MPN法测定氨化细菌、硝化细菌和反硝化细菌
MPN法测定氨化细菌、硝化细菌和反硝化细菌
MPN多管发酵法测定氨化细菌、硝化细菌和反硝化细菌1实验原理最大可能数(或最大或然数法，most probable number，MPN)计数又称稀释培养计数（具体参见《土壤与环境微生物研究法》，科学出版社，2009），适用于测定在一个混杂的微生物群落中但却具有特殊生理功能的微生物类群。
本方法是基于选择适当稀释倍数的悬液，接种在特定的液体培养基中培养，检查培养基中是否有该生理类群微生物的生长。
根据不同稀释度接种管的生长情况，用统计学方法求出该生理类群的微生物数量。
特点：利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。
MPN法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量，缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果较粗放，只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用。
氨化作用是异养细菌将蛋白质水解为氨基酸，进而脱氨基产生氨的过程。
硝化作用是指氨经过微生物的作用氧化成亚硝酸和硝酸的过程。
第一阶段由亚硝酸菌氧化氨为亚硝酸；第二阶段由硝酸菌氧化亚硝酸为硝酸。
这两类细菌都是自养的好氧细菌，生长缓慢，培养时间长。
反硝化作用是一类异养细菌在无氧条件下，利用有机物为电子供体，以硝酸盐为呼吸作用的电子受体，将其还原为N2O、N2的过程。
2实验材料2.1样品（1）固体样品（土样或沉积物等）：取一定质量的样品（1g或10g），装入盛有100ml无菌水的三角瓶中，置于摇床上振荡30min，制成均匀悬浊液。
然后用10倍梯度稀释法将悬浊液稀释成一系列梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等，具体视样品而定，微生物丰富的样品稀释的梯度相应大一些）。
（2）液体样品：取一定体积的样品（10ml），装入盛有90ml无菌水的三角瓶中，充分混匀，制成10-1稀释样。
微生物污染控制工程
微生物污染控制工程PCR技术：一种体外扩增核酸序列从而得到多个核酸拷贝的技术。
FISH：放射性原位杂交的方法。
土壤中的微生物的作用？答：①分解动植物尸体为简单的有机物。
②固定大气中的氮供植物使用。
③维持自然界的碳循环。
证明核酸是遗传物质的三个经典实验：①肺炎双球菌的转化实验。
②噬菌体感染实验。
③病毒的拆开与重建实验Hershey和chase（1952）用跟踪同位素法证明了上述。
磷酸+脱氧核糖+碱基=脱氧核苷酸微生物的变异包括突变和基因重组。
F因子：又称为致育因子，是一种质粒，为环状DNA，它可以决定细菌的性别。
诱变育种：利用物理、化学等因素，诱发基因突变，并从中筛选出具有某一优良性状的突变体。
基因工程：用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入更易生长、繁殖的受体细胞中，从而获得新物种的一种崭新的技术。
协同氧化作用，又称共代谢作用，是指微生物在有它可利用的唯一碳源存在时，对原来不能利用的物质也能分解代谢的现象。
合成洗涤剂的主要成分为表面活性剂，根据表面活性剂在水中的电离性状分为：阴离子型，阳离子型，非离子型和两性电解质四大类。
通常的曝气方式有鼓风曝气，表面加速曝气和射流曝气。
废水中的产荚膜细菌可分泌出粘性物质，并相互连接形成菌胶团。
废水的生物学处理系统是通过人工控制的微小生态系统，在这个生态系统中，微生物对有机物转换效率之高是任何天然的生态系统所不可比拟的。
与好氧生物处理方法相比，厌氧法处理废水的有点：①厌氧法处理废水可直接处理高浓度有机废水，耗能少，运行费用低。
②污泥产率低。
采用好氧法处理废水，微生物繁殖速度快，剩余污泥生成率高。
③需要附加的营养物少。
④厌氧处理废水可以回收沼气。
原生动物营养方式：动物性营养，植物性营养，腐生性营养，寄生性营养。
细胞壁基本结构（不变结构）原生质体：细胞膜，细胞质及核质细菌的结构可分为特殊结构：荚膜、鞭毛、芽孢（可变结构）菌丝分有隔菌丝和无隔菌丝。
稀释培养测数法
稀释培养测数法（MPN）一、实验目的通过对好气性自生固氮菌的计数，了解稀释培养计数（MPN）的原理和方法。
二、实验原理 &n一、实验目的通过对好气性自生固氮菌的计数，了解稀释培养计数（MPN）的原理和方法。
二、实验原理最大或然数(most probable number，MPN)计数又称稀释培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。
其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。
本法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等。
见附表23-1）的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量，缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果也较粗放，只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用。
