开始生产ZNF395抗体（或称为Papilloma Virus
灰色短尾负鼠
鸭嘴兽
人黑猩猩猕猴小家鼠褐家鼠牛马狗
热带爪蟾非洲爪蟾红原鸡斑马鱼海胆
黑青斑河豚
黑腹果蝇
致倦库蚊
赤拟谷盗线虫
Homo Pan Macaca Mus Rattus Bos Equus Canis
Monodelphi X -tropical X enopus Gallus
Ornithorhy
Danio
Tetraodon
Strongyloc Drosophila Culex Tribolium ▲
Regulatory Factor PRF-1）作为治疗乳突淋瘤药物。

在神经细胞中，ZNF395结合到基因启动子区的GCCGGCG 上（为反式调节元素），在神经元细胞中启动亨廷顿疾病相关基因的转录。

ZNF395联合磷酸肌醇-3激酶2B能将银屑病关节炎病人与正常人区分。

亨廷顿舞蹈疾病到现在还是不能治愈，如果有机会进入试验室研究的话我想具体研究一下ZNF395于亨廷顿基因的作用机制，能否为其他单基因遗传疾病的治疗提供一个平台。

现在已有国内企业开始生产ZNF395抗体作为治疗乳突淋瘤的治疗手段，但是我在国外网站查找时却什么都没有发现，所以这可能是一起伪科学时间吧。

不过，我认为这也并不是没有可能的，还有待于我们去进一步研究发现。