硝化细菌和反硝化细菌的分离纯化方案(新)
硝化细菌
反硝化细菌 硝酸细菌（又称硝化细菌） 亚硝酸细菌（又称氨氧化菌）
作用
亚硝酸在硝化菌的硝化作用下转变成硝酸后，很容易形成硝酸盐 氨在亚硝化菌作用下转化成亚硝酸。（亚硝酸与一些金属离子结合以后可以形成亚硝酸盐，而亚硝酸盐又可以和胺类物质结合，形成具有强烈致癌作用的亚硝胺。） 将硝态氮或亚硝态氮还原成含氮气体或氮气
关键功能基因 编码亚硝酸盐还原酶的基因
生长
温度 大多数硝化细菌的适宜生长温度为l0—38℃，高于20℃时其活性较高，但超过38℃时硝化作用会消失。当环境温度低于20℃时，氨的转化会受到影响。 大多数硝化细菌的适宜生长温度为l0—38℃，高于20℃时其活性较高，但超过38℃时硝化作用会消失。当环境温度低于20℃时，氨的转化会受到影响。
PH 6．0—8．5 6．0—8．0
氮源 亚硝酸钾（钠） 硫酸铵
营养
类型 化能自养型 化能自养型 化能异养型
与氧气的关系 好氧性细菌 好氧性细菌 兼性厌氧菌
硝化细菌 备注 硝化细菌 亚硝化细菌
富集
培养 取1ml污水水样加入至10ml富集培养基中，28°C振荡培养5d。再取1ml富集培养物加入至新鲜的富集培养基中，如此富集3次。 取1ml污水水样加入至10ml富集培养基中，28°C振荡培养5d。再取1ml富集培养物加入至新鲜的富集培养基中，如此富集5次。 定期观察培养基的透明度，变浑浊后立即进行再次富集。（后期培养过程中可以连续加入5%的亚硝酸钾或硫酸铵数毫升，增加目的菌数，并抑制其他菌的数目）
具体步骤：一次富集取5ml水样至50ml富集培养基中（此过程于150ml锥形瓶中进行）同时做3个平行【共6个150ml锥形瓶】； 二次富集再取1ml一次富集物至50ml富集培养基中（此过程于150ml锥形瓶中进行）【共6个50ml锥形瓶】； 三次富集取1ml一次富集物加入至10ml富集培养基中于50ml锥形瓶中进行【共6个50ml锥形瓶】 (大约需20天完成)【定期涂板检验富集程度，固体富集培养基】
菌种分离纯化 取100微升富集培养液，加入900微升无菌水，依次得到10 1、10
2、10 3、10 4···10
8梯度的菌悬液，另取0.1 mL菌悬液在硝化细菌平板分离固体培养基上涂布，28℃恒温箱中培养10 d，得到单菌落，转接斜面或平板。 取100微升富集培养液，加入900微升无菌水，依次得到10 1、10 2、10 3、10 4···10 8梯度的菌悬液，分别取0.1 mL菌悬液于在亚硝化细菌平板分离固体培养基上涂布，28℃恒温箱中培养10 d，得到单菌落，转接斜面或平板。 目的是得到纯菌株，培养基上的单菌落。（做好拍照，做好实验记录）
具体步骤：一次分离：为节省平板可采用划线分离的方法，用接种环蘸取适量三次富集培养基在平板上划线，各做两个平行，培养一定时间后进行二次分离【需12个平板】； 二次分离：用接种环蘸取单菌落在装有适量无菌水的离心管里稀释，再次划线分离，在分离培养基上进行，为节省平板可以将平板划分为不同区域，每个平板可以分离3个单菌落。 三次分离：挑取形态不同的单菌落在装有1ml富集培养基的离心管中，摇菌，每种挑取三个平行，涂板时根据浓度进行稀释，不同梯度进行； 四、鉴定纯种。挑取单菌落摇菌，做菌液PCR，电泳检测结果，酶切鉴定，用两种酶分别进行单酶切，若每个平板上的酶切结果相同，则初步确定为同一种菌，并去除同一种菌，进行菌种保藏，1ml加300微升甘油于-20℃保存。
选择优势菌 种
硝化细菌相关培养基：
1、富集培养基：
硝化细菌富集培养基： KNO2 0.5g; KH2PO4 0.07g;
MgSO4 7H2O 0.055g; CaCl2 2H2O 0.05g;
蒸馏水100ml; 用5%Na2CO3调pH至8.0.