MPN计数是将待测样品作一系列稀释，一直稀释到将少量（如lm1）的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖。
根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度，采用“最大或然数”理论，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。
具体地说，菌液经多次10倍稀释后，一定量菌液中细菌可以极少或无菌，然后每个稀释度取3—5次重复接种于适宜的液体培养基中。
培养后，将有菌液生长的最后3个稀释度（即临界级数）中出现细菌生长的管数作为数量指标，由最大或然数表（见附录九）上查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液中的含菌数。
如某一细菌在稀释法中的生长情况如下；稀释度 lO-3 10-4 10-5 lO-6 10-7 10-8重复数 5 5 5 5 5 5出现生长的管数 5 5 5 4 1 0根据以上结果，在接种lO-3—10-5稀释液的试管中5个重复都有生长，在接种lO-6稀释液的试管中有4个重复生长，在接种10-7稀释液的试管中只有1个生长，而接种10-8稀释液的试管全无生长。
伊乐藻_固定化氮循环菌技术入湖河道修复研究_王易超
中国环境科学 2012,32(3)：510~516 China Environmental Science 伊乐藻-固定化氮循环菌技术入湖河道修复研究王易超,李正魁*,周莉,范念文,冯露露(南京大学环境学院,污染控制与资源化研究国家重点实验室,江苏南京 210046)摘要：从太湖金墅湾水体筛选出包括土著氨化、亚硝化、硝化和反硝化细菌的氮循环菌,固定于多孔性载体内,对伊乐藻-固定化氮循环菌联用技术在秋冬季太湖金墅湾水源地入湖河道水体生态修复效果进行了研究.经室内生态修复模拟与原位围隔实验表明,伊乐藻-固定化氮循环菌联用对水质改善效果要优于单独使用伊乐藻或固定化氮循环菌,该技术对原位入湖河道有效去除率为:总氮 5.9%~61.2%,氨氮12.4~70.3%,硝氮6.1%~68.0%,COD 4.2%~78.5%;通过氮循环菌释放可明显提高水体氮循环菌数量,MPN值比对照水体高出3~4个数量级;相关性分析表明,差异性显著(P<0.01).经5个月原位围隔试验表明,伊乐藻-氮循环菌联用技术可有效降低秋冬季入湖河道营养盐负荷,有助于控制湖泊水源地富营养化.关键词：富营养化；入湖河道；伊乐藻-固定化氮循环菌联用；生态修复；MPN中图分类号：X703.5 文献标识码：A 文章编号：1000-6923(2012)03-0516-07Study of Elodea nuttallii-immobilized nitrogen cycling bacteria restoration in an inflow river channel of water source, Taihu Lake. WANG Yi-chao, LI Zheng-kui*, ZHOU Li, FAN Nian-wen, FENG Lu-lu (State Key Laboratory of Pollutant Control and Resources Reuse, School of Environment, Nanjing University, Nanjing 210046, China). China Environmental Science, 2012,32(3)：510~516Abstract：Nitrogen cycling bacteria, including ammonifying bacteria, nitrobacteria, nitrosobacteria and denitrifying bacteria were screened and immobilized to the porous carries from nature water of Jinshu Bay, Taihu Lake. The restoration effect of Elodea nuttallii-Immobilized Nitrogen Cycling Bacteria (INCB) assemblage technology applied in one of the inflow river channels of Jinshu bay water source, Taihu Lake was studied in autumn and winter. Lab ecological restoration simulation and in situ enclosure experiment demonstrated that Elodea nuttallii-INCB assemblage technology has better water quality improvement ability than either use INCB or Elodea nuttallii separately. We applied this technology in the