激光扫描共聚焦显微镜参考文档
激光共聚焦原理范文
激光共聚焦原理范文激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种应用激光光源和共聚焦光路原理的现代显微镜，其基本原理是利用激光光源产生的激光束，通过聚焦物镜将激光束聚焦到样品上，并收集样品反射、透射或荧光发射的激光信号，经过共聚焦光路的滤波和光电倍增器放大后，通过扫描装置控制光束在样品不同位置的扫描，最后通过成像系统将信号转化为图像。
下面详细介绍激光共聚焦显微镜的原理。
1.光路结构激光共聚焦显微镜的光路结构主要由激光器、激光光束系统、共聚焦光学系统和光学检测系统组成。
激光器通常采用氩离子激光器或氮气激光器等可产生高能量、窄谱宽激光束的光源。
激光光束系统由准直器、束整形器和聚焦器组成，主要用于产生、整形和准直激光光束。
共聚焦光学系统由物镜和扫描装置组成，其主要作用是将激光光束聚焦到样品上，并进行扫描。
光学检测系统主要由物镜、分光器、光学滤光器和光电倍增器等组成，用于收集并检测样品反射、透射或荧光发射的激光信号。
2.激光共聚焦光学系统原理激光共聚焦光学系统由聚焦镜头和扫描装置组成。
聚焦镜头由物镜和扫描镜组成，物镜用于将激光光束聚焦到样品的局部区域，扫描镜用于控制激光光束在样品上的扫描。
聚焦镜头的光学轴与激光光束保持一致，其焦点与样品接触面构成一个共聚焦点，也称为焦斑。
激光光束通过聚焦镜头后，其径向和轴向分辨率都很高，使得显微镜在透射成像的同时，还能够进行光学切片和三维重建。
扫描装置通过控制扫描镜的运动，使激光光束可以在样品平面上进行扫描，从而实现对样品不同位置进行扫描成像。
3.光学检测系统原理光学检测系统主要用于收集并检测样品反射、透射或荧光发射的激光信号。
光学信号经过物镜和分光器后进入光学滤光器，滤光器可以选择性地透过或屏蔽特定波长的激光信号。
经过滤光器的激光信号最后进入光电倍增器，通过电子放大器将光信号转化为电信号，再通过数模转换器转化为数字信号，最终通过计算机处理并生成图像。
激光扫描共聚焦显微镜
1、 选择好适宜的荧光探针。 原则上讲,无论是荧光素还是荧光标记抗体均 可用于LSCM 。如果打算用2种以上荧光标记物,要 注意它们是否激发光波长及发射光波长能区别开， 还要注意是否与LSCM的激发器相匹配，要根据现有 的激发波长来选择荧光标记物。
• 不同的荧光探针在不同标本的效果常有差异，故除综合 考虑以上因素以外，有条件者应进行染料的筛选，以找 出最适的荧光探针。
6.观察活细胞、活组织：ＬＳＣＭ在不损伤
细胞的前提下，对活组织、活细胞进行观 察和测量，这不仅省去了繁琐的样品前期 处理过程(如脱水、脱蜡、染色等);而且观 察过的样品还可以继续用于其他的研究。 这种功能对于细胞培养、转基因研究尤为 重要。这可以说是ＬＳＣＭ最大的优势。
7. 生化成分精确定位观察配合专用的分子探 针，对于要检测的成分不仅可以定位到细 胞水平，还可以定位到亚细胞水平和分子 水平。
2015/6/12
激光扫描共聚焦显微镜：以激光作为激发光源，采用 光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫 描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统.
