硝化细菌的分离与鉴定范文
实验硝化细菌实验报告
一、实验目的1. 了解硝化细菌的基本特性及其在水质净化中的作用。
2. 掌握硝化细菌的培养方法及观察指标。
3. 探讨硝化细菌在不同环境条件下的生长情况。
二、实验材料与仪器1. 实验材料：硝化细菌菌种、纯净水、氨水、亚硝酸钠、硝酸钾、氯化钠、葡萄糖、琼脂、pH试纸等。
2. 实验仪器：恒温培养箱、培养皿、移液枪、烧杯、试管、显微镜、pH计等。
三、实验方法1. 硝化细菌的分离与纯化（1）取一定量的土壤样品，加入无菌水，搅拌均匀。
（2）取适量土壤悬液，接种于琼脂平板上，加入氨水作为氮源。
（3）将平板放入恒温培养箱中培养，观察菌落生长情况。
（4）挑取单菌落，接种于新的琼脂平板上，重复步骤（3），直至获得纯化硝化细菌。
2. 硝化细菌的生长曲线测定（1）将纯化后的硝化细菌接种于装有适量纯净水的小试管中。
（2）分别加入不同浓度的氨水作为氮源，设置对照组（不加氨水）。
（3）将试管放入恒温培养箱中培养，定期取样，测定硝化细菌的OD值。
（4）以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制硝化细菌的生长曲线。
3. 硝化细菌在不同环境条件下的生长情况观察（1）将纯化后的硝化细菌接种于装有适量纯净水的小试管中。
（2）分别加入不同浓度的亚硝酸钠、硝酸钾、氯化钠等物质，模拟不同环境条件。
（3）将试管放入恒温培养箱中培养，定期取样，观察硝化细菌的生长情况。
四、实验结果与分析1. 硝化细菌的分离与纯化实验过程中，成功分离出纯化硝化细菌，菌落呈白色，表面光滑。
2. 硝化细菌的生长曲线测定实验结果显示，硝化细菌在氨水浓度为0.5mg/L时生长速度最快，OD值达到最大值。
生长曲线呈典型的S型，表明硝化细菌在适宜的条件下具有较好的生长性能。
3. 硝化细菌在不同环境条件下的生长情况观察实验结果表明，硝化细菌在亚硝酸钠浓度为0.1mg/L、硝酸钾浓度为0.5mg/L、氯化钠浓度为0.5mg/L时生长情况较好，生长速度较快。
在较高浓度的亚硝酸钠、硝酸钾、氯化钠等物质下，硝化细菌生长受到抑制。
!!好氧反硝化菌的分离鉴定及特性研究
好氧反硝化菌的分离鉴定及特性研究张光亚,陈培钦(华侨大学生物工程与技术系,福建泉州 362021)摘 要 从土壤中分离到1株能以硝酸钠为氮源进行好氧反硝化作用的细菌,命名为Rhodococcus sp.DN,分离菌株革兰氏染色为阳性,球状或杆状,菌落颜色为橙红色。
该细菌能以乙酰胺为惟一碳源和氮源,能进行氨化和硝化作用并产生亚硝酸。
部分长度的16S rDNA序列分析表明,所分离的细菌与Rhodococcus ruber的16S rDNA序列具有99%相似性。
关键词 好氧反硝化;Rhodococcus sp.DN;16S rDNA序列;系统发育分析中图分类号 S154.38+1 文献标识码 A 文章编号 1005-7021(2005)06-0023-04Isolation,Identif ication and Characteristics of Aerobic Denitrifying B acteriaZHAN G Guang2ya,CHEN Pei2qin(Dept.of Biotechnol.