亚硝化细菌富集培养基： (NH4)2SO4 0.5g; KH2PO4 0.07g;
MgSO4 7H2O 0.055g; CaCl2 2H2O 0.05g;
蒸馏水100ml; 用5%Na2CO3调pH至8.0.
2、分离固体培养基：
硝化细菌平板分离固体培养基： KNO2 0.05 g； K2HPO4 3H2O 0.13 g；
MgSO4 7H2O 0.03 g； NaCl 0.12 g；
FeSO4 7H2O 0.02 g； CaCO3 (MgCO3) 0.1 g；
NaHCO3 0.2 g； H2O 100 mL；
琼脂：1.5—2.0g pH 7.5 ~ 8.0．
亚硝化细菌平板分离固体培养基：(NH4) 2SO4 0.05 g； K2HPO4 3H2O 0.13 g；
MgSO4 7H2O 0.03 g； NaCl 0.12 g；
FeSO4 7H2O 0.02 g； CaCO3 (MgCO3) 0.1 g；
NaHCO3 0.2 g； H2O 100 mL；
琼脂：1.5—2.0g pH 7.5 ~ 8.0．
3 杂菌检验培养基：
（1）检查异养型细菌：
牛肉膏蛋白胨培养基（100ml）： 酵母粉：0.5g 胰蛋白胨：1.0g
氯化钠：1.0g 琼脂：1g
(2) 检查酵母菌：
豆芽汁葡萄糖培养基： 10%豆芽浸汁100ml 葡萄糖5g 琼脂1.5—2.0g
自然PH
(3) 检查霉菌:
马铃薯葡萄糖培养基: 20%马铃薯浸汁100ml 葡萄糖2g 琼脂1.5—2.0g
自然PH
反硝化细菌 备注
富集培养 取污水1ml, 接种于无菌反硝化细菌富集培养液中, 置于28 ℃ 培养箱中静置培养. 培养4~ 5 d 后,
以20%的接种量接入新鲜的富集培养液中, 如此反复3~ 4 次, 直到获得优势种. 培养液变浑浊并产生气泡,说明有反硝化细菌生长.
菌种分离纯化 采用划线分离法，用牙签将菌悬液在反硝化细菌分离培养基上划线，28℃下培养，挑取单菌落，转接至另一平板上。可多次循环。 及时观察，注意拍照记录。
确定单菌落
1、富集培养基：
反硝化细菌富集培养基: KNO3 2 g, 柠檬酸钠5 g, K2HPO4 1 g, MgSO4·7H2O
0.2g, 微量元素 蒸馏水1 000mL, 121 ℃ , 灭菌20
min.
2、反硝化细菌分离培养基： KNO3 2 g, 柠檬酸钠5 g, K2HPO4 1 g, 微量元素
MgSO4·7H2O 0.2g, 蒸馏水1 000mL, 琼脂
121 ℃ , 灭菌20 min.
