STAT6-ORF表达载体的构建与鉴定
中国生化药物杂志２０１４年第８期总第３４卷论著基础研究
ＳＴＡＴ６－ＯＲＦ表达载体的构建与鉴定
刘锦宙１，杨燕２，谢而付３
（１．江西省宜春市人民医院消化内科，江西宜春３３６０００；２．江西省宜春职业技术学院，江西宜春３３６０００；
３．南京医科大学医学科学部，江苏南京２１００２９）
［摘要］目的本文旨在构建ＳＴＡＴ６一ＯＲＦ表达载体，包装成慢病毒颗粒。方法应用嵌套ＰＣＲ法从生长状态良好的２９３Ｆｒ细
胞的ｃＤＮＡ中扩增ＳＴＡＴ６的完整读码框片段（２５４４ｂｐ），根据需要在引物的５’端分别引入ＣｌａＩ和ＭｌｕＩ酶切位点，将ＰＣＲ产物克隆
到ｐＭＤ２０Ｔ载体上，得到ｐＭＤ２０Ｔ—ＳＴＡＴ６－ＯＲＦ克隆；测序验证后，用ＣｌａＩ和ＭｈＩ双酶切ｐＭＤ２０Ｔ．ＳＴＡＴ６克隆，回收酶切产物得到的
ＳＴＡＴ６一ＯＲＦ片段，通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接到ｐＬＶＴＨｍ表达载体上，经双酶切和测序验证正确，获得ｐＬＶＴＨｍ．ＳＴＡＴ６．ＯＲＦ表达载体。
结果构建带有增强绿色荧光蛋白ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ
ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎ）标记的ＳＴＡＴ６．ＯＲＦ表达载体，包装成慢病毒颗粒，结果
表明成功构建及包装带ＳＴＡＴ６－ＯＲＦ目的片段的慢病毒表达载体。结论ｐＬＶＴＨｍ—ＳＴＡＴ６过表达载体构建成功，可以进行慢病毒包
装与鉴定。
［关键词］ＳＴＡＴ６－ＯＲＦ；慢病毒颗粒；增强绿色荧光蛋白
［中图分类号】Ｒ３９２．１２［文献标识码】Ａ［文章编号】１００５—１６７８（２０１４）０８—００６９—０４
ＥｆｆｅｃｔｏｆＮｅｓｆａｔｉｎ－１
ｏｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆ
ｇａｓｔｒｉｃａｃｉｄａｎｄ
ｐｅｐｓｉｎｉｎ
ｒａｔ
ｇａｓｔｒｉｃｍｕｃｏｓａ
ＬＩＵＪｉｎ．ｚｈｏｕｌ，ＹＡＮＧＹａｎ２，ＸＩＥＥｒ．ｆｕ３
（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＩｎｔｅｒｎａｌ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＹｉｅｈｕｎＰｅｏｐｌｅ’ＳＨｏｓｐｉｔａｌｏｆ
ＪｉａｎｇｘｉＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｙｉｃｈｕｎ，３３６０００，Ｃｈｉｎａ；２．ＹｉｃｈｕｎＶｏｃａｔｉｏｎａｌ
Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ
Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｙｉｃｈｕｎ，３３６０００，Ｃｈｉｎａ；３．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＮａｎｊｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ，２１００２９，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＮｅｓｆａｆｉｎ一１
ｏｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆ
ｇａｓｔｒｉｃａｃｉｄａｎｄ
ｐｅｐｓｉｎｉｎｒａｔｓｇａｓｔｒｉｃｍｕｃｏｓａ，ａｎｄｅｘｐｌｏｒｅｉｔｓ
ｐｏｓｓｉｂｌｅ
ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１８ｍａｌｅＳＤｒａｔｓａｆｔｅｒｉｎｔｒａｅｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｃａｔｈｅｔｅｒｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄ
ｉｎｔｏ，ｈｉｇｈｄｏｓｅ
ｇｒｏｕｐ，ｌｏｗｄｏｓｅ
ｇｒｏｕｐａｎｄｃｏｎｔｒａｌ
ｇｒｏｕｐ，ｅａｃｈ
ｒａｔＷａｓｉｎｊｅｃｔｅｄｗｉｔｈＮｅｓｆａｔｉｎ一１０．０５
ｇ，０．５ｇａｎｄ
５肛Ｌｅｑｕａｌｖｏｌｕｍｅｓｔｅｒｉｌｅｗａｔｅｒｂｙｔｈｅｌａｔｅｒａｌｖｅｎｔｒｉｃｌｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｇａｓｔｒｉｃｊｕｉｃｅｗｅｒｅ
ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ
ｂｙｐｙｌｏｒｕｓｌｉｇａｔｉｏｎ，ａｆｔｅｒ３ｈｔｈｅｒａｔｓｗｅｒｅｅｘｅｃｕｔｅｄｔｏｍｅａｓｕｒｅ