&Bioengi n.Huaqiao U niv.Quanz hou,Fujian Prov.362021)Abstract An aerobic denitrifying bacterial strain name as DN was isolated from soil.The cells growth cycle was hy2 pha2rod2cocci.The clones of the strain were orange2red.Strain SDN could denitrify nitrate companying with the for2 mation of nitrite in aerobic environment.It could use acetamide as the sole carbon and nitro gen sources.The phylo2 genetic analysis based on partial16S rDNA suggested that the strain DN was the closest relative to Rhodococcus ruber with99%of sequence similarity.The phylogenetic analysis of strain DN was performed by PHY L IPS and unrooted phylogenetic tree of strain DN and the neighboring denitrifying bacteria given.K eyw ords aerobic denitrification;Rhodococcus sp.DN;16S rDNA sequence;phylogenetic analysis 一般认为硝化作用只发生在好氧条件下,而反硝化只能在厌氧或缺氧的条件下进行。
三株嗜盐异养硝化细菌的分离鉴定及其脱氮特性的开题报告
三株嗜盐异养硝化细菌的分离鉴定及其脱氮特性的开题报告一、选题背景近年来，氮污染愈加严重，严重影响着水体、土壤以及生态环境的健康。
硝化反应是自然界中氮的循环过程的重要环节，在氨氧化和硝化反应中，氨氧化和硝化细菌是非常重要的催化剂。
其中，硝化细菌催化硝化反应，将氨氮转化为硝酸盐氮，从而使氮得以进一步地循环。
如何发挥硝化细菌在氮循环过程中的作用，成为了污水处理及水资源管理的研究热点。
硝化细菌的耐受性对于生物处理的效果和经济效益有着巨大的影响。
嗜盐异养硝化细菌作为一种具有高盐容忍度的硝化细菌，其独特的脱氮特性在海水养殖废水、沼气污水处理等领域有着广泛的应用前景。
因此，分离鉴定嗜盐异养硝化细菌及其脱氮特性的研究，对于提高生物处理效率、降低处理成本和保护环境等方面具有重要的意义。
二、研究内容本研究将从自然界中采集含有高盐浓度的水样或废水样品，通过离心、传统菌落计数法和分子生物学技术，筛选出嗜盐异养硝化细菌。
通过宏量酶联免疫吸附法和ISH技术等方法，进行接种量的优化；通过生物反应器进行硝化反应实验，研究其脱氮特性以及对于盐浓度的适应性。
同时还将分析影响嗜盐异养硝化细菌的生长和脱氮特性的因素，如氨氮浓度、pH值、温度和盐浓度等物理化学因素。
三、结论预期研究结果将有助于：(1) 掌握嗜盐异养硝化细菌的筛选、分离、鉴定及其适应性特点；(2) 探究嗜盐异养硝化细菌对于水体中氮的转化和脱氮方面的特性，从而为海水养殖废水、沼气污水等领域开发新型的环保脱氮技术提供一定的理论支持和实践经验。
(3) 针对硝化细菌抗盐变异规律的研究，有助于筛选和研发抗盐性更强的氨氧化、硝化细菌菌种。
硝化细菌的富集培养,分离纯化
硝化细菌的富集培养,分离纯化硝化细菌将氨氧化为硝酸的过程。
19世纪以前，人们把硝酸盐看作是化学作用的产物，即空气中的氧和氨经土壤催化形成。
1862年L.巴斯德首先指出硝酸盐的形成可能是微生物作用的结果。
1877年，德国化学家T.施勒辛和A.明茨用消毒土壤的办法，证实了氨被氧化为硝酸的确是生物学过程。
1891年，С.Н.维诺格拉茨基用无机盐培养基成功地获得了硝化细菌的纯培养，最终证实了硝化作用是由两群化能自养细菌进行的。
先是亚硝化单胞菌将铵氧化为亚硝酸；然后硝化杆菌再将亚硝酸氧化为硝酸。