反硝化细菌为异养型菌，故可以在LB培养基上培养。
硝化细菌的分离和鉴定
硝化细菌的分离和鉴定
黄珏
【期刊名称】《水产科技情报》
【年(卷),期】2004(31)3
【摘 要】水体中的氨氮和亚硝酸盐是水产养殖过程中的产物，对生物体有毒，亚硝酸盐还是强烈的致癌物质。如何降解这两种物质，是水产科技工作者一直所关注的研究课题。硝化细菌是一类具有硝化作用的自养菌，包括硝化菌和亚硝化菌两个生理菌群，其主要特性是生长速率低，具有好氧性、依附性和产酸性等，可通过NH4+·NO2-·NO3-
【总页数】5页(P130-134)
【作 者】黄珏
【作者单位】江苏省兽药监察所,南京市,210036
【正文语种】中 文
【中图分类】S963.211
【相关文献】
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硝化反硝化池流程
硝化反硝化池流程
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硝化反硝化池流程是一种污水处理技术，主要用于去除水中的氮污染物，包括氨氮（NH₄⁺-N）和硝酸盐氮（NO₃⁻-N）。该过程分为两个主要阶段：硝化阶段和反硝化阶段，下面详细介绍这两个阶段的流程： 硝化阶段
硝化和反硝化
硝化作用
nitrification
硝化细菌将氨氧化为硝酸的过程。19世纪以前，人们把硝酸盐看作是化学作用的产物，即空气中的氧和氨经土壤催化形成。1862年L.巴斯德首先指出硝酸盐的形成可能是微生物作用的结果。1877年，德国化学家T.施勒辛和A.明茨用消毒土壤的办法，证实了氨被氧化为硝酸的确是生物学过程。1891年，С.Н.维诺格拉茨基用无机盐培养基成功地获得了硝化细菌的纯培养，最终证实了硝化作用是由两群化能自养细菌进行的。先是亚硝化单胞菌将铵氧化为亚硝酸；然后硝化杆菌再将亚硝酸氧化为硝酸。这两群细菌统称硝化细菌。其作用过程如下：
硝化细菌从铵或亚硝酸的氧化过程中获得能量用以固定二氧化碳，但它们利用能量的效率很低，亚硝酸菌只利用自由能的5～14％； 硝酸细菌也只利用自由能的5～10％。因此,它们在同化二氧化碳时，需要氧化大量的无机氮化合物。
土壤中硝化细菌的数量首先受铵盐含量的影响，一般耕地里，每克土中只有几千至几万个。添加铵盐即可使其数量增至几千万个。土壤中性偏碱，通气良好，水分为田间持水量的50～70％，温度为10～30℃时，最适宜硝化细菌的生长繁殖，铵盐也能迅速被转化为硝酸盐。
自然界中,除自养硝化细菌外,还有些异养细菌、真菌和放线菌能将铵盐氧化成亚硝酸和硝酸，异养微生物对铵的氧化效率远不如自养细菌高，但其耐酸，并对不良环境的抵抗能力较强，所以在自然界的硝化作用过程中，也起着一定的作用。
亚硝化反应
有机化合物分子中的氢被亚硝基(-NO)取代的反应。用亚硝酸做为亚硝化试剂，被强共轭给电子基团活化的苯环，例如酚、某些酚醚、萘酚、三级芳胺，在亚硝酸作用下，可发生亲电取代的亚硝化反应。由于亚硝酸很不稳定，所以亚硝化一般采用亚硝酸盐作为亚硝化剂。在反应中，先将反应物溶于酸(如盐酸、稀硫酸、醋酸)中，再将亚硝酸钠的水溶液逐滴加入到反应物中，使生成的亚硝酸立即与反应物作用。二级脂肪族胺和二级芳香族胺与亚硝酸反应，生成N-亚硝基二级胺。可用还原剂将亚硝基除掉，得回原来的二级胺。利用此性质，可以提纯二级胺。一级胺在此反应条件下则发生重氮化反应。
sbr 硝化和反硝化 反应原理
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好氧反硝化细菌培养基配制知识分享
好氧反硝化细菌培养基配制 精品文档
收集于网络，如有侵权请联系管理员删除 好氧反硝化细菌培养基配制以及实验方法
一、好氧反硝化培养基（液体）醋酸钠/ 0.5 g ; KNO3 / 0.1 g ; K2HPO4 / 0.01
g ;MgCl2/ 0. 02 g ;CaCl2/ 0. 01g ; H2O/ 1 000 ml ;p H 7～7. 5.
好氧反硝化培养基（固体）醋酸钠/ 0.5g ; KNO3/ 0.05g ; Na2HPO4 .
7H2O/ 0. 5 g ;NaNO2/0.01g;MgSO4 ·7H2O/ 0. 1 g ;琼脂18 g ;p H 7～7. 5.