形态学研究：组织细胞 标本的抗原免疫荧光检 测，凋亡检测…
目的结构是用荧光探针标记的， 都可以用激光共聚焦显微镜观察
分子生物学：荧光原位杂交对DNA 和RNA定量，外源基因在真核细胞 的表达及定位，蛋白质相互作用 (FRET)…
4. 采 用点扫描技术将样品分成无数个点，用十分细小的激光 束逐点逐行扫描成像，再通过电脑组合成一个整体。传统的 光镜在场光源下一次成像，标本上每一点都会受到相邻点的 衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无 法相比的。
5.光电倍增管：检测设定范围内的光信号，并将光信号转换成 电 信号，相当于相机中的CCD或胶卷。 PMT只能检测到信号的强弱，不能记录信号的颜色，记录 的 结果通过信号强度和填充颜色表示。PMT单位用电压值V 表示，数值越大代表信号倍增越大，提高倍增会同时增加图 像的正常信号强度和噪声信号强度，使图像的信噪比下降。
激光扫描共聚焦显微镜（LaserScanningConfocalMicroscopy
激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscopy, LSCM)成像技术目的结构是用荧光探针标记的，都可以用激光共聚焦显微镜观察形态学研究：组织细胞标本的抗原免疫荧光检测，凋亡检测…分子生物学：荧光原位杂交对DNA和RNA定量，外源基因在真核细胞的表达及定位，蛋白质相互作用(FRET)…活细胞动态荧光测量：细胞内Ca2+、Cl-等离子的动态分布及定量，细胞连接间的信息传递(FRAP)…成像基础：荧光成像主要原理：利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测。
z sections = imagesyzx激光共聚焦显微镜的设计特点：Laser：经过照明针孔后形成点光源，光源方向性强、发散小、亮度高、颜色纯、单色性强Beamsplitter(光束分离器)：将样品激发荧光与其他非信号光线分开。
Pinhole (照明针孔和探测针孔)：最大限度的阻挡非聚焦平面以及聚焦平面上非焦点斑以外的散射光，以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来自于样品焦点位置PMT (PhotoMultiplier Tube, 光电倍增管)：检测设定范围内的光信号，并将光信号转换成电信号，相当于相机中的CCD或胶卷PMT只能检测到信号的强弱，不能记录信号的颜色，记录的结果通过信号强度和填充颜色表示PMT单位用电压值V表示，数值越大代表信号倍增越大，提高倍增会同时增加图像的正常信号强度和噪声信号强度，使图像的信噪比下降激光扫描共聚焦与传统荧光显微镜的主要区别： 激光扫描共聚焦显微镜只接收共焦点处荧光。
普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光，来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜接收。
影响来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率（焦平面以外的荧光结构模糊、发虚）。
CCDPMTFV1000 (Olympus)：多个荧光通道(405, 458, 488, 515, 543, 633)，可同时检测多个荧光标记一个透射光通道，透射光图像为非共焦图像激光扫描共聚焦显微镜的主要应用No.1 免疫荧光染色(单标、双标、多标)细胞浆、核、膜抗原的分布、半定量分析 几种抗原的共定位抗原与细胞器的共定位抗原转位No. 2 荧光标记活细胞内成分：氯离子荧光探针：MQAE[N -(Ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxyquinolinium bromide]细胞内pH的荧光探针：BCECF AM[2’,7’-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein, acetoxymethyl ester]活性氧荧光探针：DCFH-DANO荧光探针：DAF-FM DA[3-Amino,4-aminomethyl-2’,7’-difluorescein, diacetateNo. 3 荧光标记各种亚细胞结构：细胞内微丝：荧光染料标记的毒蕈肽(phalloidin)细胞膜荧光探针：DiI 即DiIC18(3) [1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，红]和DiO即DiOC18(3) [dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate，绿] 内质网探针：荧光标记的glibenclamide高尔基体探针：荧光标记的C5-ceramide。
激光共聚焦显微镜中文说明书
