肥胖MC4R重组腺病毒表达载体的构建及鉴定
大鼠血小板衍生生长因子C重组腺病毒载体的构建及在内皮祖细胞中的表达
大鼠血小板衍生生长因子C重组腺病毒载体的构建及在内皮祖细胞中的表达李锋;罗文军;唐博;陈以宽;孙建明;付健【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2013(42)16【摘要】目的构建含大鼠血小板衍生生长因子C(PDGF-C)基因的pAD-EGFP-PDGF-C的重组腺病毒表达载体,体外转染骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)并观察目的基因蛋白及mRNA表达情况.方法通过逆转录聚合酶链式反应技术(RT-PCR)法从pIRES2-EGFP-PDGF-C真核表达载体中获得PDGF-C目的片段,经BP重组与LR 重组插入到pAD/CMV/V5-DEST,构建pAD-PDGF-C-IRES2-EGFP腺病毒载体.酶切及DNA测序鉴定后转染HEK293A包装、纯化,测定病毒滴度后转染大鼠骨髓源性EPCs,应用Real-time qPCR、蛋白免疫印迹法(Western blotting)等方法检测PDGF-C蛋白及mRNA的表达.结果核酸内切酶消化及PCR分析证实PDGF-C基因成功插入pAD/CMV/V5-DEST腺病毒载体,转染后荧光显微镜下观察可见绿色荧光蛋白表达,转染48 h后实时定量酵素聚合反应技术(Real-time qPCR)测定EPCs中PDGF-C含量明显提高(P＜0.05),Wester blotting检测证实在46×103存在特异性条带.结论成功构建了大鼠PDGF-C基因的腺病毒表达载体pAD-EGFP-PDGF-C,体外转染大鼠骨髓源性EPCs能高效表达目的基因产物,为后续研究PDGF-C基因功能以及进一步开展基因治疗奠定了基础.【总页数】4页(P1837-1840)【作者】李锋;罗文军;唐博;陈以宽;孙建明;付健【作者单位】重庆医科大学附属第二医院血管外科 400010;重庆医科大学附属第二医院血管外科 400010;重庆医科大学附属第二医院血管外科 400010;重庆医科大学附属第二医院血管外科 400010;重庆医科大学附属第二医院血管外科 400010;重庆医科大学附属第二医院血管外科 400010【正文语种】中文【相关文献】1.血管内皮生长因子165基因重组腺病毒载体的构建及转染内皮祖细胞的实验研究 [J], 赵洪雯;余荣杰;彭侃夫;刘宏;吴雄飞;贺伟峰;张晓蓉2.内皮抑素重组腺病毒表达载体构建及对内皮细胞增殖的影响 [J], 唐辉;徐永清;李春晓;张秀琼;郑天娥;刘旭盛;梁晚益3.eNOS基因重组腺病毒载体在大鼠骨髓来源内皮祖细胞中的表达分析 [J], 刁玉刚;金强;李林;周锦;陈克研;张铁铮4.pEGFP-Kallikrein重组真核表达载体的构建及其在兔内皮祖细胞中的表达 [J], 姜虹;李大庆;张运;刘春喜;冯进波;王荣5.内皮抑素重组腺病毒表达载体的构建及其对血管内皮细胞增殖特性的影响 [J], 唐辉;刘旭盛;梁晚益;李金玺;张小蓉;黄跃生因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
携带c-myc基因重组腺病毒的构建和鉴定及其在豚鼠耳蜗中的表达与分布
携带c-myc基因重组腺病毒的构建和鉴定及其在豚鼠耳蜗中的表达与分布韩宇;钟翠萍;陈阳;邱建华【期刊名称】《中国听力语言康复科学杂志》【年(卷),期】2011(000)002【摘要】目的构建携带c-myc基因的重组腺病毒表达载体,并观察其在豚鼠耳蜗内的表达分布,为探讨该基因的功能奠定实验基础.方法利用细菌内同源重组的方法.构建携带c-myc基因的重组腺病毒表达载体(Ad.c-myc-EGFP).并分别应用酶切、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和测序方法鉴定腺病毒的构建情况.利用豚鼠耳蜗内显微注射术、Western blot及荧光显微镜观察注射后该蛋白在耳蜗中的表达及分布特性.