富集分离：取样品泥样置于上述液体培养基中，经过每天24小时曝气富集10天。之后，取1毫升底泥与10毫升去离子水混合，之后进行107倍稀释，在上述固体培养基上进行平板划线分离。
细菌初筛：将分离得到的细菌接种到上述液体培养基中，然后在30摄氏度环境下进行24小时的摇瓶培养，用紫外分光光度法检测硝态氮含量，重复2次，取降低最多的样品继续进行平板划线，再重复上述操作，得到单一菌落。（验证所得菌落是否单一：将所得菌落接种在牛肉膏蛋白胨培养基上，进行无菌培养，检测菌落是否单一。）
细菌复筛：将初筛得到的单一菌落，进行实际污水测试，测试其实际降解硝态氮的能力。
二、BTB 初筛培养基：琼脂20 g、KNO3 1 g、
KH2PO41 g、FeCl2·6H2O 0.5 g、CaCl2·7H2O 0.2 g、
MgSO4·7H2O 1 g、琥珀酸钠8.5 g、溴百里酚蓝
(BTB)(1%乙醇溶液)1 mL，用1 mol/L 的NaOH 调节
pH 至7.0～7.3，121 ℃灭菌20 min
LB 液体培养基(/L)：KNO3 1 g、KH2PO41 g、
FeCl2·6H2O 0.05 g、CaCl2·7H2O 0.02 g、MgSO4·
污水深度处理的硝化与反硝化
污水深度处理的硝化与反硝化
一 。硝化
(1) 微生物：自营养型亚硝酸菌(Nitrosmohas)
自营养型硝酸菌 （Nitrobacter）
(2) 反应： 城市污水中的氮化物主要是NH3,硝化菌的作用是将NH3—N氧化为
NO3—N
NH+4+1.5O2———NO2+H2O+H+－ΔE
亚硝酸菌 ΔE=278.42kJ
NO2+0.5O2———NO-3－ΔE
硝酸菌 ΔE=278.42kJ
NH+4+2.0O2——— NO-3+H2+2H+－ΔE
硝酸菌 ΔE=351kJ
研究表明,硝化反应速率主要取决于氨氮转化为亚硝酸盐的反应速率。
硝酸菌的细胞组织表示为C5H7NO2
55NH+4+76O2+109HCO-3———C5H7NO2+54NO-2+57H2O+104H2Co3
亚硝酸菌
400 NO2+ NH+4+4 H2Co3+ HCO-3+195 O2 ——— C5H7NO2+3 H2O+400 NO-3
硝酸菌
NH+4+1.86 O2+1.98HCO-3——— 0.02C5H7NO2+1.04H2O+0.98 NO-3+1.88H2Co3
硝酸菌
(3) 保证硝化反应正常进行的必要条件：
pH 8~9
水温 亚硝酸菌反应最佳温度 t=35 0C t>15 0C
DO 2 ~ 3 mg / L > 1.0 mg / L
硝化1克NH3—N：消耗4。57克O2
消耗7。14克碱度（擦CaCo3计）
生成0。17克硝酸菌细胞
一株好氧反硝化细菌的分离鉴定及反硝化能力初测
一株好氧反硝化细菌的分离鉴定及反硝化能力初测
战海;王广军;陈成勋
【摘 要】采用BTB(溴甲基酚蓝)平板涂布分离法,从鳜鱼养殖池塘水体中分离出17株具有反硝化作用的细菌,通过初步筛选和反硝化能力的测定,挑选出一株具有较强反硝化能力的好氧反硝化细菌,命名为8F-3.菌株8F-3在24 h内将总氮从100.00
mg/L降至6.51 mg/L,去除率达到93.49%;将氨氮从50.000 mg/L降至1.966
mg/L,去除率为96.07%;将硝酸盐氮从50.00 mg/L降至3.51 mg/L,去除率为92.98%;将亚硝酸盐氮从0.096 mg/L降至0.071 mg/L,去除率为25.79%.该试验结果表明,菌株8F-3对氨氮和硝酸盐氮具有较强的去除能力,对亚硝酸盐氮也有一定去除作用,反硝化能力较强.经生理生化测试和16 S rRNA分子鉴定,初步鉴定该菌属于不动杆菌属(Acinetobacter).