ｃｈａｎｇｅｓｏｆｔｈｅｉｒ
ｇａｓｔｒｉｃａｃｉｄａｎｄ
ｐｅｐｓｉｎ，ａｎｄＨ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓ
ｉｎｇａｓｔｒｉｃｔｉｓｓｕｅｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄ
ｂｙＲＴ・ＰＣＲ。ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｈｉｓｔｉｄｉｎｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ＨＤＣ）ｉｎｇａｓｔｒｉｃｍｕｃｏｓａＷａｓ
ｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｍ
ｂｌｏｔ，ｈｉｓｔａｍｉｎｅｃｏｎｔｅｎｔｉｎｇａｓｔｒｉｃｍｕｃｏｓａＷａｓｄｅｔｅｃｔｅｄ
ｂｙＥＬＩＳＡ．ＲｅｓｕｌｔｓＡｆｔｅｒ３ｈｏｆｒａｔｓｗｉｔｈＮｅｓｆａｔｉｎ－１ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈ
ｃｏｎｔｒｏｌ
ｇｒｏｕｐｗｉｔｈ
ｅｑｕａｌｖｏｌｕｍｅｏｆｓｔｅｒｉｌｅｗａｔｅｒｆｏｒｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ｔｈｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆｇａｓｔｒｉｃａｃｉｄａｎｄｐｅｐｓｉｎｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｄ，ｔｈｅｒｅｗａｓａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．叭）．Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｏｆｐｅｐｓｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎｌｅｖｅｌｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｔｗｏ
ｇｒｏｕｐｓＷａｓｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ（Ｐ＜０．０５）．Ｈｉｓｔａｍｉｎｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎｉｎ
ｒａｔｇａｓｔｒｉｃｍｏｃｏｓａｄｅｃｌｉｎｅｄ．ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅＷａｓ
ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ａｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｔｗｏｇｒｏｕｐｓｏｆｒａｔｓ
ｇａｓｔｒｉｃＨ＋一Ｋ＋ＡＴＰ
ｅｎｚｙｍｅｍＲＮＡ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＷａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｄ，ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅＷａｓ
ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ（Ｐ＜０．０１）．ＭｅａｎｗｈｉｌｅＨＤＣ
ｐｒｏｔｅｉｎ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎ
ｒａｔｇａｓｔｒｉｃｍｕｃｏｓａｉｎ
ｈｉｇｈｄｏｓｅ
ｇｒｏｕｐ，ｌｏｗｄｏｓｅｇｒｏｕｐｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ
ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌ
ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ，
ｗｉｔｈｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ（Ｐ＜０．０５）．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＩｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｅｕｌａｒｉｎｊｅｃｔｉｏｎ
Ｎｅｓｆａｔｉｎ一１，ｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆｇａｓｔｒｉｃａｃｉｄａｎｄｐｅｐｓｉｎ，
ａｎｄｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍｍａｙｉｎｈｉｂｉｔｇａｓｔｒｉｃａｃｉｄｓｅｃｒｅｔｉｏｎｂｙａｆｆｅｃｔｉｎｇｔｈｅｃｅｎｔｒａｌ
ｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍ，Ｈ＋－Ｋ＋ＡＴＰｅｎｚｙｍｅｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆｋｅｙｅｎｚｙｍｅｓ．ｉｎｈｉｓｔａｍｉｎｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｐａｔｈｗａｙ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ｌａｔｅｒａｌｖｅｎｔｒｉｃｌｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；ｒａｔ；ｇａｓｔｒｉｃ
ａｃｉｄ；ｐｅｐｓｉｎ
在免疫细胞中，ＳＴＡＴ６在ＩＬ４或ＩＬ－１３的刺激下，通过ＪＡＫ
激酶ｊａｎｕｓｋｉｎａｓｅ，ＪＡＫ）的作用，胞质中非磷酸化（失活状态）的
ＳＴＡＴ６蛋白被磷酸化（激活）后形成二聚体，进入细胞核内，识别
资助项目：国家自然科学基金｛８１１０１３２２）
作者简介：刘锦宙，男。本科，副主任医师。研究方向：消化内科．Ｅ—ｍａｉｌ：
ｑｃｈｌ８２１４６００６４＠１６３．ｔｏｍｏ核内特异的ＤＮＡ结合元件并与之结合，启动下游特定基因的表
达，产生相应的生物学效应，如ＩｇＥ的产生，Ｔｈ２细胞的分化及淋
巴细胞的发育等¨“。但越来越多的研究表明，该信号与癌症的
发生发展也密切相关∞。－。长期慢性的炎症可以诱发癌症，但２
者分子交叉机制目前仍不清楚１８。…。推测可能与ＩＬ４．ＳＴＡＴ６信
号所介导功能的转变密切相关。１“。本研究选择能够高效率感
染目的细胞的慢病毒载体ｐＬＶＴＨｍ为骨架构建ＳＴＡＴ６．ＯＲＦ表
一∞一
万方数据论著基础研究中国生化药物杂志２０１４年第８期总第３４卷
达载体。
１材料与方法
１．１实验材料
１．１．１细胞株、菌株和质粒：人胚肾ＨＥＫ２９３ＦＴ细胞株，大
肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＩ－ｌＳｏｔ均由南方医科大学基因工
程研究所保存。
慢病毒载体ｐＬＶＴＨｍ由南方医科大学基因工程研究所提
供，ｐＬＶＴＨｍ能表达ＥＧＦＰ，载体ｐＭＤＴＭ２０－Ｔｖｅｃｔｏｒ为日本
ＴａＫａＲａ公司产品。
１．２实验方法
１．２．１人胚肾ＨＥＫ２９３ＦＦ细胞株的总ＲＮＡ提取与纯化：
ＴＲＩｚｏｌ法提取ＲＮＡ，异丙醇纯化ＲＮＡ，按下列步骤操作：
细胞按１×１０６爪／ｍＬ密度接种于６孑Ｌ板培养，经处理后弃
去上清，每孔加入１ｍＬＴＲＩｚｏｌ（ＴＡＫＡＲＡ公司产品），静置５ｍｉｎ
充分裂解（ＴＲＩｚｏｌ变粘稠）后吸到１．５ｍＬＥＰ管中，或液氮速冻后
一８０℃保存备用。加２００ＩＬＬ氯仿剧烈振荡，室温静置５ｍｉｎ，
４ｏＣ，１２０００ｇ离心１５ｍｉｎ。将上清移到新ＥＰ管，加等体积（约
５００ＩＬＬ）异丙醇混匀，室温静置１０
ｒａｉｎ，４℃，１２０００ｇ离心１０
ｍｉｎ。
弃上清，５００
ＩｘＬ７５％乙醇洗涤；４℃，１２０００ｇ离心２ｍｉｎ，重复１
次。空甩１次（常温１２０００ｇ离心１ｍｉｎ）。超净台内把柱子盖打
开吹ｌ～２ｍｉｎ，将柱子放到新的１．５ｍＬＥＰ管。加入１０～４０斗Ｌ
ＤＥＰＣ（依材料多少而稀释），６２℃２ｍｉｎ，常温１２０００ｇ离心
１ｍｉｎ，管内即为ＲＮＡ。取１ＩｘＬ用分光光度计（７２２Ｓ型，ｅｐｐｅｎｄｏｆｆ
公司，ＡＧ）检测纯度和浓度，１¨Ｌ进行琼脂糖电泳（配制新鲜的
ｌ％琼脂糖凝胶，置换干净ＴＡＥ缓冲液进行电泳）检测其完整性，
余下部分立即保存于一８０℃超低温冰箱中，或立即用于反转录
反应。
１．２．２反转录：根据ＰｒｉｍｅｒＳｅｒｉｐｔ“ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒步骤进
行操作：在ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ中配制下列混合液：ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（１０ｍＭ
ｅａｃｈ），１
ｔｘＬ；ｏｌｉｇｏｄＴｐｒｉｍｅｒ（２．５斗Ｍ），１斗Ｌ；ｔｏｔａｌＲＮＡ，１００
Ｐｇ一
１Ｉｘｇ；ＲＮａｓｅｆｒｅｅｄＨ２０，１０ＩｘＬ。ＲＮＡ反应液离心，６５
ｏＣ，５ｍｉｎ处
理，迅速转到冰上冷却，离心数秒钟使模板ＲＮＡ／弓ｌ物等的混合
液聚集于ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ管底部。在上述ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ管中配制下列反