结果经酶切、RT-PCR和测序鉴定,质粒构建正确,重组腺病毒Ad.c-myc-EGFP构建成功.Ad.c-myc-EGFP腺病毒豚鼠耳蜗内注射后第三天便可通过荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白的广泛分布,且WesternBlot方法证实它可以上调耳蜗内c-Myc蛋白的表达.结论本实验成功构建了携带c-myc基因的重组腺病毒表达载体.它可以有效地感染豚鼠耳蜗内各种细胞.为深入研究C-MYC基因在耳蜗中的作用奠定了实验基础.【总页数】5页(P12-16)【作者】韩宇;钟翠萍;陈阳;邱建华【作者单位】第四军医大学西京医院耳鼻咽喉头颈外科,西安,710032;第四军医大学西京医院耳鼻咽喉头颈外科,西安,710032;第四军医大学西京医院耳鼻咽喉头颈外科,西安,710032;第四军医大学西京医院耳鼻咽喉头颈外科,西安,710032【正文语种】中文【相关文献】1.携带鸡贫血病毒凋亡素基因重组腺病毒质粒的构建及鉴定 [J], 邓守明;蔡召忠2.腺病毒携带的LacZ基因在豚鼠耳蜗中的表达 [J], 时利;翟所强;郭维;胡吟燕3.携带Mathl基因的重组腺病毒构建和鉴定及在豚鼠耳蜗中的表达 [J], 李泽文;刘英鹏;龚树生;王国鹏4.携带人血红素氧合酶 - 1基因重组腺病毒的构建及鉴定 [J], 姜大春;何国祥;刘建平;张倩;唐兵;李德5.携带KGF基因重组腺病毒载体的构建与鉴定 [J], 贾庆华;哈小琴;吕同德;刘春杰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
重组腺病毒载体的构建【精品推荐】
腺病毒载体的特点
n 主要以Ad5型病毒为框架构建 n 具有携带外源基因和转移外源基因的双
重功能 n 可插入长达5kb的外源基因 n 通过受体介导的细胞内吞作用进行基因
转移 n 安全性，复制缺陷（E1区缺陷）
腺病毒载体的特点
n 保留了E3区的腺病毒－－可逃逸宿主免 疫应答，可用于体内基因治疗
重组腺病毒的鉴定
n 病变293细胞于液氮、37°C反复冻融， 离心
n 取上清提取重组病毒DNA n 用目的片段引物和病毒基因组特征片段
引物作PCR
病毒滴度测定
n 24孔培养板每孔接种1×105个293细胞 n 培养24小时后，取病毒转染液0.2ml加
PBS至总量2ml，混匀后作10倍比稀释至 第8管，每孔加入不同稀释度的病毒液 0.2ml。 n 37°C 5%CO2培养1小时后，每孔补加 1.5ml培养液，继续培养36－48小时
病毒滴度测定
n 观察细胞病变情况，取100%出现CPE的 稀释度计算病毒滴度： 105细胞×稀释度×10个病毒/细胞 pfu/ml=
重组病毒的扩增
n 293细胞大规模培养：悬浮培养，单层培 养
n 用收集的病变细胞培养上清或冻融上清 感染293细胞
n 反复培养、感染 收集大量的病变细胞 及病毒上清
n 不整合到宿主基因组 n 增殖和非增殖细胞均可感染
构建腺病毒载体的要素
n 腺病毒基因组质粒 n 穿梭质粒 n 目的基因片段 n 包装细胞
AdMax™ system
穿梭质粒
pDC315
腺病毒载体的包装胞细
n HEK293细胞－－E1区缺陷互补的细胞系 悬浮HEK293细胞，易大规模培养，可用 于腺病毒大规模制备。但不易长期保持 稳定。 单层培养HEK293细胞，稳定，用于 重组腺病毒载体构建、蚀斑挑选。也可 用于腺病毒扩增。
大鼠微管相关蛋白4重组腺病毒载体的构建及在细胞中的表达鉴定
大鼠微管相关蛋白4重组腺病毒载体的构建及在细胞中的表达鉴定房亚东;徐雪;党永明;郑霁;张西联;张家平;陈渝;张琼;黄跃生【期刊名称】《第三军医大学学报》【年(卷),期】2006(28)9【摘要】目的构建大鼠微管相关蛋白4(m icrotubu le-ossoc iated prote in 4,MAP4)重组腺病毒载体,并转染新生大鼠体外培养的心肌细胞进行表达和鉴定,为真核表达及有关实验研究提供基础。
方法设计1对引物,应用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术,从大鼠心肌细胞总mRNA中扩增出MAP4 cDNA,并将MAP4 cDNA克隆到腺病毒穿梭质粒pShuttle2中,构建pShuttle2-MAP4表达质粒。
将此表达质粒扩增纯化酶切获得含有目的片段MAP4 cDNA的表达盒与Ad-eno-X V iru l DNA重组并线性化后转染HEK293T细胞,包装产生大鼠MAP4重组腺病毒。