【期刊名称】《天津农学院学报》
【年(卷),期】2017(024)002
【总页数】5页(P44-48)
【关键词】好氧反硝化菌;反硝化能力;16SrRNA;不动杆菌属
【作 者】战海;王广军;陈成勋
【作者单位】中国水产科学研究院珠江水产研究所,广州 510380;天津农学院水产学院,天津 300384;中国水产科学研究院珠江水产研究所,广州 510380;天津农学院水产学院,天津 300384
【正文语种】中 文 【中图分类】S917.1
近年来，我国水产养殖业发展迅速，水产品总产量稳居世界第一。但目前多采取高密度集约化养殖模式，由此引发的水体富营养化等问题日益严重。养殖过程中过量的饲料残渣和排泄物是引发该问题的主要因素，因残饵和排泄物分解后导致水体中氨氮、亚硝酸盐等含量过高[1]，这不仅直接危害养殖动物，还会诱发细菌、病毒病的暴发，给水产养殖造成巨大的经济损失[2]。因此，寻找高效去除养殖水体中氨氮、亚硝酸盐等的方法迫在眉睫。
硝化与反硝化去除氨氮的原理
硝化与反硝化去除氨氮操作
一、硝化与反硝化的作用机理：
1、硝化细菌包含亚硝化菌和硝化菌，亚硝化菌将废水中的 NH3 转变为亚
硝酸盐，硝化菌将亚硝酸盐转变为硝酸盐，称为硝化作用。硝化作用一定经过
这两类菌的共同作用才能达成。
2、反硝化菌将硝酸盐转变为 N2、NO 、N2O，称为反硝化作用。
3、硝化细菌一定在好氧条件下作用。
4、反硝化菌一定在无氧或缺氧的条件下进行。
二、作用方程式：
硝化反响：
2NH3＋3O2―― （亚硝化菌） ―― 2HNO2＋2H2O＋能量（氨的氧化）
2HNO 2＋O2―― （硝化菌） ―― 2HNO3＋能量（亚硝酸的氧化）
反硝化反响：
3— —— —
NO +CH 3 OH 2O+ OH（以甲醇作为 C源）
N2 + CO 2+H 三、操作：
1、将购置的硝化菌投加到曝气池 5、6#，亚硝化菌投加到曝气池 1、2、
3、4#，反硝化菌投加到厌氧池。
2、控制指标：
生物硝化
① PH值：控制在 7.5 —8.4
② 温度： 25—30℃
③ 溶氧： 2—4mg/L
④ 污泥逗留时间：一定大于硝化菌的最小世代时间，一般应大于 2 小时
生物反硝化：
①PH值：控制在 7.0 —8.0
②温度： 25—30℃
③溶氧： 0.5mg/L
④有机碳源： BOD5/TN＞（ 3—5）过低需补加碳源
硝化反应和反硝化反应
一、硝化反应
在好氧条件下，通过亚硝酸盐菌和硝酸盐菌的作用，将氨氮氧化成亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的过程，称为生物硝化作用。
硝化反应包括亚硝化和硝化两个步骤:
NH4++1.5O2
NO2-+H2O+2H+
NO2-+0.5O2 NO3-
硝化反应总方程式：
NH3+1.86O2+1.98HCO3- 0.02C5H7NO2+1.04H2O+0.98NO3--+1.88H2CO3
若不考虑硝化过程硝化菌的增殖，其反应式可简化为
NH4++2O2 NO3-+H2O+2H+
从以上反应可知:
1) 1gNH4+-N氧化为NO3- 需要消耗2*50/14=7.14g碱（以CaCO3计)
2) 将1gNH4+-N氧化为NO2--N需要3.43gO2,氧化1gNO2--N需要1.14gO2，所以氧化1gNH4+-N需要4.57gO2。
硝化细菌所需的环境条件主要包括以下几方面：
a. DO：DO应保持在2-3mg/L。当溶解氧的浓度低于0.5mg/L时，硝化反应过程将受到限制。