这两群细菌统称硝化细菌。
其作用过程如下：硝化细菌从铵或亚硝酸的氧化过程中获得能量用以固定二氧化碳，但它们利用能量的效率很低，亚硝酸菌只利用自由能的5～14％；硝酸细菌也只利用自由能的5～10％。
因此,它们在同化二氧化碳时，需要氧化大量的无机氮化合物。
土壤中硝化细菌的数量首先受铵盐含量的影响，一般耕地里，每克土中只有几千至几万个。
添加铵盐即可使其数量增至几千万个。
土壤中性偏碱，通气良好，水分为田间持水量的50～70％，温度为10～30℃时，最适宜硝化细菌的生长繁殖，铵盐也能迅速被转化为硝酸盐。
自然界中,除自养硝化细菌外,还有些异养细菌、真菌和放线菌能将铵盐氧化成亚硝酸和硝酸，异养微生物对铵的氧化效率远不如自养细菌高，但其耐酸，并对不良环境的抵抗能力较强，所以在自然界的硝化作用过程中，也起着一定的作用。
--------------------------------------------------------------------------------氨在微生物作用下氧化为硝酸的过程。
通常发生在通气良好的土壤、厩肥、堆肥和活性污泥中。
作用机理硝化作用由自养型细菌分阶段完成：第一阶段为亚硝化，即氨氧化为亚硝酸的阶段。
参与这个阶段活动的亚硝酸细菌主要有5个属：亚硝化毛杆菌属(Nitrosomonas) ；亚硝化囊杆菌属(Nitrosocystis)；亚硝化球菌属(Nitrosococcus)；亚硝化螺菌属(Nitrosospira)和亚硝化肢杆菌属(Nitrosogloea)。
土壤中反硝化细菌的分离
土壤中反硝化细菌的分离、纯化邓晓娟查美玲曹娟芳（江西师范大学生命学院南昌330022）摘要：关键词：反硝化细菌，反硝化作用，硝酸盐Abstract:Key words:氮素是水体污染中的一类重要的污染物，对人体健康和环境有极大的危害。
近几十年来，规模日益扩大的水产养殖业造成水体中积累大量的鱼类粪便、残饵和死亡的动植物尸体，导致水体氮素含量严重超标，养殖生态环境遭到破坏，鱼虾病害频发，最终造成巨大的经济损失。
硝化作用由亚硝酸盐细菌和硝酸盐细菌将氨化合物氧化为亚硝酸盐和硝酸盐；反硝化作用也称脱氮作用，由微生物在厌氧或微厌氧条件下将硝酸盐还原成氧化亚氮或氮气，因此，硝化作用与反硝化作用在维持自然界氨的平衡及氮的正常循环中扮演着非常重要的作用。
具有反硝化能力的细菌就目前所知分布于50多个属，约有150余种，绝大部分属于变形细菌纲(Proteobacteria)中的α和β簇群[]。
反硝化细菌能将硝态氮或亚硝态氮还原成含氮气体或氮气，不过并不是所有的反硝化细菌都能进行完全的反硝化过程，编码亚硝酸盐还原酶的基因才是反硝化细菌的关键功能基因，在进行反硝化的分子生态学研究中也主要以nirS或nirK基因作为分子标记。
传统上认为反硝化作用只有在厌氧或缺氧条件下发生，但是在水处理过程中也观察到好氧反硝化现象。
尽管有人将好氧反硝化现象的发生归因于微环境中的厌氧条件，但是目前已有相当数量的好氧反[2]、Pseudomonas aeruginosa[l4,15]、Pseudomonas stutzeri[13,16,17]、Alcaligenessp．[18,19]。
被分离并进行了深入研究，证实好氧反硝化细菌确实存在。
本实验拟从花圃土壤中分离纯化反硝化细菌，对菌株进行初步鉴定，并对菌株的反硝化能力进行研究，旨在分离得到反硝化能力高的菌株，为实际应用提供依据。
1材料1.1培养基富集培养基(即反硝化选择性培养基)：硝酸钾2g、硫酸镁0.2g、磷酸氢钾0.5g、酒石豫钾钠20g、蒸馏水1000ml；pH约7.2。
两株异养硝化—好氧反硝化细菌的分离、筛选、鉴定和特性研究
两株异养硝化—好氧反硝化细菌的分离、筛选、鉴定和特性研究一、本文概述本文旨在探讨两株异养硝化-好氧反硝化细菌的分离、筛选、鉴定及其特性研究。