转录反应液：上述变性、退火反应液１０
ｉｘＬ；５ＸＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＢｕｆｆｅｒ
４
ＩＬＬ；ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＮａｓｅ（ｆｏｒ２Ｓｔｅｐ）０．５¨Ｌ；ＲＮａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
（４０Ｕ／ＩＪ．Ｌ）５ＩｘＬ；总体积２０¨Ｌ。在ＰＣＲ仪上４２℃（一５０℃）
１５—３０ｍｉｎ进行反转录反应，之后７０℃５ｍｉｎ进行反转录酶的
失活反应，立即到冰上冷却，之后４℃保存。反应完毕后，取
１止ｃＤＮＡ用分光光度计（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司，ＡＧ）检测纯度和浓
度，并对其稀释至１５０ｎｇ／ｔｚＬ，于一２０℃保存备用。余下部分立
即保存于一８０℃超低温冰箱中。
１．２．３扩增ＳＴＡＴ６基因：以反转录所得的第一有义链
ｃＤＮＡ为模板，根据序列保守区利用Ｐｒｉｍｅｒ５．Ｏ（ＰＲＥＭＩＥＲＢｉｏｓｏｆｌ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ公司，ＵＳＡ）软件设计引物扩增ＳＴＡＴ６基因，内参基
因为ＧＡＰＤＨ，引物均由上海Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司合成。
１．２．４ＳＴＡＴ６基因与ｐＭＤ２０．Ｔ载体相连
①目的片段回收纯化：按凝胶回收试剂盒说明，进行操作。
②感受态细胞的制备：
受体菌的培养：从ＬＢ平板上挑取新鲜活化的Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ｃｔ取单菌落，接种于３～５ｍＬＬＢ液体培养基中，３７℃下振荡培养
mTOR特异性siRNA重组表达载体的构建及鉴定
mTOR特异性siRNA重组表达载体的构建及鉴定
张才成;陈静;陈唐勇;章登珊;郑晓丰;李俊明
【摘 要】目的：构建mTOR siRNA 重组表达载体，为探讨RNA干扰技术抑制巨噬细胞 mTOR 基因的相关研究奠定基础。方法设计具有短发夹结构的DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pGPU6/GFP/Neo中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定。再转染入巨噬细胞RAW264.7,进行荧光摄像和阳性克隆筛选。Western blot方法检测巨噬细胞mTOR蛋白表达。结果 DNA 测序结果及 PCR 鉴定证实成功构建小鼠 mTOR
siRNA 重组表达载体。Western blot结果显示转染该重组载体的巨噬细胞mTOR蛋白表达下降约41%。结论 mTOR靶向RNA干扰重组表达载体构建成功,可以进行稳定筛选，该载体对巨噬细胞mTOR蛋白表达有抑制作用。%Objective To
construct mTOR specific siRNA recombinant expression vector and provide
foundation to inhibit macrophage mTOR gene by intenferenc. Methods
Short hairpin DNA sequence was annealed to form double chain, then
cloned into vector pGPU6/GFP/Neo to construct the recombinant
expression vector, and then transformed into DH5α strain. Plasmid was
identified by restriction enzyme digestion and sequencing, and transfected
构建载体基本步骤
载体构建流程
1． 基因的获得
已获得基因
RT-PCR
2． 回收
A． 酶切回收：一般做50-100ul 体系，然后跑电泳回收，回收量一般为30ul。
B． PCR回收：一般做总体系为100-200ul的PCR量（用高保真酶：如PFU酶、KOD PLUS酶），分成约50ul/管，然后上PCR仪。 跑电泳回收，约30ul。
酶切回收，做100ul体系， 直接过回收柱回收DNA片段。
3． 连接
连接体系总量一般为10-20ul。12℃-16℃ 过夜。
4． 转化
一般转化DH5α感受态，10-15ul 连接液转化到50ul感受态中。
冰浴1h 热休克42℃ 90 秒
冰浴5分钟 加200ul LB液，37℃ 振摇1 h
铺相应抗性的平板。置37℃孵箱，培养12h.