并且转染新生大鼠原代心肌细胞,应用免疫组化的方法进行表达鉴定。
结果扩增所得的MAP4 cDNA片段经酶切鉴定、PCR扩增、DNA测序最终确定为大鼠MAP4基因,所得大鼠MAP4重组腺病毒滴度为2.3×108pfu/m l。
转染原代心肌细胞48 h后MAP4表达显著增强。
结论为研究MAP4的生物学活性及功能的基因治疗提供了基础。
【总页数】3页(P880-882)【关键词】MAP4;腺病毒;cDNA;微管相关蛋白【作者】房亚东;徐雪;党永明;郑霁;张西联;张家平;陈渝;张琼;黄跃生【作者单位】第三军医大学西南医院全军烧伤研究所创伤烧伤与复合伤国家重点实验室;成都军区总医院普通外科【正文语种】中文【中图分类】Q51;Q782【相关文献】1.大鼠弹力蛋白原基因重组腺病毒载体的构建及在血管平滑肌细胞中的表达 [J], 熊江;殷恒讳;朱易凡;叶财盛;王深明2.hTERT启动子调控的SEA-CD80基因共表达重组腺病毒载体的构建及在不同肿瘤细胞中的表达鉴定 [J], 司少艳;刘俊丽;王晓菲;谭小青;宋淑军3.核心结合因子(Cbfa1/Runx2)重组腺病毒载体的构建、鉴定及在脂肪来源干细胞中的表达 [J], 张辛;杨民;林霖;陈苹;马康涛;敖英芳;周春燕4.人LIM矿化蛋白1基因腺病毒重组表达载体构建及在犬骨髓间充质干细胞中的表达 [J], 蒲超;倪卫东;高仕长;邱宇5.人脑源性神经营养因子重组腺病毒载体的构建、鉴定及其在HEK293A细胞中的表达 [J], 丛明;李谌因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
多药耐药基因-腺病毒重组表达载体的构建及鉴定
多药耐药基因－腺病毒重组表达载体的构建及鉴定【摘要】目的构建多药耐药（multidrug resistance，MDR）基因-腺病毒重组表达载体。
方法将MDR1基因插入到腺病毒载体，用磷酸钙沉淀法将此重组载体转染到293细胞，制备重组病毒悬液并感染靶细胞进行鉴定。
结果构建的MDR1-腺病毒载体在293细胞中大量产生，病毒滴度达109 PFU/ml，此病毒感染靶细胞后，在靶细胞中有MDR1基因的表达。
结论成功构建了MDR1-腺病毒重组表达载体。
【Abstract】Objective Construction of multi-drug resistance gene (MDR) - adenoviral recombinant expression vector．Methods MDR1 gene will be inserted into the adenovirus vector，by calcium phosphate precipitation method the recombinant plasmidtransfect into 293 cells．Recombinant virus suspension is made and infeced target cells and to indentify．Results Constructed MDR1- adenovirus vector produces a large number in 293 cells，the virus titer is up to 109 PFU/ml．After the recombinant virus infectedtarget cells in the target cells have the expression of MDR1 gene．Conclusion MDR1- recombinant adenorirus vector has been successfully constructcd．【Key words】Multi-drug resistance gene (MDR1)；Adenovirus vector；Transfection多药耐药性（multidrug resistance，MDR ）是指肿瘤细胞能对多种结构、功能及杀伤机制均不同的化疗药物产生耐受。
重组腺病毒载体AdOX40Ig的构建、表达及相关体外实验