异养硝化-好氧反硝化细菌是一类特殊的微生物，能够在好氧条件下进行硝化和反硝化过程，对于氮循环和环境保护具有重要意义。
本文首先通过分离和筛选方法，从自然环境中获取两株具有异养硝化-好氧反硝化功能的细菌，并对其进行初步的生理生化特性分析。
接着，采用分子生物学手段对这两株细菌进行鉴定，明确其分类地位和系统发育关系。
在此基础上，进一步深入研究这两株细菌的生长特性、硝化反硝化性能、以及环境因子对其生长和代谢的影响。
本文的研究结果不仅有助于深入了解异养硝化-好氧反硝化细菌的生物学特性和生态学功能，同时也为该类微生物在环境修复、污水处理等领域的应用提供理论支撑和实践指导。
二、材料与方法为了分离和筛选异养硝化—好氧反硝化细菌，我们从多个不同的生态环境中采集了土壤和水样，包括污水处理厂、河流、湖泊以及农田土壤等。
为了培养和筛选目标细菌，我们使用了多种培养基，包括常规的好氧反硝化培养基和异养硝化培养基。
这些培养基根据细菌的生长特性和需求进行了优化。
实验过程中使用了多种分子生物学试剂，如PCR引物、DNA提取试剂盒等。
同时，还使用了多种仪器，如PCR仪、凝胶电泳仪、微生物培养箱等。
采用稀释涂布法将采集的样品接种到含有相应培养基的平板上，通过观察菌落的形态、大小和颜色等特征，初步筛选出具有异养硝化—好氧反硝化能力的细菌。
通过形态学观察、生理生化特性分析以及分子生物学方法（如16S rDNA序列分析）对筛选出的细菌进行鉴定。
对筛选和鉴定出的细菌进行详细的特性研究，包括生长曲线测定、异养硝化速率测定、好氧反硝化速率测定等。
还研究了环境因子（如温度、pH、碳源和氮源等）对细菌生长和硝化反硝化活性的影响。
实验数据采用统计学方法进行分析，以揭示细菌的生长规律和硝化反硝化特性。
还通过图表等形式直观地展示了实验结果。
高效硝化细菌的分离与鉴定
有生长; 肉汤培养基中 N- 7、S- 3、S- 9 有生长; 硝化细菌 分离培养基中都可以生长, 筛选得到生长快、菌落大的 12 株菌来进行下一步的实验。 21 3 在不同 NO-2 浓度下菌落生长情况
高的同源性, 但是它的电子供体是对苯二酚, 不能氧化
细胞色素 C, 因此 命名该酶为 qN or, 由 qN or 基因编
码[ 7] 。2001 年, G esche 等[ 8] 利 用 N or 对 来自纯培养
和环境样品的系统关系进行了研究。
采用脱氧胆酸钠处理, 再用葡萄糖离心分离, 将得
到的酶液进行 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
取 N- 1、N- 2、N- 5、S- 2 4 株菌通过 30 mL / 300 mL 摇瓶发酵 5 d 后( 每样 2 个平行) , 在 540 nm 下检测
自然。
硝化细菌 分离 培养 基 ( g ) : N aN O 2 1, M gSO4 #
7H 2 O 01 03, M nSO 4 # 4H 2 O 01 01, K 2 H PO 4 # 3H 2 O 01 75, N aH 2 PO 4 # 2H 2 O 01 25, 葡萄糖 1, 加去离子水
至 1000 m L, pH 值自然。 人工模拟 富集 培养 液 ( g ) : N aN O 2 1, M gSO4 #
条件, 同 时加入少 量的次氯 酸钠抑制 其它杂菌 的生 长[ 4] , 以达到富集硝化细菌的目的。
对富集培养装置中总体积为 2 L 的培养液, 每隔
几天用格利斯试剂检验
N
O
2
的变化情 况, 或用国标
硝化细菌的分离和鉴定
硝化细菌的分离和鉴定
黄珏
【期刊名称】《水产科技情报》
【年(卷),期】2004(31)3
【摘要】水体中的氨氮和亚硝酸盐是水产养殖过程中的产物，对生物体有毒，亚硝酸盐还是强烈的致癌物质。