inflow river channel water restoration and TN concentration reduced 5.9%~61.2%, NO3- concentration reduced 6.1%~68.0% and COD concentration reduced 4.2%~78.5% during the experiment process. The result also showed nitrogen bacteria quantities increased significantly after releasing INCB, and the MPN values of denitrifying bacteria in the enclosure was 3~4 order of magnitudes higher than the comparison water. There is significant difference between them (P<0.01). In situ enclosure experiment lasted for five months showed Elodea nuttallii-INCB assemblage technique can efficiently decrease inflow river nutrient loading and is helpful in water source eutrophication control in autumn and winter.Key words：eutrophication；inflow river；Elodea nuttallii-INCB assemblage；restoration；MPN太湖金墅湾水源地位于太湖东北部贡湖地区,是苏州市与高新区自来水供应最重要的水源地之一.近年来,由于流域内人类活动的影响及不合理开发利用,贡湖水生态系统遭到破坏,氮磷引起的水体富营养化程度加剧,蓝藻频发,直接威胁到水源地饮水安全,严重制约流域经济建设和社会发展.金墅湾水源地周边河网密布,主要入湖河道有位于取水口北侧的金墅港、田鸡港,以及位于南侧的龙塘港等.水源地入湖河道流域污染源主要包括外部河道来水污染、保护区大气干湿沉降,保护区内工农业污染、居民生活污水排放、畜收稿日期：2011-07-04基金项目：江苏省自然科学基金资助项目(BK2010056);国家水体污染控制与治理科技重大专项(2008ZX07101-012,2008 ZX07101-004) * 责任作者, 教授, zhkuili@3期 王易超等：伊乐藻-固定化氮循环菌技术入湖河道修复研究 511禽及水产养殖废水等[1].因此,控制金墅湾水源地入湖河道污染,改善河道水体水质,对于水源地水质保护具有重要意义.各国学者对利用沉水植物吸收水体氮磷,控制水体富营养化进行了广泛的研究[2-3],目前对于湖泊生态修复的研究热点主要集中在水生植物对营养盐控制方面[4-5].另外,单独利用固定化氮循环菌技术(INCB)进行土著脱氮微生物分离、筛选及去除湖泊过量氮素的应用研究已有相关报道[6-7],单独使用沉水植物改善富营养化水体水质也已有较多研究[8-11],而利用两者联合作用控制入湖河道富营养化的研究尚不多见.常规水生植物净化水质方法对秋冬季水质净化效果往往表现不佳,本研究针对太湖金墅湾水源地主要入湖河道在秋冬季节氮磷污染较严重、河道水体风浪小、一般水生植物逐渐死亡的特点,选择秋冬季生长良好的伊乐藻种(Elodea nuttallii ),采用伊乐藻-固定化氮循环菌联用技术,在室内生态修复模拟实验的基础上,搭建河道原位围隔,进行入湖河道水体生态修复应用研究,通过释放土著氮循环细菌提高水体氮素转化效率,结合伊乐藻吸收水体营养盐,控制入湖河道水体富营养化.同时分析了伊乐藻-固定化氮循环菌联用与河道水体水质改善之间的关系,初步探讨了各因素对水体脱氮的影响机理,以期为水源地入湖河道水体富营养化治理提供有效方案.1 材料与方法1.1 研究区域概况研究区域位于太湖东北部金墅湾水源地主要入湖河道田鸡港与金墅港之间的支流南泾河内(图1),河流污染主要来自沿岸居民生活用水排放、农业及水产养殖废水排放等,受污染水体最终流入贡湖,给区域内水源地水质保护造成较大威胁.2009年11月~2010年3月监测资料显示,南泾河TN 1.24~8.13mg/L 、NO 3- 0.19~5.49mg/L 、NH 4+ 0.043~1.76mg/L 、NO 2- 0.016~0.13mg/L 、TP 0.081~0.38mg/L 、PO 43-0.022~0.27mg/L 、COD 4.49~51.21mg/L,水体透明度0.6~1.3m.南泾河秋冬季水质变化较大,并受气象、人类活动等因素综合影响,富营养化趋势明显.图1 太湖金墅湾水源地入湖河道试验地点 Fig.1 Location of inflow river experiment site in Jinshubay, Taihu Lake1.2 脱氮菌种采集、分离与筛选采集太湖金墅湾水源地水样、沉水植物及底泥中微生物样品,接种至选择性培养基上,富集筛选出纯化的太湖金墅湾土著氨化、硝化、亚硝化以及反硝化细菌.1.3 载体制备及氮循环菌固定化将亲水性玻璃态单体甲基丙烯酸-β-羟乙酯(HEMA)、丙烯酸羟乙酯(HEA)与蒸馏水按特定体积比均匀混合,并用氮气饱和,采用60Co -γ射线(辐射剂量1×104Gy),在-78℃温度条件下辐照制备形成生物相容性固定化聚合物载体[6].