农业生防微生物制剂的合成与作用机理及定向改造

项目名称：农业生防微生物制剂的合成与作用机理及定向改造首席科学家：邓子新上海交通大学起止年限：2009.1至2013.8依托部门：教育部上海市科委一、研究内容（一）拟解决的关键科学问题1、重要生防基因结构、功能与代谢网络，活性产物的合成机理：前期973项目初步挖掘和揭示了生防微生物制剂的主要功能基因，增加了研究的针对性和特异性。

为了最终实现生防微生物制剂的定向分子设计和优化，必需采用最新的分子生物学研究手段，全面、系统地分析这些基因的结构与功能，结合宿主、外部环境等考察生防制剂的代谢网络，阐明生物活性物质的合成与调节机理。

2、生防微生物制剂作用的分子机制：我国缺乏对多数生防微生物制剂作用机制的研究，其中很多连活性组份都尚未确定，因此在施用过程中缺乏针对性、互补性和规律性，大大降低了生防微生物制剂的杀虫防病能力。

分子作用机制的揭示也是定向改造生防微生物制剂的必要前提，服务于提高特异性和活性、降低毒副作用、拓展杀虫防病谱的目标。

3、生防微生物制剂的定向改造与性能优化：生防微生物制剂合成与作用机理的阐明最终要服务于新型生防微生物制剂的分子创制，显著提高其在农业生产中杀虫防病方面的贡献。

因此，采用组合生物合成、代谢工程、基因（组）改组、剂型匹配等先进分子生物学手段优化生防微生物制剂的杀虫防病性能、提升其稳定性和持效期，是相关基础研究成果向农业生产和农药产业转化的关键所在。

（二）主要研究内容本项目围绕3个关键科学问题，将针对我国农业生防微生物制剂中最具代表性的5类微生物开展研究工作。

1、放线菌微生物农药放线菌来源微生物农药是国家长期以来投入最大、施用面积最广和种类最多的生防微生物制剂，也在微生物农药产业中占有最大的比重，因此加大对放线菌来源微生物农药的研究具有更为显著的社会效益和经济效益。

对该类农药分两个侧重点进行研究：一是作用机理和结构改造的研究，包括扩大对其他重要放线菌微生物农药有效组份和作用机理的研究，对井冈霉素、多氧霉素、阿维菌素、南昌霉素等生物合成机理较为清晰的农药进行作用机理研究，以及在合成机理和作用机理基础上的定向结构与活性改造；二是深入揭示尼可霉素、阿维菌素、多拉菌素、多氧霉素等的生物合成机理和调控机理，在此基础上定向高产和积累最佳活性组份，同时通过全局性调节因子的遗传操作并结合培养条件的改变挖掘新结构微生物农药。

2、芽孢杆菌微生物制剂在Bt全基因组序列分析的基础上，利用表达谱基因芯片、lacZ、gfp基因转录分析等技术手段，重点研究Bt芽胞和晶体形成过程中cry基因的表达调控网络；围绕自主发现的cry类基因（cry1Ah、cry1Ie、cry7Ba1、cry51Aa1和cry55Aa1等），研究杀虫蛋白结构及其杀虫作用机理；研究Cry晶体蛋白的三维结构与功能，以及Bt非特异性毒力因子plcR的功能与表达调控；研究Bt杀虫基因的修饰改造与分子设计，改进Bt接合转移遗传改良方法。

3、昆虫病毒微生物制剂利用蛋白质组学等技术揭示BV的结构组成、研究ODV中肠感染和BV膜融合的分子机理；利用显微成像等技术研究病毒与宿主细胞骨架的相互作用及病毒在细胞内的运输；利用重组病毒等技术研究病毒抗宿主细胞凋亡，从而揭示杆状病毒感染的分子机理；通过基因改良、臵换等构建重组病毒，提高病毒的毒力和宿主范围，为发展新一代改良型病毒杀虫剂提供理论基础和新方法。