如何降解这两种物质，是水产科技工作者一直所关注的研究课题。
硝化细菌是一类具有硝化作用的自养菌，包括硝化菌和亚硝化菌两个生理菌群，其主要特性是生长速率低，具有好氧性、依附性和产酸性等，可通过NH4+·NO2-·NO3-
【总页数】5页(P130-134)
【作者】黄珏
【作者单位】江苏省兽药监察所,南京市,210036
【正文语种】中文
【中图分类】S963.211
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硝化细菌的分离与鉴定要筛选生长速度快、硝化作用强的硝化细菌用于水产养殖水处理。
硝化细菌包括亚硝化菌和硝化菌两个生理菌群，分别可将水中的氨态氮转化为亚硝酸盐和硝酸盐。
实验结果表明经5周培养，亚硝化菌可使培养液中的氨氮含量下降到60％，硝化菌可使培养液中的亚硝酸盐含量下降到60％。
实验可通过测定培养液中亚硝酸盐的含量变化来测定细菌的氨转化作用或硝化作用。
关键词：硝化菌，亚硝化菌，硝化作用，筛选。
氨氮和亚硝酸盐都是在水产养殖过程中产生的有毒物质，且亚硝酸盐还是强烈的治癌物质，因此如何降解这两种物质，是科学工作者近年来的工作重点。
硝化细菌是一类具有硝化作用的化能自养菌，包括硝化菌和亚硝化菌两个生理菌群，其主要特性是自养性，生长速率低，好氧性，依附性和产酸性等。
可通过NH4+→NO2- → NO3-这一过程将NH4+转化为NO3-。
能有效降低水体中氨氮及亚硝酸氮的含量，对水产养殖业及环境保护具有重要意义。
硝化细菌是生物硝化脱氨中起主要作用的微生物，直接影响硝化效果和生物脱氨的效率。
研究表明，水体中硝化细菌的浓度对生物脱氨具有十分重要的意义，由于大多数硝化细菌生长缓慢，硝化及脱氨效果欠佳，处理水产养殖污水的效果不是很好。
因此筛选出生长速率高硝化作用强度大的硝化细菌有很大的用途。
本文对硝化细菌的研究主要在富集培养和固定化细胞方面，能够有效提高硝化细菌的产率和硝化细菌的利用率。
通过富集培养的硝化细菌浓度是未经富集培养的12.5～20.0倍，利用细胞固定化技术可使氨氮去除率提高16.5个百分点。
国外在硝化细菌的培养方面的研究已有一些专利技术，其中一些已形成工业化生产，但产品价格较昂贵，并且必须不断向反应器中补充流失的硝化细菌。
硝化作用包括两个步骤：氨转化为亚硝酸盐和亚硝酸盐转化为硝酸盐，这两个步骤分别由亚硝化菌和硝化菌完成，至今还未发现有能将氨直接转化为硝酸盐的细菌。
氨和亚硝酸分别是亚硝化菌和硝化菌的唯一能源。
对于硝化细菌来说生长环境中的温度对其影响较大，pH值和盐度的影响相对较小。
大多数硝化细菌的合适生长温度为10～38℃，高于20℃时硝化细菌的活性较高，但超过38℃消化作用将会消失。
当环境气温低于20℃时，氨的转化会受到影响。
一般认为，适宜硝化菌和亚硝化菌生长介质的pH值分别为6.0～8.5和6.0～8.0。
水体DO的高低影响到好氧、厌氧微生物的比例，大多数研究人员认为DO的浓度应当控制在1.0～2.0 mg/L，低于0.5 mg/L时硝化作用明显减弱。
另外，碳氮比、碱度等对硝化及脱氨均有影响。
本文中筛选硝化细菌的依据主要是生长速率和硝化作用强度，生长速率主要采用活菌计数，因为硝化细菌的液体培养基中有沉淀，用OD600测的值误差较大。
氨转化效率和硝化作用强度主要用比色法测定，利用亚硝酸根的显色反应。
亚硝化菌测定其培养液中亚硝酸根的增加量，硝化菌测定其亚硝酸根的减少量。