将辐射聚合后载体切成 5mm 立方小块,用蒸馏水浸泡至充分膨胀,然后加入4种氮循环菌培养基培养.培养基充分进入膨胀后载体内部之后,投加经活化后进入对数生长期的氨化、硝化、亚硝化和反硝化细菌各200mL,利用曝气设备在28℃下按照16h 曝气搅动,8h 静置的模式连续培养,使氮循环菌在有氧和厌氧的交替条件下吸附于固定化载体表面,并通过增殖进入多孔载体内部实现固定化.1.4 室内-原位实验设计1.4.1 室内实验 共设4组试验柱,进行模拟生态修复对比:A 柱为裸泥对照样,B 柱为固定化氮循环菌,C 柱为伊乐藻,D 柱为伊乐藻-固定化氮循环菌联用. 2009年8月中旬在南泾河用有机玻璃柱状512 中国环境科学 32卷采样器(内径9cm,长60cm)采集4根未扰动柱样,柱样泥深15cm左右,柱内保留部分上覆水,两端用橡皮塞密封后,尽量保证垂直无扰动,同步采集50L上覆水及一定量伊乐藻,一起运回实验室,小心将泥柱分别移入相同尺寸的有机玻璃生态修复模拟柱内. 对4根柱样分别进行不同处理:A 柱作为对照样不做任何处理,B柱利用柔性网孔材料包覆的方法添加固定化氮循环菌,C柱采用扦插法种植5株10cm长的长势茁壮的伊乐藻,D 柱采用相同方法同时添加固定化氮循环菌及种植伊乐藻.处理完之后,采用虹吸法将采集的原位河道水注满各试验柱,进行预培养,试验柱内氮循环菌载体与水每周更换1次.14d以后试验柱生态系统趋于稳定,再次更换载体,并用新采集的河道上覆水替换柱内水,稳定24h后,测定水体各理化指标,分别考察固定化氮循环菌、伊乐藻、伊乐藻-固定化氮循环菌联用对水源地入湖河道水质改善效果.1.4.2原位河道实验采用围隔,围隔主体采用防水布料,尺寸为3m×2m.顶部用高强度泡沫材料制成浮体,底部采用沙袋作为配重物,各结合处用扁铁、螺丝、加强带连接.原位围隔在南泾河道进行安装.通过桩绳牵引固定确保围隔隔离效果,减少外来水流风浪等因素对围隔内部实验效果的影响.搭建完成后,在围隔内种植伊乐藻,同时利用网兜包覆固定化载体的方式投加氮循环菌,新鲜固定化载体湿重为(50±1)g/包,每周更换1次.对河道围隔内外水质参数进行监测,考察伊乐藻-固定化氮循环菌联用技术对水源地入湖河道水质净化效果.1.5反硝化菌数量围隔内外水体中反硝化菌数量测定采用MPN法[12-13],采用Giltay培养基培养.调节培养基pH值为7.0~7.2,灭菌处理后加入试管中,采用三管法进行反硝化菌计数.以无菌操作法,对每个水样做10倍系列稀释,每支试管中接种水样 1 mL.在25℃恒温培养箱内培养14d后,培养基变蓝的试管视作阳性管[14],对照MPN表读数[15]. 1.6水质测定仪器设备日本岛津UV-2450紫外可见分光光度计,便携式YSI pH计pH100,便携式YSI溶氧仪550A,温度计.1.7水质指标及测定方法正磷酸盐:钼锑抗分光光度法;氨氮:纳氏试剂分光光度法;硝态氮:麝香-草酚分光光度法;亚硝酸盐氮:N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法;总氮:过硫酸钾氧化、紫外分光光度法;pH:便携式pH 计;DO:便携式溶氧仪;COD cr :重铬酸钾法.1.8数据分析本研究中数据归纳和图表分析采用Excel或Origin7.5进行,数据统计分析采用SPSS13.0.2结果与讨论2.1室内试验柱模拟生态修复效果对比2.1.1氮素营养盐水平变化室内试验在2009年9月进行,试验容器采用生态修复模拟柱,7:00~17:00每隔2h取试验柱水样,分别测定4个试验柱内总氮、氨氮、硝氮、亚硝氮、DO、ORP及pH值等参数(图2~图7).结果表明,与其他试验柱相比,当伊乐藻-固定化氮循环菌联用时,水体总氮和硝氮的去除率分别达到最高的65.2%与78.3%,说明伊乐藻-INCB联用对水体氮素的脱除效果最好,硝氮变化规律与总氮一致(r=0.991, P<0.01).而氨氮去除率为5.3%,添加氮循环菌的B柱与D柱中,氨氮浓度呈先增后减之趋势,未添加氮循环菌的试验柱则未见该现象(图6),这可能是由于投放氮循环菌后,水体氨氮浓度先由氨化细菌的矿化作用而增高,随后又经硝化细菌转化而降低造成的.从图5看到,投放固定化氮循环菌的柱体内亚硝氮浓度明显高于未投放的柱体(ANOV A,P<0.001),说明作为水体微生物脱氮过程的中间体之一,亚硝氮浓度由于氮循环菌作用呈暂时性累积.2.1.2pH值与DO变化从图6可见看出,试验过程中4个试验柱水体的pH值均有不同程度升高,添加伊乐藻的C、D两柱的pH值分别高达9.26和9.92,而未添加植物的柱体pH值均在8.5以下.有研究指出沉水植物会分泌有机酸而导致水体pH值下降[16],但另一方面,沉水植物在昼间3期 王易超等：伊乐藻-固定化氮循环菌技术入湖河道修复研究 513光照条件下,会因其强烈的光合作用消耗水中的 CO 2,导致水体pH 值的增加.结果表明,本试验伊乐藻提高水体pH 值的作用占据主导.添加伊乐藻的C 、D 试验柱DO 均达到11mg/L 以上,证实水体在沉水植物的强烈光合作用下,溶解氧往往呈明显过饱和现象,与Cheng 等[17]的研究结果相同;裸泥柱样DO 无明显变化,而仅投放INCB 的试验柱由于氮循环菌生命代谢耗氧,10h 内水体DO 从初始值8.86mg/L 缓慢减至8.21mg/L.