重组腺病毒载体AdOX40Ig的构建、表达及相关体外实验陈志红;赵媛媛;张守亮;林建扬;魏法星;朱伟【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》【年(卷),期】2013(023)001【摘要】Objective:To construct and identify recombinant adenovirus vector containing the human OX40-Ig1G1 fusion gene,then to infect the HL-7702 liver cells to filter out the best infective dose and detect expression of OX40Ig,which lay a foundation for the immune therapy inhibitory after organ transplantation.Methods:Specific OX40 and hIgG1 Fc primers were designed according to GenBank,and subcloned into the pAdTrack-CMV shuttle plasmid after PCR and identification.Retransformed into BJ5183 competent cells with pAdeasy-1 by calcium chloride method.The recombinant plasmid was detected by PCR and DNA sequence analysis and was transfected into 293A cells.The recombinant adenovirus infected HL-7702 liver cells and filtered out the best infective dose.OX4OIg gene expression was detected by indirect immunofluorescence assay.OX40Ig protein expression was detected by ELISA.Results:pTOX40Ig and pAdOX40Ig were constructed successfully according to restriction endonuclease analysis.293A cells were transfected,and then the purified recombinant adenovirus infected HL-7702 liver cells.10 MOI was the best infective dose.OX40Ig effective expression was detected in HL-7702 liver cells.Conclusion:The recombinantadenovirus vector AdOX40Ig carrying the human OX40-IgG1 fusion gene was successfully constructed,and OX40Ig effective expression was found in HL-7702 liver cells in vitro.%目的:构建并鉴定含人OX40-IgG1融合基因的重组腺病毒载体,并感染人肝HL-7702细胞,筛选出最佳感染剂量并检测OX40Ig的表达情况,为进一步用于器官移植后的抗排斥治疗奠定基础.方法:根据基因库公布的人OX40和hlgGl Fc片断序列设计特定引物,通过聚合酶链反应扩增并鉴定后,酶切插入穿梭质粒pAdTrack-CMV中.随后与pAdeasy-1腺病毒质粒以氯化钙法共转化BJ5183感受态细胞,重组质粒经鉴定正确后,大量扩增为腺病毒载体.再经293A细胞包装、扩增并纯化后感染HL-7702肝细胞,筛选出最佳感染剂量,并采用间接免疫荧光法检测其中外源性OX40lg基因的表达,采用ELISA法测定肝HL-7702细胞上清中OX40Ig蛋白的含量.结果:转移质粒pTOX40Ig经酶切及测序鉴定正确.