激光共聚焦显微镜中文说明书12020年4月19日激光共聚焦显微镜FV1000(倒置显微镜IX81) 简易使用说明书2 2020年4月19日32020年4月19日开启系统 1.打开计算机.2.打开激光器.(打开钥匙开关.) 2-1.多线氩离子 (458 nm, 488 nm, 514 nm) ON2-2氦氖绿 (543 nm) ON2-3氦氖红 (633 nm) ON 3.打开汞灯电源开关. 4.登陆 Windows XP 系统.User ID: Administrator Password: fluoview5.双击快捷方式：打开 FV10-ASW 应用软件.5231文档仅供参考，不当之处，请联系改正。
42020年4月19日User ID: AdministratorPassword: Administrator* 系统软件的启动需要等待一定时间.显微镜镜下观察 微分干涉差观察1.使用手控面板选择物镜. (参照Memo .)2.插入起偏镜.3.插入微分干涉滑块.*DIC元13 24手控面板用此旋钮进行微分涉法对比度的调.4.点击FV10-ASW软件中的图标.Note1:使用TD滑块控制卤素灯的光强；Note2:检查滤色片转盘的位置是否为“6.DICT”，如果不是，用手柄按下DICT 图标5.标本聚焦Memo显微镜镜下观察荧光观察52020年4月19日619日1.使用手控面板选择物镜.2.点击FV10-ASW 软件中的图标.3.使用手控面板选择荧光滤色片.(参照Memo .)4.标本聚焦.2Hand switchMemo 关于荧光滤NIB ： 蓝色激/ 绿色荧（FIT 、 EGFP 等WIG ： 绿色激/红 色 荧（Rhodamin 、 DsRed 等72020年4月19日扫描模式扫激光输出的调节明场观察( 显微镜镜下观察) 荧光观察( 显微镜镜下观察 ) 扫描的按钮 选择 XYZ,XYT 或 XYL 每个通道的调节 共聚焦的孔径大小 卤素灯的光强调节 Kalman方式 染料选择 光路图取图条件的保存 调出取图条件TwinScanner设定图像的拇指索引图像显示窗口内存中所显示的文件Lambda扫描的设定 物镜 聚焦时间间隔和时间计数( 用于 XYT 或 XT 扫描)λ 扫描带宽选择描速82020年4月19日文档仅供参考，不当之处，请联系改正。
激光扫描共聚焦显微镜讲课文档
•乳腺上皮细胞主要细胞器的检测
•37℃预热、 终浓度为50nmol/L的M-7512工作液，37℃染色40min；
•37℃预热、终浓度为 1μmol/L 的 E-34251 工作液，37℃染色 30min
•10μg/ml 的 Hochest 33258 复染 5min
•图像采集与数据处理
农业的应用:
Jasplakinolide解聚微丝的实时观察
第二十四页，共31页。
•Zaslavskaia et.al, Martek Biosciences, MD, June 15, 2001 第二十五页，共31页。
November 2001; Volume 128 (21): pp 4301-4314. Courtesy: Jose-Eduardo Gomes, University of Oregon, USA
Nature, 25 April 2002, pg 854
第二十六页，共31页。
第二十七页，共31页。
• GFP-MAP4
Cyr
架 （ 美 国 实融 验合 室蛋 ）白
表 达 显 示 微 管 骨
第二十八页，共31页。
•奶山羊发育中乳腺上皮细胞主要细胞器的变化
•为研究奶山羊乳腺的胚后形态发育，采用活细胞荧光标 记法结合激光共聚焦显微技术，观察奶山羊乳腺发育中 主要细胞器的变化。 •根据奶山羊乳腺发育特点，采样时点分为：妊娠期 1 月、3 月、5 月； 泌乳期 10 日、30、60 日、120 日；退化期 3 日、 7 日、21 日，共计 10 个时点。
2.样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象
• 荧光显微镜的缺点:
1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多荧光的同时采 集
OLYMPUS激光共聚焦显微镜说明0906
2， 技术特点 同类产品相比有如下技术特点和优势： 1）光学最小分辨为 0.12um,有实例为证。
2）测量的重复性为：3n-1=0.02um, 在同类产品中精度最高。 3）测量数据有权威机构认证，OLS4000 测量精度是由日本品质保证机构严格的追溯体系来 保证，可以提供高可靠性的测试数据。
1
4）光学放大倍数范围：108X---17280X, 108 倍：更宽的视野，可迅速找到测试部位； 17280 倍：突破光学显微镜的放大极限； 5）20X/50X/100X 物镜档次采用显微镜中最高档的―――平场复消色差物镜，
数值孔径（分辨率最高）最大，可以观察更大角度的斜面。
6） 迅速找到测试部位：在操作界面可轻松控制的 100 X 100mm 电动载物台，大画面高倍清 晰图像，小画面低倍宽视野定位图像，即使是在高倍观察时也不会迷路。
2
7） 便于操作，降低污染或破坏样品可能性的 6 孔电动物镜转盘
8） 多样化的观察方式 明场，明场微分干涉，激光共焦，激光共焦微分干涉
3