1 材料和方法1.1 实验材料1.1.1 菌种由海洋中分离得到1.1.2 培养基亚硝化菌培养基(NH4)2SO4 0.5g NaCl 0.3g FeSO4•7H2O 0.03g K2HPO4 1g MgSO4•7H2O 0.03g CaCl2 7.5g 蒸馏水1000ml PH 自然固体培养基加5％琼脂硝化菌培养基NaNO2 1g MgSO4•7H2O 0.03g MnSO4•4H2O 0.01g K2HPO40.75g Na2CO3 1g NaH2PO4 0.25g 蒸馏水1000ml PH 自然固体培养基加5％琼脂肉汤培养基牛肉膏0.5％蛋白胨1％氯化钠0.5％琼脂2％1.1.3 试剂牛肉浸膏上海长阳生化制药厂蛋白胨上海东海制药厂磷酸氢二钾浙江临平化工试剂厂磷酸二氢钠南京化学试剂一厂磷酸氢二钠南京化学试剂一厂氯化钠南京化学试剂一厂MnSO4•4H2O 南京化学试剂一厂琼脂江苏疾病预防控制中心微生物试剂厂（NH4）2SO4 南京化学试剂一厂FeSO4•7H2O 上海试剂二厂MgSO4•7H2O 上海试剂四厂CaCl2 华东师范大学化工厂Na2CO3 上海虹光化工厂NaNO2 淮安化工二厂磺胺酸天津瑞金特化学品有限公司α-萘胺上海泗联化工厂1.2 实验方法1.2.1 硝化细菌的分离将采集到的海水样本分别放在两个培养皿中，分别加入亚硝化菌液体培养基和硝化菌液体培养基，放在24℃地培养箱中培养5天，然后取培养液在固体培养基上进行分区划线，得到单菌落，再挑取单菌落进行分区划线分离。
1.2.2 形态结构鉴定（1）将分离得到的单菌落分别接种到肉汤培养基的平板上看其是否生长（硝化细菌是严格的自养菌，在肉汤培养基上不能生长）。
（2）镜检观察：单染色法（3）在培养液中加入格利斯试剂，亚硝化菌培养液变红即可判断为阳性，硝化菌的培养液需比色计算出其亚硝酸根浓度是否降低，才能判断是否为硝化菌。
1.2.3 细菌的培养（摇瓶、发酵罐）（1）摇瓶培养：将初步鉴定是硝化细菌的菌落接种到摇瓶中20-28℃培养，200转/分钟，每隔五天取样一次测硝化作用强度和菌浓度。
（2）发酵培养：将培养5天的种子加入发酵罐中，于20-28℃培养，其中pH控制在6.0以上。
每隔12小时取样测亚硝酸根浓度和菌浓度。
1.2.4 硝化作用测定1.2.4.1 试剂（1）格利斯试剂溶液Ⅰ：称取磺胺酸0.5g，溶于150ml醋酸溶液（30％）中，保存于棕色瓶中。
溶液Ⅱ：称取α-萘胺0.5g，加入50ml蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入30％的醋酸溶液150ml中，保存于棕色瓶中。
（2）2%醋酸钠溶液将2g无水醋酸钠加入到100ml蒸馏水中，混匀溶解。
1.2.4.2 方法☆标准曲线的绘制①称取4.500g分析纯亚硝酸钠于干燥的小烧杯中，加蒸馏水溶解后洗入100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度定容，摇匀，溶液中NO2-的浓度为30mg/ml，用时稀释至NO2-为0.03mg/ml。
②吸取NO2-标准液（NO2-0.03 mg/ml）0、1、2、3、4、5 ml，分别放入50 ml容量瓶中，每一容量瓶NO2-浓度为0、0.6、1.2、1.8、2.4、3.0μg/ml；各加入1 ml格利斯试剂Ⅰ，放置10分钟，再加入1 ml格利斯试剂Ⅱ和1ml2％醋酸钠溶液，显色后稀释至刻度。
③用分光光度计于520nm处比色，以浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。
☆培养液中NO2-测定①亚硝化菌氨转化作用测定取1 ml培养液于50 ml容量瓶中，加入1 ml格利斯试剂Ⅰ，放置10分钟，再加入1 ml格利斯试剂Ⅱ和1ml2％醋酸钠溶液，显色后稀释至刻度。
用分光光度计于520nm处比色。
②硝化菌硝化作用强度测定取1 ml培养液稀释100倍（视培养液中NO2-浓度而定），取稀释后的培养液1 ml于50 ml容量瓶中，加入1 ml格利斯试剂Ⅰ，放置10分钟，再加入1 ml格利斯试剂Ⅱ和1ml2％醋酸钠溶液，显色后稀释至刻度。