重组腺病毒质粒经酶切鉴定正确,并成功转染了293A细胞.得到的病毒液经纯化扩增后进一步感染肝HL-7702细胞,经筛选,10 MOI为最佳感染剂量,并且可以检测到OX40Ig目的基因及其蛋白的表达.结论:成功构建了重组腺病毒载体AdOX40Ig,并且可在肝细胞HL-7702中表达相应的目的基因及蛋白.【总页数】5页(P12-16)【作者】陈志红;赵媛媛;张守亮;林建扬;魏法星;朱伟【作者单位】江苏大学附属人民医院普外科,江苏镇江212002;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏镇江212013;江苏大学附属人民医院普外科,江苏镇江212002;江苏大学附属人民医院普外科,江苏镇江212002;江苏大学附属人民医院普外科,江苏镇江212002;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏镇江212013【正文语种】中文【中图分类】R967【相关文献】1.重组Ad-Cp-CDglyTK双自杀基因腺病毒载体构建及体外抑制鼻咽癌细胞的实验研究 [J], 王国慧;何军芳;樊卫;吴沛宏2.大鼠UT-B重组腺病毒载体的构建及体外转染Caco-2细胞后基因表达 [J], 张征;刘怡晟;蒋更如;陈凉;潘曙明3.以AdMax载体系统构建和制备肾癌相关抗原G250基因重组腺病毒表达载体[J], 齐桓4.构建人基质金属蛋白酶1基因重组腺病毒载体及体外降解Ⅲ型胶原的检测 [J], 杜超;蒋明德;曾维政;郑淑梅;5.构建人基质金属蛋白酶1基因重组腺病毒载体及体外降解Ⅲ型胶原的检测 [J], 杜超;蒋明德;曾维政;郑淑梅因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
骨形成蛋白9腺病毒表达载体的构建及鉴定
骨形成蛋白9腺病毒表达载体的构建及鉴定方芳;张青蓝;杨孛;鄢国义;朱丹平【摘要】目的构建骨形态发生蛋白9 (BMP9)基因腺病毒表达载体及稳定产毒细胞系,为观察其对T2DM糖、脂代谢异常的干预效应奠定基础.方法质粒pCMV/BMP9双酶切克隆至腺病毒载体Ad5.F,构建重组腺病毒表达载体Ad5.BMP9.F,酶切测序鉴定;转包装细胞,经抗性筛选检测病毒滴度,挑选滴度较高的稳定产毒细胞克隆进行逆转录PCR(RT-PCR)鉴定.结果建立BMP9基因腺病毒表达载体Ad5.BMP9.F经酶切及测序证实目的基因插入位点及读码框架正确;建立稳定产毒细胞克隆最高病毒滴度达7.4×105 CFU/mL,RT-PCR证实BMP9基因整合其中并稳定表达.结论成功构建含BMP9基因的腺病毒表达载体及其稳定产毒细胞系.【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2015(044)017【总页数】3页(P2318-2319,2323)【关键词】骨形成蛋白质类;腺病毒科;糖尿病,2型【作者】方芳;张青蓝;杨孛;鄢国义;朱丹平【作者单位】重庆市中医院/重庆市第一人民医院内分泌科 400021;重庆市中医院/重庆市第一人民医院内分泌科 400021;重庆市中医院/重庆市第一人民医院内分泌科 400021;重庆市中医院/重庆市第一人民医院内分泌科 400021;重庆市中医院/重庆市第一人民医院内分泌科 400021【正文语种】中文【中图分类】Q781骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)属转化生长因子B超家族成员，在众多生命活动中均扮演重要角色。
其中BMP9与糖、脂代谢中多个关键转变环节有直接相关性。
本课题组前期发现BMP9基因表达异常可能与2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)代谢紊乱及胰岛素分泌缺陷相关，结合Chen 等[1]的研究，可推测：BMP9基因表达下降也许是导致T2DM代谢异常的重要因素之一，增加其基因拷贝，可能使糖、脂代谢紊乱得到一定程度的改善。
CTLA4Ig重组腺病毒载体的构建与体外表达