5． 挑克隆
从平板上挑取数个克隆，于相应抗性的LB中，37℃培养12h.
酶切回收 PCR回收
PCR 6． 抽提质粒
手工抽提质粒，一般溶于30ulTE或EB。
7． 鉴定
A． 酶切鉴定 ：一般用什么酶装上的，就用什么酶鉴定。但原则是选用相对便
宜的酶 。
选择原来载体上没有而基因上有的酶切位点与载体上另一酶切位
点共同鉴定。
一般鉴定选择2-4组酶，来确定构建的载体是否正确。
B．PCR鉴定：一般扩增目的条带。也可扩增载体和目的条带连接处的片段。
构建基因表达载体的流程
构建基因表达载体的流程
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构建基因表达载体的流程：
①目的基因选择与克隆：确定需要表达的基因序列，通过PCR扩增或从基因文库中提取，随后克隆到适合的质粒载体上，如pUC系列质粒，便于后续操作。
②载体选择与准备：根据表达系统（细菌、酵母、哺乳动物细胞等）和目的蛋白特性，选择合适的表达载体，如pET系列（原核）、pYES2（酵母）、pcDNA3.1（哺乳动物）。载体需预先线性化或具有特定限制酶切位点。
③酶切与连接：使用限制性内切酶对目的基因片段和载体分别进行酶切，以产生相匹配的黏性末端或平末端。之后，通过T4 DNA连接酶将目的基因片段连接到载体上。
④转化与筛选：将连接产物转入相应的宿主细胞（如大肠杆菌DH5α），通过热激、电击等方法促进细胞吸收DNA。随后在含有抗生素的选择培养基上培养，筛选出含重组载体的阳性克隆。
⑤验证与测序：挑取阳性克隆，通过PCR、酶切分析或直接测序等方法验证目的基因是否正确插入载体，以及阅读框是否正确。
⑥表达验证：将验证后的重组载体转入最终的表达宿主细胞中，诱导表达目标蛋白，通过SDS-PAGE、Western Blot等方法检测蛋白的表达效率及特性。
基因表达载体构建的具体操作流程
基因表达载体构建的具体操作流程
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基因表达载体构建的操作流程详解
基因表达载体的构建是分子生物学研究中的重要步骤，它在基因克隆、蛋白质表达以及基因功能研究等领域发挥着关键作用。以下是一份详细的基因表达载体构建的操作流程：
人GJB6基因表达载体的构建及鉴定
・４７０・ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｔｏｌｏｇｙ Ｖｏ１．８，Ｎｏ．４，２０１０
人Ｇ ６基因表达载体的构建及鉴定
李丽娜 张延平 孙玉蕊 张宗林 王戈 张晓强 冯冲 潘登科
１解放军第３０９医院耳鼻喉科（北京１０００９１）
２ 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所（北京 １０００９４）
【摘要】目的 构建人野生型Ｃｘ３０与红色荧光蛋白ＤｓＲｅｄ的融合蛋白表达载体，为揭示Ｃｘ３０突变患者发病机
制提供实验依据。方法用ＰＣＲ法扩增ＧＪＢ６基因，将ＰＣＲ产物与Ｔ载体连接，用双切酶酶切ｐＥＡＳＹ－ＧＪＢ６与载
体ＤｓＲｅｄ—Ｎ１，连接回收后的片断，构建野生型Ｃｘ３０编码序列与ＰＤｓＲｅｄ２表达载体，测序鉴定序列正确性。将
ＧＪＢ６一ＤｓＲｅｄ用脂质体转染ＨＥＫ２９３细胞，荧光显微镜观察表达的融合蛋白。结果 ＧＪＢ６一ＤｓＲｅｄ在ＨＥＫ２９３细胞
中高效表达，表达主要位于细胞膜中。结论成功构建了人野生型Ｃｘ３０与红色荧光蛋白ＤｓＲｅｄ的融合蛋白表达
载体．为进一步研究非综合征性聋的致聋机制奠定了基础。
【关键词】缝隙连接蛋白３０； 红色荧光蛋白； 融合蛋白表达载体 【中图分类号】Ｒ３４９．６ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１６７２－２９２２（２０１０）０４－４７０—０４
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＧＪＢ６－－ＤｓＲｅｄ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｖｅｃｔｏｒｓ
ＬＩ Ｌｉ－ｎｄ，ＺＨＡＮＧ Ｙａｈ－ｐｉｎｇＪ，ＳＵＮ Ｙｕ－ｒｕｉ ，ＺＨＡＮＧ Ｚｏｎｇ－ｌｉｎ ，ＷＡＮＧ Ｃｄ，
ＺＨＡＮＧ Ｘｉａｏ—ｑｉａｎｆ，ＦＥＮＧ 。嘭ＰＡＮ Ｄｅｎｇ－ｋｅ
Ｊ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ Ｔｈｉｒｔｙ－Ｎｉｎｅｔｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ＰＬＡ，Ｂｅｒｉｎｇ １０００９１，Ｃｈｉｎａ
２ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＡｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｒｉｎｇ １０００９４
Nar1基因酵母表达载体的构建及表达鉴定
湖北医药学院学报（Ｊ ＨＢＵＭ）２０１４年４月，３３（２）
ｄｏｉ：１０．１３８１９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６—９６７４．２０１４．０２．００３
依娜，等．Ｎａｒｌ基因酵母表达载体的构建及表达鉴定［Ｊ］．湖北医药学院学报，２０１４，３３（２）：１１０—１１３
Ｎａｒｌ基因酵母表达载体的构建及表达鉴定
赵炜 ， 方炳雄 ， 刘依娜 ， 牛宇杰 ，袁源 一， 刘新光
（ 广东医学院衰老研究所； 广东省医学分子诊断重点实验室，广东东莞５２３８０８；
普宁市人民医院检验科，广东普宁５１５３００； 广东医学院第二临床医学院，广东东莞５２３８０８；
广东医学院生物化学与分子生物学研究所，广东湛江５２４０２３）
［摘要］ 目的：构建Ｎａｒｌ基因的酵母表达载体，并纯化Ｈｉｓ．Ｎａｒｌ融合蛋白，为进一步研究Ｎａｒｌ的相互作用蛋白
及其功能奠定基础。方法：通过ＰＣＲ扩增Ｎａｒｌ全长基因；通过定向克隆的方法将Ｎａｒｌ片段与载体ｐＹＥＳ２／ＮＴＣ连
接；通过乙酸锂转化法把重组质粒转化入野生型酵母菌株ＩＮＶＳｃｌ；再通过免疫沉淀的方法纯化Ｈｉｓ—Ｎａｒｌ融合蛋白；
通过Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测靶蛋白。结果：ＤＮＡ测序验证穿梭表达质粒ｐＹＥＳ２／ＮＴＣ．Ｎａｒｌ构建成功，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测到
融合蛋白Ｈｉｓ－Ｎａｒｌ的表达。结论：成功构建Ｎａｒｌ酵母过表达载体，并且可以有效表达融合蛋白Ｈｉｓ—Ｎａｒｌ。
［关键词］Ｎａｒｌ；酵母；表达
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｎａｒｌ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＺＨＡＯ Ｗｅｉ’一， ＦＡＮＧ Ｂｉｎｇ－ｘｉｏｎｇ ・ ，ＬＩＵ Ｙｉ－ｎａ ，ＮＩＵ Ｙｕ－ｊｉｅ ・ ，ＹＵＡＮ Ｙｕａｎ。・ ，ＬＩＵ Ｘｉｎ．ｇｕａｎｇ。・ ・ （ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＡｇｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｇｕａｎｇ一
靶向表皮生长因子受体shRNA质粒表达载体的构建和鉴定
靶向表皮生长因子受体shRNA质粒表达载体的构建和鉴定
邬跃刚;曹政;吴相柏;魏亚元;霍磊;陶凯雄
【期刊名称】《山东医药》
【年(卷),期】2006(46)36
【摘 要】目的 构建靶向表皮生长因子受体(EGFR)的短发卡状RNA(shRNA)质粒表达载体并进行鉴定.方法 设计两个小分子干扰RNA(siRNA)序列,体外合成DNA模板引物,与Pgenesil-1质粒构建成编码shRNA的表达载体,进行酶切鉴定和测序,再转染人大肠癌LoVo细胞,进行荧光摄像和G418抗性筛选.结果 构建的质粒表达载体完全符合设计要求,转染成功的细胞在荧光显微镜下显示为绿色,G418可以筛选出阳性克隆.结论 成功构建了编码EGFR-shRNA的质粒表达载体,并可以进行稳定筛选.