b. PH和碱度：PH7.0-8.0，其中亚硝化菌6.0-7.5，硝化菌7.0-8.5。最适合PH为8.0-8.4。碱度维持在70mg/L以上。碱度不够时，应补充碱
c. 温度：亚硝酸菌最佳生长温度为35℃，硝酸菌的最佳生长温度为35～42℃。15℃以下时，硝化反应速度急剧下降；5℃时完全停止。
d. 污泥龄：硝化菌的增殖速度很小，其最大比生长速率为 0.3～0.5d-1(温度20℃，pH8.0～8.4)。为了维持池内一定量的硝化菌群，污泥停留时间必须大于硝化菌的最小世代时间 。对于实际应用中，活性污泥法脱氮，污泥龄一般11～23d。
e. 污泥负荷：负荷不应过高，负荷宜0.05-0.15kgBOD/(kgMLSS·d)。因为硝化菌是自养菌，有机物浓度高，将使异养菌成为优势菌种。总氮负荷应≤0.35kgTN/(m3硝化段·d)，当负荷>0.43kg/(m3硝化段·d)时，硝化效率急剧下降。
污水处理—硝化与反硝化
污水处理—硝化与反硝化
反硝化反应过程：在缺氧条件下，硝酸盐被反硝化细菌还原成为氮气和氧气。反硝化细菌利用硝酸盐作为电子受体，有机物或者无机物作为电子供体，从而获得能量。反硝化反应过程需要在缺氧（n）条件下进行，其相应的反应式为：
1.反硝化反应方程式：C5H7O2N+5H2O+4NO3-→5NO2-+CO2+7H2O
2.反硝化过程总反应式：C5H7O2N+2.5NO3-+3.5H2O→0.5N2+CO2+5H2O
通过上述反应过程的物料衡算可知，在反硝化反应过程中，将1克硝酸盐氮还原为氮气需缺氧2.86克，同时产生0.57克有机物或无机物作为电子供体。在反硝化反应过程中，氮元素的转化经历了以下几个过程：硝酸盐NO3-→亚硝酸盐NO2-→一氧化氮NO→氮气N2.
三、硝化反硝化反应过程
硝化反硝化反应过程：硝化反应和反硝化反应是一个连续的过程，需要在好氧条件下进行硝化反应，然后在缺氧条件下进行反硝化反应。硝化反应将氨氮转化为硝酸盐氮，反硝化反应将硝酸盐氮还原为氮气。硝化反硝化反应过程是一种高效的污水微生物脱氮方法，可以有效地去除污水中的氮元素。
四、污水硝化反硝化脱氮处理技术的应用
污水硝化反硝化脱氮处理技术是一种成熟的污水处理方法，已经被广泛应用于城市污水处理厂和工业污水处理厂中。该技术可以有效地去除污水中的氮元素，降低氮污染物排放，保护水环境。同时，该技术具有工艺简单、运行成本低等优点，适用于不同规模的污水处理厂。
好氧池是指充氧池，其溶解氧浓度一般不小于2mg/L。其主要功能是降解有机物和进行硝化反应。
当除磷为主要目标时，应采用厌氧/好氧工艺。其基本工艺流程如下：
当除氮为主要目标时，宜采用缺氧/好氧工艺。其基本工艺流程如下：
如果需要同时脱氮除磷，则应采用厌氧/缺氧/好氧（A/A/O）工艺。在厌氧条件下，VFA（挥发性脂肪酸）、PHA（聚羟基脂肪酸）、PO（磷酸盐）和PP（多聚磷酸盐）可以被PAOs吸收和转化为PHA。在这个过程中，PP高能键断裂并释放能量，同时释放磷酸盐，导致磷酸盐浓度升高。这恰好有利于PAOs的生长和繁殖。在好氧条件下，与厌氧条件相反，PAOs吸收Po并形成PP，PHA则成为能源。如同厌氧过程所述，PP是吸收PO所需的能量物质，也为下一次代谢周期做准备。同时，PAOs分裂生成新的细胞。但是，由于PO含量降低，将会限制其生存和繁殖。因此，必须通过人为过程使PO含量升高，完成一个完整的生命周期。如果不进行循环，聚磷菌是无法完成完整的生命周期的。