CTLA4Ig重组腺病毒载体的构建与体外表达郭小荑;邓宇斌;陆才生;李树浓【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2003(019)005【摘要】目的:构建含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体,为下一步在动物模型体内表达和基因治疗提供基础.方法: 自行设计一对分别含有BglⅡ及HindⅢ酶切位点的CTLA4Ig基因上下游引物,以质粒PCDNA3.0/CTLA4Ig为模板,通过PCR扩增获得CTLA4Ig基因全部序列.片段回收以后经BglⅡ及HindⅢ双酶切,定向插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV的启动子下游BglⅡ及HindⅢ位点之间,获得重组质粒pAdTrack-CTLA4Ig.通过BglⅡ/HindⅢ双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体pAdTrack-CTLA4Ig与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌.同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒.结果:成功构建了含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒,病毒滴度为1.65×1012PFU/L. 结论: 该重组腺病毒的构建为下一步研究其在哺乳动物细胞内表达、研究CTLA4Ig的生物学活性及移植排斥、自身免疫病的基因治疗提供了一定的基础.【总页数】5页(P585-589)【作者】郭小荑;邓宇斌;陆才生;李树浓【作者单位】中山大学中山医学院病理生理学教研室,广东,广州,510080;中山大学中山医学院病理生理学教研室,广东,广州,510080;中山大学附属第三医院风湿科,广东,广州,510630;中山大学中山医学院病理生理学教研室,广东,广州,510080【正文语种】中文【中图分类】R392.4【相关文献】1.钙网织蛋白重组腺病毒载体构建及体外表达 [J], 赵丹;刘新莉;马萍2.猪源性CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 朱海涛;田敏;于良;吕毅;王博3.CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及其体外表达 [J], 马会慧;陆才生;陈雪娟;高志良;李刚;杨绍基;姚集鲁4.人CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 王永明;胡燕;黎海芪5.CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及其体外表达 [J], 马会慧;陆才生;陈雪娟;高志良;李刚;杨绍基;姚集鲁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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葡萄糖摄取与转运增加 。通过增加脂肪代谢相关基 因的表达 ， 响糖 代谢 ， 影 减少 Ｉ Ｒ引起 的高血糖 ； 通 过抑 制肝 脏 中长链 脂 肪 酸 氧化 ， 抑制 １６二磷 酸 ，～ 果 糖激 酶 ， 少 肝 脏 中 葡 萄 糖 生 成 ， 进 葡 萄 糖 利 减 促 用 ， 而 降 低 血 糖 ， 善 糖 毒 性 。 临 床 试 验 证 从 改 实 Ｊ盐 酸 毗格 列 酮不 论 单 独使 用 或 与 磺 脲 类 、 ， 双 胍类抗糖尿病药物联合使用 ， 均可使血糖 和 Ｈ Ａ Ｃ ｂ 明显降低 。
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穿梭 载体 ｐｈｔｅＣ Ｓｕｆ —ＭＶ． ４ ｌ ＭＣ Ｒ载 体 ， 全 部 酶 切 产 取 物 ｌ 琼脂糖 凝胶 电泳 ， Ａ ｙｅ ％ 用 ｘｇｎ胶 回收 试 剂盒 回 收纯 化 酶 切 产 物 。将 该 线 性 化 的 ｐｈ ｔｅＣ ／ Ｓｕｆ—ＭＶ 犬 ｌ ＭＣ Ｒ载体 转 化进含 ｐ ｄａｙ１的 Ｅ ｅｌＢ５ ８ ４ Ａ ｅｓ一 ．ｏ Ｊ１３感 ｉ