通过Pearson 相关性分析发现,含伊乐藻的试验柱内总氮浓度与DO 呈负相关(P <0.01, r =-0.897).随着水体DO 的升高,水体硝化速率可能会进一步增大,从而有更多来自上覆水中的硝氮进入底泥中反硝化区,促进非耦合反硝化作用.0 2 46810总氮浓度(m g /L )时间(h)图2 试验柱总氮变化趋势Fig.2Variation of TN concentration in the experiment tubes硝态氮浓度(m g /L )时间(h)图3 试验柱硝态氮变化趋势Fig.3 Variation of NO 3- concentration in the experiment tubs246 8 100.0000.0050.0100.0150.0200.0250.0300.0350.0400.0450.0500.055亚硝氮浓度(m g /L )时间(h)图4 试验柱亚硝氮变化趋势Fig.4 Variation of NO 2- concentration in the experimenttubes2468100.300.350.400.450.500.550.600.650.70氨氮浓度(m g /L )时间(h)图5 试验柱氨氮变化趋势Fig.5 Variation of NH 4+ concentration in the experimenttubes2468107.07.58.08.59.09.510.010.5试验柱水体p H 值时间(h)图6 试验柱pH 值变化趋势Fig.6 Variation of pH in the experiment tubes514中 国 环 境 科 学 32卷0 2 46810溶解氧浓度(m g /L )时间(h)图7 试验柱溶解氧变化趋势Fig.7 Variation of DO in the experiment tubes2.2 入湖河道原位围隔实验2.2.1 围隔内外水质生态修复效果对比 在室内实验基础上,原位实验于2009年11月~2010年3月连续进行,分别监测围隔内伊乐藻-固定化氮循环菌联用与围隔外河道水体的氮、磷、反硝化菌数量、COD 等数据.结果表明,围隔内伊乐藻、固定化氮循环菌联用时,对总氮有效去除率为 5.9%~61.2%、硝态氮 6.1%~68.0%,氨氮12.4%~70.3%,总磷9.3%~71.1%, COD 4.2%~ 78.5% (图8~图12).实验期间硝态氮变化趋势与总氮基本一致(r =0.671, P <0.01),河道水体硝态氮含量占总氮含量为 40.2%~92.7%,平均值为61.8%.由于总氮主要以硝酸盐氮形式存在,因此水体硝氮去除率的高低直接关系到水体营养盐净化总体效果,本实验利用固定化载体负载氮循环细菌,一方面由于载体具有良好的微孔结构,为氮循环菌提供了好氧-厌氧的微生态环境[18],有利于发生耦合硝化-反硝化脱氮作用,提高水体总氮去除能力;另一方面负载的反硝化细菌扩散至水体与伊乐藻根部,参与反硝化过程,减少硝酸盐氮积累;再一方面伊乐藻除了为底泥中微生物提供有机质外,还可通过匍匐茎向底泥释氧,在植物根区土壤形成好氧-厌氧环境,扩大氮循环菌分布空间,促进底泥脱氮细菌反硝化作用[19-20].与室内实验相比,围隔实验水质净化效果有所降低,而且随着时间变化,围隔水质与去除率波动剧烈,这主要是由于实验室与原位实验条件存在较大差异所造成的,入湖河道流域流量变化、风浪作用、污染物排放以及沉水植物和微生物活性随气温的变化等因素都会给围隔试验的稳定性带来不同程度的影响.2009-11-062009-11-132009-11-202009-11-272009-12-082009-12-112009-12-182009-12-242009-12-312010-01-082010-01-152010-01-262010-02-052010-02-122010-03-062010-03-132468总氮浓度(m g /L )日期图8 河道围隔内外总氮对比Fig.8 Variation of TN concentration in the enclosure andsurrounding river water2009-11-062009-11-132009-11-202009-11-272009-12-082009-12-112009-12-182009-12-242009-12-312010-01-082010-01-152010-01-262010-02-052010-02-122010-03-062010-03-1312345硝态氮浓度(m g /L )日期图9 河道围隔内外硝态氮对比Fig.9 Variation of NO 3-concentration in the enclosure andsurrounding river water2.2.2 围隔内外反硝化细菌数量 固定化氮循环细菌技术采用的多孔性载体具有良好生物相容性,载体内部富集的四种菌可对氮素进行形态转化,同时可向围隔水体释放,维持较高微生物数3期 王易超等：伊乐藻-固定化氮循环菌技术入湖河道修复研究 