用分光光度计于520nm处比色。
☆结果计算＠标准曲线以浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。
回归得到方程y=ax+b＠亚硝酸根浓度= ，mg/ml d=稀释倍数1.2.5 细菌浓度测定（1）取0.1ml培养液加到0.9ml生理盐水中，混匀，就得到10－1的菌悬液，再取出0.1ml加到0.9ml生理盐水中，得到10－2的菌悬液，同样方法依次稀释到10－3、10－4的菌悬液，具体情况视菌悬液浓度而定。
（2）将稀释好的菌悬液取0.1ml，与冷却到50℃的琼脂培养基混匀，于24℃培养5天，进行计数。
2 结果2.1 亚硝酸盐浓度测定标准曲线用亚硝酸根标准液，加入格利斯试剂，于752分光光度计上520nm处比色，以亚硝酸根浓度为横坐标，A值为纵坐标，绘制标准曲线。
见图1。
图1亚硝酸盐浓度测定的标准曲线Fig 1 The standard curve of nitrite detection 2.2 硝化细菌的鉴定2.2.1 形态结构鉴定—单染色法经单染色法观察，亚硝化菌为椭圆形球菌，体积较大；硝化菌体积较小。
与文献所述相同。
见图2和图3。
图2 亚硝化菌的形态Fig 2 The morphology of sub-nitrobacteria 图3 硝化菌的形态Fig 3 The morphology of nitrobacteria2.2.2 培养特征将挑选出来的菌落接种到肉汤琼脂培养基上，没有生长，可以认为该菌为自养菌。
（硝化细菌是严格的自养菌不能在肉汤培养基上生长）2.2.3 硝化作用鉴定将亚硝化菌和硝化菌接种到液体培养基中，于24℃培养5天，在亚硝化菌的培养液中加入格利斯试剂，溶液变红可以判断为亚硝化菌；将硝化菌的的培养液取出1ml稀释100倍，加入格利斯试剂，于752分光光度计上比色，看其中的亚硝酸根含量减少，可以断定为硝化菌。
2.3 氨转化作用和硝化作用2.3.1 亚硝化菌的氨转化作用亚硝化菌经过5周的摇瓶培养能使培养液中亚硝酸根的浓度能上升到300 μl/ml以上，说明其具有亚硝化作用。
实验结果见图4。
图4 亚硝化菌的氨转化作用Fig 4 The ammonia conversion of sub-nitrobacteria2.3.2 硝化菌的硝化作用硝化菌经过10天左右的发酵培养可使发酵液中的亚硝酸根浓度下降40％左右。
实验结果见图5。
图5 硝化菌的硝化作用Fig 5 The nitrification of nitrobacteria2.4 硝化细菌的培养2.4.1 发酵培养硝化细菌的pH值变化由于硝化细菌产酸，发酵罐中的pH值一直呈下降的趋势，但是由于酸性环境不利于硝化细菌的硝化作用，所以pH值最好控制在6.0以上。
实验结果见图6。
2.4.2 发酵培养硝化细菌溶氧的变化硝化细菌是一种好氧的自养菌，由于硝化细菌生长速度缓慢，发酵液中的菌浓度一直较低，因此溶氧一直较高，最低时也有68％左右。
在发酵后期随着菌体的自溶，溶氧还有上升的趋势，实验结果见图7。
图6 发酵罐培养硝化细菌的pH值变化曲线Fig 6 The pH curve of nitrobacteria cultivation in fermenter 图7 发酵罐培养硝化细菌的DO值变化曲线Fig 7 The DO curve of nitrobacteria cultivation in fermenter2.4.3 发酵培养硝化细菌的生长曲线该生长曲线由发酵液活菌计数得到，横坐标为发酵时间，纵坐标为含菌量的对数值。
由该生长曲线可以看出硝化细菌和一般的异养菌的不同，硝化细菌的生长较缓慢，其对数生长期要5天左右才能到达，菌浓度也很低。