4、害虫生防真菌研究真菌-昆虫实时分子互作的转录组，发掘和鉴定新的毒力基因，同时模拟胁迫条件下进行生防真菌的转录组研究，发掘鉴定抗逆相关的新基因；对鉴定的毒力基因、抗逆基因或外源昆虫特异性毒素多肽进行基因合成，利用专性表达新技术对目标基因进行定位表达或组成型表达，获得单价或多价转化的高效抗逆多靶标工程菌株；基于所获遗传改良的工程菌株研制稳定的新型真菌杀虫剂，建立适合新型真菌杀虫剂的应用配套技术体系。

5、假单胞菌农药阐明吩嗪类化合物、藤黄绿菌素等假单胞菌农药的生物合成分子机理，获得新结构衍生物；揭示假单胞菌农药的合成调控机制，揭示植物不同根系分泌物对假单胞菌生物农药产生的调节机制，建立生物农药及调节细菌菌群传感的信号分子在培养液和环境中痕量分析技术；研究吩嗪-1-羧酸等对病原菌的作用机制；研制新型稳定的纳米生物农药制剂，实现生物农药的有效释放，提高生防效果；分离新的假单胞菌农药及其合成基因。

二、预期目标(一) 总体目标以我国特有的或重要的农业生防微生物及其产物为研究对象，在前期973项目新基因发掘和功能基因研究基础上，综合利用微生物功能基因组学、代谢组学等现代系统生物学理论与实验体系以及生物芯片、基因叠加、组合生物合成等先进的技术手段，深入研究其生物合成与调控机理、生防作用的分子机制及定向改良，增强和拓展生防微生物的杀虫防病功能、改造和优化生防微生物产物的结构和活性，以进一步提高微生物农药在防治农业病虫害、促进农作物优质高产、保障生态环境及农产品安全等方面的成效。

力求获得相关基础研究新的突破和一批重要成果，为新一代高效、广谱微生物农药的开发奠定理论基础和提供新的基因与产品。

通过本项目的实施，应使我国微生物农药的应用基础研究在整体上达到国际先进水平，某些方面形成自己的优势和特色，从而为我国农业的可持续发展和生态环境保护做出重大贡献。

同时获得多种性能优化的生防微生物制剂，用于和促进农业生产及微生物农药产业。

培养和造就一批青年学科带头人和学术骨干，促进我国农业生防微生物科学事业的发展。

（二）五年预期目标：1. 阐明井冈霉素、多氧霉素、申嗪霉素、苏云金芽孢杆菌、白僵菌、杆状病毒等多种生防微生物制剂的杀虫防病机理；2. 定向构建多种结构和活性改变的农用抗生素，构建多功能、多优点的芽孢杆菌、白僵菌、杆状病毒等重组活体生防制剂；3. 继续分离50种以上具有自主知识产权的杀虫防病基因；4. 在国内外核心刊物发表200篇以上论文，其中SCI源杂志发表120篇以上，申请或获得国内外发明专利40项以上；5. 获得具有应用前景的重组微生物制剂15个以上；6. 培养2-3名国家杰出青年基金获得者和150名左右的研究生，培养一支高水平的生防微生物研究队伍。

三、研究方案（一）总体研究思路、技术路线及可行性1、总体研究思路：面向农业病虫害防治、农作物优质高产、保障生态环境及农产品安全的国家重大战略需求，紧跟国际本领域研究前沿，依托前期973项目的丰硕研究成果，以放线菌、芽孢杆菌、病毒、杀虫真菌和假单胞菌农药制剂为主要研究对象，在功能分析和作用机理的研究基础上实现对生防微生物制剂的定向分子设计。

在基因功能的分析方面，对已经初步鉴定的功能相关基因，结合基因组学的研究成果，在整体水平研究基因的催化功能和调节机制，并辅以有针对性的生物活性测定检测各种突变体杀虫防病能力的变化；继续挖掘新功能基因。