515量,强化水体氮素营养盐的脱除能力.2009-11-062009-11-132009-11-202009-11-272009-12-082009-12-112009-12-182009-12-242009-12-312010-01-082010-01-152010-01-262010-02-052010-02-122010-03-062010-03-13氨氮浓度(m g /L )日期图10 河道围隔内外氨氮对比Fig.10 Variation of NH 4+concentration in the enclosureand surrounding river water2009-11-062009-11-132009-11-202009-11-272009-12-082009-12-112009-12-182009-12-242009-12-312010-01-082010-01-152010-01-262010-02-052010-02-122010-03-062010-03-13总磷浓度(m g /L )日期图11 河道围隔内外总磷对比Fig.11 Variation of TP concentration in the enclosure andsurrounding river water围隔实验开始后1周,采用MPN 法对水体中的反硝化菌数量进行定期检测,取样期间水温变化范围2.9~10.6.℃结果表明,围隔内投放载体后,水体中反硝化细菌迅速增加,其数量在第2周达到最大值1.1×107cells/L.整个试验过程中,围隔内伊乐藻-氮循环菌联用时,水体反硝化菌数量比围隔外部对照水体提高3~4个数量级(ANOV A P <0.01).由于季节原因,试验后期围隔内反硝化菌数量呈减少趋势,但仍高于对照水体.在温度较低的环境中,微生物活性受到一定抑制,反硝化速率减缓,客观上对水体脱氮效果不利,而沉水植物的存在又为微生物提供了适宜的生存环境,从而使围隔内微生物量维持在相对高的水平.围隔内外水体硝态氮的去除率和对应的反硝化菌数量并不显著相关(P >0.05),说明除固定化氮循环菌之外,还有沉水植物吸收、温度、水量水质变化等其他因素制约着水体氮素营养盐的脱除.2009-11-062009-11-132009-11-202009-11-272009-12-082009-12-112009-12-182009-12-242009-12-312010-01-082010-01-152010-01-262010-02-052010-02-122010-03-062010-03-13510152025303540455055C O D (m g /L )时间(d)图12 河道围隔内外COD 对比Fig.12 Variation of COD concentration in the enclosureand surrounding river water 表1 围隔内外反硝化菌释放效果对比Table 1 The comparison of denitrifying bacteria quantities in enclosure and surrounding river water during INCB releasing experiment日期项目 11-13 11-2011-27 12-18 12-24水温()℃ 5.5 10.6 3.6 2.9 8.6A(cell/L) 2.6×103 4.9×103 5.4×102 2.7×102 3.3×102B(cell/L) 1.7×106 1.1×107 4.6×105 1.4×105 1.4×105注:A 、B 分别为围隔内外水体反硝化菌MPN 值水温为取样日均值 结果表明,采用固定化氮循环细菌技术在围隔内能较好释放反硝化细菌,并在实验周期内保持较高微生物数量,有助于提高河道水体反硝化516 中国环境科学 32卷能力.另外,由于秋冬季一般沉水植物水质净化能力有限,本实验结合固定化氮循环菌和秋冬季生长的伊乐藻共同作用,着重发挥植物-脱氮微生物互利共生优势,有助于改善秋冬季富营养化入湖河道水质.3结论3.1长达5个月的贡湖金墅湾水源地入湖河道围隔实验表明,河道营养盐水平随季节变化较大,平均水体硝态氮含量占到总氮含量的61.8%,而秋冬季采用伊乐藻-固定化氮循环菌联用技术可有效净化水源地入湖河道水质,控制水体富营养化,该技术对原位入湖河道总氮去除率为 5.9%~ 61.2%,氨氮去除率12.4%~70.3%,硝氮去除率6.1%~68.0%, COD去除率4.2%~78.5%.由于河道原位环境条件变化的影响,河道围隔实验水质改善效果低于室内生态修复模拟实验.3.2本研究采用固定化氮循环菌(INCB)技术,在河道围隔内人工释放氮循环菌,使围隔内水体反硝化菌数量比围隔外河道水体高出3~4个数量级,在秋冬季 2.9~10.6℃温度条件下仍然能维持较高微生物量,强化水体反硝化脱氮能力.3.3室内模拟、原位河道生态修复实验表明,伊乐藻-固定化氮循环菌联用对水体氮素去除能力要优于单独使用沉水植物或微生物的手段,为控制水源地水体富营养化和水域生态修复提供了一种有效方法.参考文献：[1]姚垚,王晓龙,丁士明,等.太湖金墅湾水源保护区陆域水质特征 [J]. 环境科学与管理, 2010,35(5):39-42.[2]蒋跃,童琰,由文辉,等.3种浮床植物生长特性及氮、磷吸收的优化配置研究 [J]. 中国环境科学, 2011,31(5):774-780. [3]罗固源,卜发平,许晓毅,等.