9） 可以克服同一画面内有不同反射率的双共焦光学系统
双共焦系统
10）
INR（智能降噪Biblioteka 演算方式11）内置减振机构，再不用配笨重的防振台
4
3， 检测内容 1）高分辨率二维形态观察，真实色 2 维观察； 2）高分辨率三维形貌观察，真彩三维形貌观察， 3）高精度测量：线宽，高度测量，线粗糙度，面粗糙度，面积，体积测量，几何测量，直 径/半径测量，圆周长，颗粒分析，膜厚测量等。
OLYMPUS 激光共聚焦显微镜-OLS4000
1， 主要性能指标
激光光源 物镜 光学放大倍率 观察范围 载物台 二维分辨率 Z 轴最小移动分辨率 X 轴方向测量重复精度 Z 轴方向测量重复精度 半导体激光器 (λ = 405 nm ) 5X / 10X 为 半复消色差物镜 20X / 50X / 100X 为 LEXT 专用复消色差物镜 108X-17280X 128X128 微米-2560X2560 微米 100X100mm 超声波电动载物台 0.12 m 0.01 m (光栅尺刻度为 0.0008 m) 3n-1=0.02 m (条件为使用 MPlanApo100 物镜) =0.012 m。 (条件为使用 MPlanApo100 物镜) 日本工业安全标准 2 级
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
缺点
昂贵
激光扫描共聚焦显微镜的价格相对 较高，不是所有的实验室都能够负
担得起。
需要专业操作
使用该显微镜需要一定的专业知识 和技能，对操作者的要求较高。
样本制备要求高
由于该显微镜对样本的厚度和折射 率等参数敏感，因此需要精心制备 样本。
维护成本高
激光扫描共聚焦显微镜的维护成本 也相对较高，需要定期检查和保养 。
04
激光扫描共聚焦显微镜的 优缺点
优点
高分辨率
激光扫描共聚焦显微镜利用激光束进行 扫描，可以实现比传统显微镜更高的分 辨率。
灵敏度高
由于激光束的强度高，该显微镜对样本 的灵敏度也相应提高，可以检测到较弱 的荧光信号。
减少光损伤
共聚焦技术只对焦点处的样本进行照明 ，有效减少了光损伤。
三维成像
激光扫描共聚焦显微镜可以采集样本的 三维图像。
仪器清洁
清洁显微镜的透镜和其他部件，以确保观察的清晰度和准确 性。
图像获取
参数设置
在获取图像前，需要设置激光扫描共聚焦显微镜的参数，如扫描速度、扫描分辨 率、激光波长等。
图像获取
通过激光扫描共聚焦显微镜获取细胞样本的图像。
数据分析
对获取的图像进行处理，以提 高其清晰度和对比度。
02
数据测量
01
图像处理
显微镜控制和分析软件。
02
基于图形用户界面，方便用户进行样本观察、图像获
取和数据分析。
03
支持多种组织样本类型，包括免疫荧光、荧光原位杂
交等。
Definiens Developer
一种基于规则和智能图像分析软 件，用于构建细胞和组织图像分
析流程。
提供强大的图像处理和分析工具 ，包括图像预处理、特征提取、
激光扫描共聚焦显微镜(研究生)1
stage (before dividing into 2-cell embryo)
Differential Interference Contrast (DIC; Nomarski)
Laser Scanning Confocal Microscopy (LSCM)
1、LSCM的根本结构
荧光显微镜系统及样品台
激光光源
扫描器
图象存储及处理系统
控制
计算机控制系统
LSCM各局部相互关系示意图
共聚焦显微镜与普通光学显微镜的比较
激光扫描共聚焦显微镜 普通光学显微镜
激光光源 共轭聚焦原理和装置
场光源 干扰
计算机数字图象处理分析系统
照相
Light Microscopy
〔5〕、连续分光设计系统〔或其它光谱别离系统〕
〔6〕、光谱扫描功能 〔7〕、扫描速度及速度调节
〔8〕、扫描方式
XYZtλ任意组合 ①点扫描 ②线扫描 ③Xλ扫描 ④平面扫描
⑤XYλ、XZλ扫描 ⑥xyz, xyzt扫描 ⑦局部放大 扫描 ⑧光谱模式下，多通道同时扫描。
〔9〕、扫描旋转、光学放大〔变倍〕
OLYMPUS 尼Pe康rk（inEnlimkoenr)
高通量共聚焦显徽细胞图像 分析测定系统
GE Healthcare
时间分辨激光共聚焦显微成 像系统
德国耶莱公司
德国ZEISS激光共聚焦显微 镜
德国 ZEISS
德国ZEISS激光共聚焦显微 镜
德国ZEISS
型号
Pathway415、 Pathway435 800系列
1〕蛋白质、单糖和多糖探针； 2〕细胞器探针； 3〕核酸探针； 4〕细胞活性探针； 5〕膜和受体探针； 6〕细胞膜电位和细胞内pH探针； 7〕金属探针； 8〕分子的特殊基团结合探针； 9〕其他
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显微CT与三维重组
11
3D reconstruction
12
三.动态测量
游离Ca2+, Mg2+ 、K+、Na+测量
pH值的检测 ?自由基的检测
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?相对 测量
Channel 1
Int.