【总页数】2页(P11-12)
【作 者】邬跃刚;曹政;吴相柏;魏亚元;霍磊;陶凯雄
【作者单位】宜昌市第二人民医院,湖北,宜昌,443000;宜昌市第二人民医院,湖北,宜昌,443000;宜昌市第二人民医院,湖北,宜昌,443000;宜昌市第二人民医院,湖北,宜昌,443000;宜昌市第二人民医院,湖北,宜昌,443000;华中科技大学同济医学院附属协和医院
【正文语种】中 文
【中图分类】R3
【相关文献】 1.靶向RhoA基因的shRNA质粒表达载体的构建与鉴定 [J], 李正伟;白云深;任宪盛;杨有庚
2.靶向hVEGF165基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选 [J], 王卫东;蒋立新;徐江平;陆兵勋
3.靶向表皮生长因子受体shRNA表达载体的构建和鉴定 [J], 王慧;魏志平;刘彦群
4.靶向survivin基因的shRNA质粒表达载体的构建 [J], 熊英;郭文
5.靶向钠钾ATP酶α1亚单位shRNA质粒表达载体的构建与筛选 [J], 周蔚;徐忠伟;王凤梅;陈小义;呼文亮;徐瑞成
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巨噬细胞特异性表达载体的构建及鉴定
巨噬细胞特异性表达载体的构建及鉴定
李晓缘;尹洪超
【期刊名称】《医学研究杂志》
【年(卷),期】2018(47)11
【摘 要】目的 构建巨噬细胞特异性白喉毒素受体过表达载体并检测其在巨噬细胞中的表达情况.方法 将白喉毒素受体基因Hbegf克隆入pcDNA3.1载体中扩增Hbegf与BGHpolyA尾片段,与克隆入pUCm-T载体中的巨噬细胞特异性启动子相连接,分别转染巨噬细胞与其他细胞,通过荧光定量PCR鉴定其表达情况.结果 特异性表达载体通过测序以及酶切鉴定构建成功,在巨噬细胞中的表达高于未转染的巨噬细胞以及转染的非巨噬细胞.结论 构建了巨噬细胞特异性表达人白喉毒素受体载体,瞬时转染后可在巨噬细胞中特异性表达白喉毒素受体,为动脉粥样硬化易损性斑块的建立以及斑块内与凋亡相关的其他研究提供了一定依据.
【总页数】4页(P29-32)
【作 者】李晓缘;尹洪超
【作者单位】81670430 中国医学科学院/北京协和医学院基础医学研究所病理系;81670430 中国医学科学院/北京协和医学院基础医学研究所病理系
【正文语种】中 文
【中图分类】Q782
【相关文献】 1.SV40T抗原肝细胞特异性表达载体的构建与鉴定 [J], 谢永华;王冠明;许秀秀;
2.小鼠趋化因子受体7特异性shRNA腺病毒表达载体的构建和鉴定 [J], 何伟;秦如斋;张小冬;刘文丹;潘春华
3.人前列腺特异性膜抗原基因启动子/增强子表达载体的构建及组织特异性鉴定 [J],
康鲁东;吴伟芳;崔福爱;王秀利;胡晓燕;孔峰
4.幽门螺杆菌VacA N端真核表达载体的构建、鉴定及其诱导巨噬细胞空泡化和凋亡的观察 [J], 黎村艳;张艳;刘志杰;余敏君;于文
5.血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1特异性小发夹RNA表达载体的构建及其对巨噬细胞源性泡沫细胞氧化应激的影响 [J], 杨慧宇;边云飞;杨志明;张娜娜;高奋;肖传实
山羊ATF6基因重组慢病毒干扰载体的构建及鉴定
山羊ATF6基因重组慢病毒干扰载体的构建及鉴定
付饶;李会玲;王磊;杨迪琦;温鑫;靳亚平
【摘 要】为了研究ATF6通路介导的山羊胎盘滋养层细胞(goat trophoblast
cell,GTC)凋亡的作用机制,需要构建激活转录因子6(ATF6)基因慢病毒干扰载体用于试验.采用RNA干扰技术,设计合成以山羊ATF6基因CDS区为靶点的shRNA,构建重组慢病毒载体、慢病毒包装、慢病毒转染、RT-qPCR和Western blot等方法,筛选出干扰效率达60％的shRNA干扰片段,构建出可用于今后ATF6通路相关研究的重组慢病病毒干扰载体,为山羊妊娠相关研究提供材料.