在杀虫防病作用机制方面，一方面确定主要活性组份，另一方面确定作用靶点和作用模式并深入揭示作用机理，还要摸索掌握外部环境条件对杀虫防病作用的影响。

在定向优化生防微生物制剂方面，充分利用其他生防微生物的研究成果和研究手段，构建多价和复合剂型生防微生物制剂，实现各课题之间的有效交叉和促进。

2、技术途径现代生物技术的飞速发展对生防微生物研究的各个方面将带来巨大影响，因此在各个研究环节采用多种研究手段将大大提高研究结果的正确性和有效性。

（1）基因组学基础上的基因功能分析：在前期973项目支持下，已经获得了杆状病毒、苏云金芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、吸水链霉菌的全基因组序列，国际上也有其它放线菌、杀虫真菌和假单胞菌的全基因组序列发表，为我们在组学水平上系统考察基因的生物合成功能和调节功能提供了重要保证，有利于快速揭示生物合成途径和调控网络，有利于综合考察外源基因引入对生防微生物的影响。

（2）生物合成功能基因分析：通过体内基因敲除与回补初步确定基因功能，通过异源蛋白超量表达和体外酶促分析初步确定功能蛋白的催化功能及底物特异性，对催化新颖化学反应的蛋白通过晶体衍射、核磁共振等手段阐明催化机理，为组合生物合成和代谢工程改造提供候选基因。

（3）生物合成调节基因功能分析：通过体内基因敲除与回补或RNAi技术初步确定功能相关性，然后通过实时定量PCR、凝胶阻滞试验、S1核酸酶作图、足印分析等技术阐明调控机制，在转录组水平揭示途径专一性或全局性调节因子，指导生防微生物制剂的高产和作用发挥。

（4）作用机制的阐明：利用生物活性测定来追踪和确定关键活性作用组份，并利用活体细胞或酶进行体内体外分析确定作用靶点和作用模式，继而通过蛋白共结晶、核磁共振、圆二色谱、荧光淬灭FRET等阐明作用机制。

（5）生防微生物制剂的定向改造：全基因组水平的DNA改组（DNA shuffling）技术是显著提高生防微生物性能和产量最为有效的手段之一；在生物合成功能分析基础上也可以通过DNA改组改变单一蛋白的催化性质及其他重要性质，可以通过代谢工程和组合生物合成手段定向改造生物合成途径，产生新结构新活性制剂。

3、取得重大突破的可行性分析（1）前期973项目奠定了良好的研究基础：本项申请所提出的主要科学问题是在前5年的973项目研究进展基础之上提出的，因此具有扎实的理论和技术基础。

前期研究不但积累了大量的功能基因、优化了针对各生防微生物的遗传操作体系，而且各课题组在多方向、多途径摸索过程中建立了有针对性的研究方向。

（2）良好的研究平台和先进的管理体系：本项目依托5个国家重点实验室和8个部门开放实验室，有先进的研究设施和良好的工作条件，已基本上具有开展相关研究工作的各种条件；前期项目执行过程中形成了良好的协作机制、滚动机制和奖惩机制等先进管理经验，为本项目的顺利开展和高效管理提供了宝贵经验。

（3）高水平的配合默契的研究队伍：研究队伍的主体来自于前期项目，课题与课题之间、课题内部经过一段时间的磨合，在任务分配、技术和材料交流、项目管理等方面都形成了默契，并营造了非常好的学术交流氛围，成为科学研究顺利进行的重要保证。

（二）与国内外同类研究相比的创新性及特色1、以我国丰富的生防微生物资源为基础，选择在农业病虫害防治中效果最显著、影响最广泛、最具国际竞争力的放线菌、芽孢杆菌、杆状病毒、杀虫真菌和假单胞菌为研究对象，研究成果将直接提升生防微生物制剂在农业中的贡献。

2、采用临床用药作用机理研究模式研究生防微生物制剂作用机理，通过体内体外分析寻找作用靶点，通过共结晶、核磁共振等手段揭示作用机理，提高生防微生物制剂作用的特异性并为定向改造奠定基础。

3、在生物合成机理和作用机制研究基础上，通过基因组改组、组合生物合成和代谢工程等手段定向构建多价、性能优良的新型生防微生物制剂，并通过项目内各课题组间的有机交叉构建复合剂型生防微生物制剂。

4、在前期973项目的执行过程中，形成了一支年富力强、乐于合作、善于交流和具有丰富科研经历的生防微生物研究骨干队伍，项目良好的运转体系也为今后项目的顺利实施铺平了道路。