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吡格 列酮 保 护 胰 岛 Ｂ细 胞 的机 制 复 杂 。 本 研
［ ］陈灏 珠． ３ 实用内科 学 ［ ．２版． Ｍ］１ 北京 ： 民卫 生 出版 社 。０５ 人 ２０ ：
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［ ４］王长 江， 叶山东 ， 王德全 ， 盐酸吡格列酮治疗 ２型糖尿病的疗 等．
效及安全性 ［］中 国Ｉ Ｊ． 晦床药理学杂志 ， ０ ，８３ ：６— ０ ２ ２ １（ ） １７１ ． ０ ７
近 年来 ， 因 治疗 成 为许 多遗 传 疾 病 治 疗 的趋 基 势… ， 亦为肥胖 的治疗 提供 了一种有效手段。黑素 皮质素 受体 ４（ ４ ） 表 达 于下 丘 脑 神 经元 细胞 ＭＣ Ｒ 是
基金项 目： 辽宁省科技 厅基 金资助项 目（ ｏ ９ｏ ０ １４ 。 ２ ｏ ４ ８ｏ —） ＋ 讯 作 者 通
１ 材 料与 方 法
４ ５
山东医药 ２ １ 年第 ５ 卷第 １ 期 ０１ ｌ ５
１ １ 材 料 载 体 和 菌 种 ： ｃ Ｎ ３ １ｍｙ—ｉ Ａ ． ｐ Ｄ Ａ ． － ｃｈｓ — ／ 受态 Ｂ ５ ８ 。限 制 性 内切 酶 Ｐ ｅＩ酶 切 线 性 处 理 Ｊ１３ ｍ
ｃ Ｃ Ｒ载体 （ Ｍ４ 本实验室构建） 骨架载体 ｐ ｄ ａｙ 、 ； Ａ Ｅ ｓ一 １ 穿 梭 载 体 ｐｈｔｅＣ Ｓｕｔ —ＭＶ、Ｂ５８ 感 受 态 细 胞 。 ｌ Ｊ１３ ｐ １－ 体 、 Ｈ５ｔ 受 态 细 胞 、 Ｘ Ｔ ｑ Ｎ 聚 ＭＤ ８Ｔ载 Ｄ ｏ感 Ｅ ａＤ Ａ 合酶、 Ｎ Ｐ Ｔ ｄ Ｔ 、 ４噬 菌体 Ｄ Ａ连 接 酶、 Ｎ ａ ｅ Ｎ Ｄ ＡＭ ｒ ｒ ｋ （０ － ００ｂ 、０ — ０ ｐ 、 制 性 内切 酶 Ｂ １０６ ０ ｐ ５０１ ００ｂ ） 限 ２ Ｉ、ｈ 限制 性 内切 酶 Ｐ ｃ Ｉ Ｘ ｏ Ｉ； ａ Ｉ、ｍｅ Ｐ Ｉ； Ｄ Ａ ＸＮ ／
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ｐｈ ｔｅＣ ／ ＡＲ； 选 阳性 克 隆 子 ； ａ 切 鉴 定 。结 果 ｓｕｔ — ＭＶ ＭＣ ｌ 筛 ＰｃＩ酶 线 性 化 的 ｐ ｈ ｔｅＣ ／ ＡＲ转 化 含 ｐ ｄ ａｙ１的 Ｓ ｕｌ—ＭＶ ＭＣ ｔ Ａ ｅｓ－
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成、 转运及 利 用 的 多 种 基 因 的转 录 Ｊ在 不 刺 激 ｐ ，
受态细胞中， 转化成功 的阳性克隆菌可以在含卡那 霉 素 抗性 的平板 上 生 长 ， 取 单 菌 落 ， 大 培 养 后 ， 挑 扩 提取 重组 体 进行 鉴 定 ， Ｐ ｃ 经 ａ Ｉ酶切 ，． ％琼 脂 糖 ０７ 凝胶上 电泳 ， 出现一大于 ２ ｂ和 ４ ５ｋ 若 ０ｋ ． ｂ或 ３ ０ ． ｋ ｂ的特 征性 条带 ， 为阳性 重组 体 。 即
用， 其机制可能为降低血糖 、 ｂ 和 ＦＮ 水平 ， Ｈ ＡＣ ＩＳ 改
善糖 毒性 和 Ｉ Ｒ。
参 考文 献 ：
［ ］Ｍ ｙｚ ｉ Ｍ ｔ ｄ Ｄ ｈ ｎｏＲ ． ｏ － ｓｏ ｓ ｅ ｅｔ ｆ ｉｉ １ ｉ ａ ａｕａ ａ ｋ Ｙ， ｓ Ｍ， ｅ￣ ｚ Ａ Ｄ ｓ ｒ ｐ ｎ ｃ ｇ— ｅｅ ｅ ｆ ｏ ｐ ｌ
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２ １ Ｐ Ｒ扩 增 产 物 ． Ｃ
犬 ＭＣ Ｒ Ｐ Ｒ 产 物 为 １０ ３ ４ Ｃ ２
引 物 ， 游 引 物 Ｐ ： Ｇ Ａ Ｇ Ｔ Ｔ Ｃ Ａ Ｃ Ｔ 上 ｌ ５一 Ｇ Ａ Ａ Ｃ Ｇ Ｃ Ｃ Ａ － Ｇ Ａ Ｔ Ｃ Ｃ ＣＩＩ Ｇ 一 （ Ａ Ｃ Ｃ Ａ Ｃ ，ＩＡ Ｃ３ 引入 Ｂ Ⅱ酶 切位 点 ） Ｔ Ｃ ； 下 游引 物 Ｐ ： Ｃ Ｇ Ｔ Ｇ Ｇ Ｔ Ｇ Ａ Ｃ Ｇ Ｔ Ｇ — ２５一Ｃ Ｃ Ｃ Ａ Ｃ Ａ Ｔ Ｔ Ｔ Ｃ Ａ Ａ
２ 结果