160.00
120.00
80.00
40.00
0.00 200.00
Channel 2
Int. 80.00
2
Fluorescent Microscope Confocal Microscope
Arc Lamp
Laser
Excitation Diaphragm Excitation Filter
Ocular
Excitation Pinhole
Excitation Filter PMT
Objective
Objective
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荧光共振能量转移（ FRET）技术
? 生物大分子结构和功能研究
? 免疫分析 ? 核酸杂交分析 ? 蛋白质间相互作用研究
D
A
D
A
r >2R0
r <2R0
r: 分子间距离 R0: 分子间发生50%能量转移的距离
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?检测 以FL1的激发波长的光照射样品，没有共振转移时，只检 测到 FL1的发射光(绿光)，发生共振转移时，就可检测出 FL1的荧光(绿光)减弱，FL2(红光)的增强。
? 荧光显微镜的缺点:
1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多荧光的 同时采集
2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。 3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。 4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作. 5.对于信号较弱的样本,无法提高观察的灵敏度. 6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度重叠
?序列的扫描测量
? F/F=(F-F base )/(Fbase -FBG)
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四.细胞膜电位的测量
标记膜电位探针(慢反应）：
JC1
510nm
530/590nm
Dioc5(3)
548nm
573nm
Dioc6(3)
484nm
快反应探针：
500nm
Di-4-ANEPPS 496nm
703nm
Di-4-ANEPPS 498nm 细胞膜静息膜电位： -70mV
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激光共聚焦显微镜的应用
? 单、双、三 ,四色标记检测。 ? 精确的一、二、三、四维观察。 ? 高品质的荧光成像、透射成像、物体表面
反射成像。 ? 静态和动态观察 (CA2+,pH,膜电位,膜流动
性等)。 ? 定性以及定量分析。 ? 光谱扫描,ROI扫描. ? 特殊的光反应 (FREP,FRAP,CAGED-UNCAGED
激光扫描共聚焦显微技术
Laser scanning confocal microscopy
?
1
激光扫描共焦显微镜的设计特点: ? 1.点照明,具有照明pinhole和探测pinhole ? 2.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦), 共
焦点即被探测点，被探测点所在的平面为 共焦平面 ? 3.具有扫描系统—— 逐点扫描成像 ? 4. 激光作为光源 ? 5.具有多个（四个） 荧光通道，可同时探 测多个被标记物
Emission Filter
Emission Pinhole Filter
3
人眼分辨率：
0.2mm
光学显微镜分辨率：0.25mm
电子显微镜分辨率：0.2nm
共焦显微镜分辨率：0.18mm
4
? 电子显微镜的缺点：
1.由于样品需要固定,观测活细胞十分困难. 2.样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象
等)。
6
激光共聚焦显微成像技术的应用
单标，双标和三标图像
明场，DIC, 相差和透射光图像
出色的反射光图像
时间分辨和快速扫描动态图像
7
一.定位、定量
?免疫荧光标记（单标、双标或三
标）的定位、定量
如：细胞膜受体或抗原的分布，
微丝、微管的分布、 两种或三种蛋白的共存与
共定位、蛋白与细胞器的共定位、干细胞的分化
Time
Recovery of fluorescence
Zero time
10 seconds
FRAP( Fluorescence recovery after photobleaching)原理
30 seconds
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荧光光漂白后的回复： FRAP ? 生物膜脂质分子的侧向扩散； ? 胞间通讯的研究； ? 胞浆及细胞器内小分子物质转移性的观测等 ? 细胞骨架构成、核膜结构及大分子组装等。
?细胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI
末端原位杂交-fitc + PI
?荧光原位杂交： 染色体基因定位
?单细胞凝胶电泳
?GFP的表达
?活细胞或活体组织静息游离Ca2+ 的分布与定量
?活细胞内pH的定定量
8
Immuno-fluorecence label
713nm
线粒体膜电位：-150mV
以上均属于阳离子探针，更容易与线粒体亲和，为线粒体膜电位探针
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? 五.荧光漂白恢复(FRAP: Fluorescence Recover after
photobleaching ）
%F
Intense laser Beam
Bleaches Fluorescence
Hela green- 中心体 red- 纺锤体
9
二.光学切片和三维重组
光学切片和三维重组:LSCM通过薄层光学切片功能 ，可获得标本真正意义上的三维数据，经计算机 图像处理及三维重建软件，产生生动逼真的三维 效果，可进行形态学观察，并揭示亚细胞结构的 空间关系，用以阐明三维结构与组织功能之间的 关系。
60.00
40.00
20.00
0.00 200.00
Physiology Chart (Time: 11:40:49)
400.00
600.00
800.00
1000.00
1200.00
s
400.00
600.00
800.00
1000.00
1200.00
s
?程序化测量：用timelapse 中的编程按钮可进行不同时间
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六．荧光能量共振转移 ( fluorescence Resonance Energy Transfer)
能量转移：能量从分子的一个部位向另一个部位的传递， 或能量从一个分子向另一个分子传递。能量的提供者叫能 量供体，能量的接受者叫能量受体。
荧光能量共振转移的条件 ?两个荧光分子：供体-FL1 ，受体-FL2 ?供体与受体的距离在2-7nm ?供体的发射波长与受体的激发波长一致