温度对生态浮床系统的影响 [J]. 中国环境科学, 2010,30(4):499-503.[4]Risgaard-Petersen N, Meyer R L, Rersbech N P. Denitrificationand anaerobic ammonium oxidation in sediments-effects of microphytobenthos and NO3-[J]. Aquatic Microbial Ecology, 2005,40(1):67-76.[5]Chen K N, Bao C H, Zhou W P. Ecological restoration ineutrophic Lake Wuli: A large enclosure experiment [J]. Ecological Engineering, 2009,35:1646-1655. [6]Li Z K, Pu P M, Hu W P, et al. Improvement of Taihu waterquality by the technology of immobilized nitrogen cycle bacteria [J]. Nuclear Science and Techniques, 2002,13(2):115-118.[7]李正魁,石鲁娜,杨竹攸,等.纯种氨氧化细菌Comamonas aquaticLNL3的固定化及短程硝化性能研究 [J]. 环境科学, 2009, 30(10):2952-2957.[8]黄亮,吴乃成,唐涛,等.水生植物对富营养化水系统中氮、磷的富集与转移 [J]. 中国环境科学, 2010,30(Suppl.):1-6[9]朱增银,王珺,尹大强,等.不同比例硝态氮和尿素氮对苦草的生理影响 [J]. 南京大学学报(自然科学), 2005,18(6):51-57. [10]宋睿,姜锦林,耿金菊,等.不同浓度铵态氮对苦草的生理影响[J]. 中国环境科学, 2011,31(3):448-453.[11]Bakker E S, Van Donk E,Declerck S A J, et al. 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Microsensoranalysis of oxygen in the rhizosphere of the aquatic macrophyte Littorella unifloru (L.) Ascherson [J]. Plant Physiology, 1994,105: 847-852.作者简介：王易超(1982-),男,江苏无锡人,南京大学环境学院硕士研究生,主要从事水污染控制研究.。
mpn法的定义
mpn法的定义MPN法是微生物学上常用的一种实验方法，用于定量分析水样等溶液中微生物的浓度。
MPN是“最概然数目”（Most Probable Number）的缩写，通过MPN法可以估计水样中微生物的数量，从而评估水质的卫生状况。
一、MPN法的原理MPN法的原理基于一种叫做“连续稀释法”的思想，即将原始水样连续稀释至一定倍数后，通过培养基中微生物的生长状况来推测原始水样中微生物的数目。
通常，MPN法需要用到一系列稀释液，每个稀释液中微生物的浓度比前一个稀释液低。
接种这些稀释液到培养基中，观察培养基中微生物的生长状况，通过统计阳性培养管的数量来估算原始水样中微生物的浓度。
二、MPN法的步骤1. 准备一系列稀释液：使用无菌的生理盐水或者其他适宜的稀释液，按照一定比例将原始水样逐级稀释。
2. 取出一定体积的每个稀释液，接种到含有适宜培养基的试管或培养皿中。
3. 培养：将接种好的培养基进行培养，一般在适宜的温度下进行，时间根据微生物的生长速度来确定。
4. 观察结果：观察培养基中是否有微生物的生长，通过阳性培养管的数量来确定MPN值。
5. 计算MPN值：根据选择性统计表，找出阳性培养管数量对应的MPN值，即可估算出原始水样中微生物的浓度。
三、MPN法的优势和局限性1. 优势(1) MPN法不需要进行精确的计数，只需要统计阳性培养管的数量，操作相对简单，不需要高度专业的技术。
(2) 适用范围广：MPN法适用于各种水质、土壤等复杂溶液中微生物的浓度估算，具有广泛的应用前景。
(3) 可以通过MPN法估计微生物的浓度变化趋势，用于监测水体的卫生状况和水污染等级。
2. 局限性(1) MPN法只能估算微生物的数量，无法区分微生物的种类和生物学特性，不适合于需要准确鉴定微生物种类的实验。
(2) 受到培养基种类、温度、培养时间等因素的影响，结果可能会存在一定的误差。
(3) MPN法需要的实验过程时间较长，约需数天至数周，无法实现实时监测。
mpn 法 -回复
mpn 法-回复什么是MPN法？MPN法是一种统计学方法，用于估计水样中微生物数量的一种常用方法。
MPN是Most Probable Number的缩写，意为“最有可能的数量”。
MPN 法通常用于检测水样中的细菌、寄生虫和其他微生物等微生物的数量。
这种方法的原理基于传统的分析技术，需要进行一系列的稀释和培养，利用结果产生一组回归方程，从而预测原始水样中微生物的数量。
MPN方法的优势在于可以在没有显微镜的情况下测定微生物水平。
它比其他方法更经济且易于执行，可以在不同的环境中进行，并且可以应用于各种类型的样品。