试剂盒和胶回收试剂盒 。其余试剂均由辽宁医学院 科 学实验 中心 提供 。 １２ 犬 ＭＣ Ｒ重组 腺病 毒 载体 的构建 及 鉴 定 ① ． ４ 引物设计 ： 根据 Ｇ ｎ ａｋ上 公 布 的犬 ＭＣ Ｒ基 因序 ｅＢｎ ４
列 （ 录 号 ： Ｑ ８２０） 利 用 生 物 软 件 Ｐｅ ｉｒ 登 Ｄ ０４１ ， ｒｍｅ
ｍ ｆ ｒ ｉ ｆ ｅ ｔａ ｅｔ ｐ ｉ ｅ ｅｉ ｓ Ｊ ． ｅ ｅｏ ｎ ｏ ｔ ｅｔ ｎ ｏ ｔ ｅ２ ｄ ｂ ｔ ｍ ｌｔ ［ ］ Ｍ ｄ ｍ ｒ ｈ ｒ ｍ ｙ ｆ ａ ｅ ｓ ｌｕ
Ｃｉ，０ ８ １ １ １ ）７ １７０ ｌ ２０ ，３ （ ９ ：２ －３ ． ｎ （ 收稿 日期 ：０ １ ２１ ） 的重组腺病 毒载体 ； 载体为 人类 肥胖症的基 因治疗研 究奠定 了基础 。 ４ 该 关键词 ： 肥胖 ； 素皮质素受体４； 黑 同源重组 ； 病毒载体 腺
中图分类号 ：７４ Ｑ ８ 文 献 标 志 码 ： Ｂ 文 章 编 号 ：０ ２２ ６ ２ １ ） ５０４ －３ １０ －６ Ｘ（ ０ Ｉ １ － ５０ ０
摘要 ： 目的
构建黑素皮质素受 体４（ Ｃ Ｒ 重组腺病毒表达载体 ， ＭＡ ） 为肥胖症 的基 因治疗 研究奠 定基 础。方 法
Ｐ Ｒ扩增犬 ＭＧ Ｒ目的基 因后与 Ｔ载体 连接 ， Ｃ ４ 双酶 切鉴 定正 确 的 ＴＡ载体 获得具 有 黏性末 端 的 ＭＣ Ｒ 目的基 － ４ 因； 将其亚克 隆至腺 病 毒 穿 梭 载体 ｐ ｈ ｔｅＣ Ｖ 中 ， 建 穿梭 载 体 ｐ ｈ ｔｅＣ ／ ＡＲ； ｍ Ｉ单 酶 切 ｐｈ ｔｅ Ｓｕｔ — Ｍ ｌ 构 Ｓ ｕｔ ．ＭＶ ＭＣ ｌ Ｐｅ ｓｕｌ． ｔ
膜 上 的一 种特 定受 体 ， 在动 物体 质 量 、 能量 稳态 和 采 食 量 的调控 中具 有重 要 作 用 ］ ０ ９年 ５月 ， 。２０ 我们 应用 Ｅ １区 和 Ｅ ３区 缺失 的 复 制 缺 陷 ５型 腺 病 毒 系 统构 建 犬 ＭＣ Ｒ重 组 腺 病 毒 载 体 ， ４ 旨在 为 人 类 肥 胖 症 的基 因治疗 研 究奠 定基 础 。
肥 胖 ＭＣ Ｒ重 组腺 病 毒 表 达 ４ 载 体 的构 建 及 鉴 定
王玉 彬 吕金钢 苏 荣健 。 王光 川 巴彩凤 ， 。 ， 。
（ １辽 宁 医学院 附属 第一 医院 ， 宁锦 州 １１０ ； 宁 医学 院 实验 动物 中心 ； 辽 ２０ １２辽
３辽宁 医学院省高校分子细胞生物 学与新药开发重点实验室）
山东医药 ２ １ 年第 ５ 卷第 ｌ 期 ０１ １ ５
吡格 列 酮 是 噻 唑 烷 二酮 类 药 物 ， 通 过增 加 胰 其 岛素 敏感 组织 骨骼 肌 、 脂肪 组织 、 脏等 部位 的胰 岛 肝 素敏 感性 而 降 低 血 糖 Ｊ改 善 胰 岛素 抵 抗 （Ｒ） 通 、 Ｉ ； 过激 活靶 组 织 中过 氧 化 物 酶 体 增 殖 物 激 活 型 受 体
Ｂｎ ａｋ公布 的 同源性达 ９ ％ ， 有 第 １０位碱 基 ｃ ＋ ９ 仅 ２ ＿ Ｔ 第 ７ ７位 碱 基 Ｔ Ｃ， 表 达 犬 ＭＣ Ｒ蛋 白无 影 、 ７ — 对 ４
响， 目的基 因成 功插入 ｐ １ － 体 上 。 ＭＤ ８Ｔ载
连 ＴＫ Ｒ ａ ａ ａ公 司 合 成 。② ｐ ８Ｔｃ ４ ＭＤ １一—ＭＣ Ｒ载 体 构
Ｂ５８ Ｊ １３感受态细胞 ，６ｈ 获得 阳性克隆子 ， Ｐ ｃＩ １ 后 经 ａ 酶切鉴定 出一 大于 ２ ｋ ０． ｂ的大片段 和 ３ ０ｋ ． ｂ的特征性 片段 ， 通过 Ｂ ｌ、 ｈ 双酶切切 下约 １ ０ ｐ的片段 ， ＭＣ Ｒ 目的基 因的重组腺病毒载体构建成 功。结论 ＩＸｏＩ ０ｂ ０ 含 ４ 细 菌内
ＣＡＴＡ一（ Ａ Ｇ Ｃ Ｃ ３ 引入 Ｘ ｏ ｈ Ｉ酶 切位 点 ） 引物 由大 。
ｂ ｐ的均一条带 ， 与预期扩增产物大小基本一致 ， 且 无 非 特异 性扩 增条带 。 ２２ ｐ １一—ＭＣ ． ＭＤ ８Ｔｃ ＡＲ重 组体 的酶切 鉴定 及 测序 重组体 ｐ Ｄ ８Ｔｃ Ｃ Ｒ经 Ｂ ｌ、 ｈ 双酶切 ， Ｍ １．． ４ Ｍ ＩＸ ｏ Ｉ 分别 得到 １ ０ ｐ和 ２６２ｂ 条 带 ， 小 与预 期 ０ｂ ０ ９ ｐ两 大 相符 ， 图 １ 见 。测 序 结 果 经 Ｂａｔ ｌ 比对 分 析 ， Ｇ ｎ ｓ 与 ｅ—