【期刊名称】《动物医学进展》
【年(卷),期】2019(040)005
【总页数】6页(P22-27)
【关键词】激活转录因子6(ATF6);内质网应激;短发夹RNA(shRNA);慢病毒
【作 者】付饶;李会玲;王磊;杨迪琦;温鑫;靳亚平
【作者单位】西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌 712100;陕西省畜牧技术推广总站,陕西西安 710016;西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌 712100;西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌 712100;西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌
712100;
【正文语种】中 文
【中图分类】S852.65
细胞凋亡途径有线粒体、死亡受体以及内质网三种途径，病理条件引起内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)时，可由未折叠蛋白反应(unfolded
protein response，UPR)缓解、恢复内质网(ER)稳态，但当ERS过于严重而不能逆转时就会诱导细胞的凋亡[1]。激活转录因子6(ATF6)蛋白是Ⅱ型跨膜蛋白，具有ATF6α(90 ku)和ATF6β(110 ku)两种亚型，是UPR的三条主要通路的关键蛋白之一。当细胞出现ERS时，ATF6就会与Grp78分离并由COPⅡ囊泡转运至高尔基体，被site-1蛋白酶和site-2蛋白酶剪切成为活性形式p50ATF6(50 ku)，进入细胞核内与内质网应激反应元件(ER stress-response elements，ERSE)、UPR元件(UPR element，UPRE)等基因结合并激活其转录表达，从而改善ER的状态，促进细胞生存。
靶向Midkine 基因的siRNA 真核表达载体的构建及鉴定
靶向Midkine 基因的siRNA 真核表达载体的构建及鉴定
孙梅;谢淑丽;张兴义;李玉林
【期刊名称】《中国老年学杂志》
【年(卷),期】2009(29)7
【摘 要】目的 构建靶向midkine基因的siRNA 的表达载体,为研究midkine在肿瘤中作用提供一个新的方向.方法 根据基因库中midkine cDNA 序列设计和合成针对人midkine 基因的siRNA 寡核苷酸,定向克隆入质粒载体PGCsiU6,对该重组表达载体进行酶切鉴定及DNA 测序.结果 酶切鉴定、DNA 测序证实表达质粒构建成功,无碱基突变.结论 成功构建了靶向midkine 基因表达的siRNA 干扰质粒载体PGCsiU6/midkine,为进一步运用RNA干扰技术进行midkine 基因功能研究奠定了基础.
【总页数】2页(P829-830)
【作 者】孙梅;谢淑丽;张兴义;李玉林
【作者单位】吉林大学白求恩医学部,病理生物学教育部重点实验室,吉林,长春,130021;吉林大学白求恩医学部,病理生物学教育部重点实验室,吉林,长春,130021;吉林大学第二医院;吉林大学白求恩医学部,病理生物学教育部重点实验室,吉林,长春,130021
【正文语种】中 文
【中图分类】Q78
【相关文献】 1.靶向卵巢癌HIF-1α基因siRNA真核表达载体的构建及鉴定 [J], 邹颖刚;薛惠荣;崔满华
2.靶向survivin基因的siRNA真核表达载体的构建及鉴定 [J], 李红;李明红;缪书卉;杨桦;镡旭民
3.靶向Galectin-1基因的 siRNA真核表达载体构建及鉴定 [J], 任东明;王磊;王一羽
4.靶向Notch1基因siRNA真核表达载体的构建与鉴定 [J], 艾星;居正华;吴准;史涛平;王保军;徐华;刘双林;吴正启;胡建庭;周辉霞;张旭
5.靶向人类心脏发育候选基因hole的siRNA真核表达载体的构建和鉴定 [J], 周军媚;姚峰;谢华平;叶湘漓;王跃群