该方法适用于液体和固体样品，例如自来水、河水、湖水、池塘水、土壤和食品等。
这种方法的具体步骤是什么？MPN法的步骤可以分为三个主要阶段：培养基的制备、稀释和培养、观察和解释结果。
第一阶段是培养基的制备。
首先，选择适合微生物生长的培养基，例如普通营养琼脂或特定的选择性琼脂。
然后，按照制造商的指示或相关实验室方法制备培养基。
第二阶段是样品的稀释和培养。
将原始水样进行稀释，以适当的稀释比例制备一系列不同浓度的样品。
通常制备10倍、100倍和1000倍稀释液。
然后，将每个稀释液分配到培养基琼脂平板中，通常每个稀释液分配到3个平板上。
培养基中的微生物将在适当的环境条件下进行培养，在恒温培养箱中进行一定时间（通常为24-48小时）。
第三阶段是观察和解释结果。
培养箱中培养好的琼脂平板上会出现菌落，菌落的数量可以通过计数器计数。
通过观察每个稀释液的菌落数量，可以使用MPN表确定最有可能的微生物数量。
MPN方法的数据如何解释？MPN方法的结果可以根据MPN表解释。
MPN表是根据统计学原理和概率计算编制的。
它提供了菌落数量与最有可能微生物数量之间的关系。
根据每个稀释液中的菌落数量，可以在MPN表中找到最有可能的微生物数量的范围。
通常，结果以“每100毫升”表示，而每个稀释液的菌落数量作为数据输入。
根据MPN表，可以确定在给定的环境中最有可能的微生物数量区间。
MPN法测定硝化细菌数量
MPN法测定硝化细菌数量硝化作用是指氨经过微生物的作用氧化成亚硝酸和硝酸的过程。
它是由两类细菌分两个阶段完成的。
第一阶段是氨氧化为亚硝酸，由亚硝化菌完成；第二阶段是由亚硝酸氧化为硝酸，由硝化菌完成。
所以测定时需要测定亚硝酸菌和硝酸菌数量1材料与方法1.1实验用材砂粒样品：实验样品来自实验一不同高度取出的滤料，测砂子上硝化细菌：取1g砂子在无菌水中振荡多长时间？培养基：改良的斯蒂芬逊（Stephenson）培养基A、BA(NH4)2SO4 2.0gNaH2PO40.25gMnSO4·4H2O 0.01gMgSO4·7H2O 0.03gK2HPO40.75gCaCO3 5.0g蒸馏水1000mlPH 7.2BNaH2PO40.25gK2HPO40.75gMgSO4·4H2O 0.03gMnSO40.01gCaCO3 1.0gNa2CO3 1.0gNaNO3 1.0g蒸馏水1000mlPH 7.2121℃灭菌 30min器材：无菌吸管、试管（1.8cm×18cm）、白瓷比色板、接种环、酒精灯等。
格里斯试剂（Griess Reagent）第一、第二液：第一液：将0.5g的对氨基苯磺酸（Sulfanilic Acid）加到150ml的20%稀醋酸溶液中。
第二液：将1gα-萘胺（α-naphthylamine）加到20ml蒸馏水和150ml的20%稀醋酸溶液中。
二苯胺试剂：溶0.5g无色的二苯胺（Diphenylamine）于20ml蒸馏水及100ml浓硫酸（相对密度1.84）中即成。
1.2实验方法：1.2.1亚硝酸菌测定：将培养基A分装于试管中，每管5ml，每个样品需培养基19支试管。
砂粒悬液采取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7六个稀释度。
在每个培养基中，用无菌吸管接种砂粒悬液1ml。
每个稀释度重复3管，另取一管培养基接种1ml无菌水作为对照。
细菌瓶法用于反硝化菌菌量的测定
第36卷第3期2019年9月25日油田化学Oilfield ChemistryVol.36No.325Sept，2019文章编号：1000-4092（2019）03-456-03细菌瓶法用于反硝化菌菌量的测定*易绍金，邢燕青，余灿（长江大学化学与环境工程学院，湖北荆州434023）摘要：在微生物采油（MEOR ）研究、菌液产品质量检测、现场试验监控及环保领域，采用费时费事的最大概率数法（MPN 法）测定反硝化菌（DNB ）菌量。
为了更简便准确的测定DNB 的菌量，推荐使用含碳源、氮源、磷源及化学脱氧剂等培养液的DNB 专用测试瓶。
结果表明，将欲测水样注入测试瓶逐级稀释，并在30℃培养5d 后，培养液变浑浊并出现气泡表示有DNB 菌生长。
DNB 的计数按常规细菌瓶法进行。
用该细菌瓶法测定了某油田采出液、生物抑菌剂及微生物清防蜡菌剂中DNB 菌数，所得结果与MPN 法基本相同。
与传统的MPN 法相比，细菌瓶法具有生长指示明显、操作简单和工作效率高等优点。
表4参17关键词：反硝化菌（DNB ）；菌量；细菌瓶法；最大概率数法；微生物采油中图分类号：TE357：Q93-332文献标识码：ADOI：10.19346/ki.1000-4092.2019.03.014*收稿日期：2018-09-27；修回日期：2018-12-21。
基金项目：国家自然科学基金“油藏条件下微生物与原油的相互作用研究”（项目编号51474034）。
作者简介：易绍金（1963-），男，教授，1984年毕业于同济医科大学环境微生物专业，从事石油与环境微生物学和油气田环境保护教学与科研工作，通讯地址：434023湖北荆州长江大学化学与环境工程学院，E-mail ：759531738@ 。
反硝化菌（denitrifying bacteria ，简称DNB ）是一群能在厌氧条件下将硝酸盐还原成亚硝酸盐进而还原成氮气的一类细菌的总称［1-4］。