2.发酵工业菌种

二 ①施加选择性压力
、 发
压力的选择 营养、环境条件
酵
工 ②随机分离法
业
菌 种
抗生素产生菌的分离:如抑菌圈法、稀释法、
的 分
扩散法、生物自显影法
离 筛
酶抑制剂产生菌的分离 体外
选 抗病毒药物产生菌的分离 噬菌斑
发 酵 工 程 — 菌种
6.发酵性能测定
二 、
对筛选出的菌种进行生产性能测定。这些特
发 酵 工
菌 种
须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，
选 育
且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其
常 敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要
规 当心。
育
种
发 酵 工 程 — 菌种
诱变剂的选择
①碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但
三 、
很少使用，回复突变率高，效果不大。
优 良 菌
②亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的 遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙
三 前体或产品的耐受力。
、 优
(4)抑制或消除产品分解酶。
良 菌 种
(5)改进菌种外泌产品的能力。 (6)消除代谢产品的反馈抑制。
选
育
发 酵 工 程 — 菌种
具体来讲，有以下途径：
㈠提高特定基因的表达水平
三 、
(1)引入强转录及翻译信号，可通过在一高效
优 良 菌
表达载体上克隆靶基因；在靶基因的上游引 入强启动子；修改现有表达信号，提高基因
二、发酵工业菌种的分离筛选
二 、
典型步骤：样品采集→样品预处理→目标菌 富集→初筛→复筛→发酵性能测试→菌种鉴
发 酵
定→菌种保藏
工
业 菌
1.含微生物材料的样品采集
种
的 分
先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特
离 性，有针对性地采集样品。
筛
选
发 酵 工 程 — 菌种
2.标本的预处理：优化目标菌生长环境
发 酵 工 程 — 菌种
1.菌种代谢生理与分子生物学
初级代谢与次级代谢
三 代谢调控机制：酶活成的调节(诱导、阻遏)；
、 优
酶活性的调节(激活、抑制)
良
菌
种
选
育
发 酵 工 程 — 菌种
2.工业菌种的育种
包括下列3个步骤：
三 (1)在不影响菌种活力的前提下，有益基因型
、 的引入。
优 良
(2)希望基因型的选出。
、 的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培
优 良
养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。
菌
种
选 育
诱变处理
常 根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结
规 育
合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。
种
发 酵 工 程 — 菌种
中间培养
由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一
三 、
个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀
工业菌种改良途径
(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过
增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表
Байду номын сангаас三 、
达能力来提高限速酶的含量；在代谢途径中
优 引伸出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代
良 菌
谢途径。
种 选
(2)增加前体物的浓度。
育
发 酵 工 程 — 菌种
(3)改变代谢途径，减少无用副产品的生成以
及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、
性包括形态、培养特征、营养要求、生理生 化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受
业 菌
最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、
种 提取工艺等。
的
分
离
筛
选
发 酵 工 程 — 菌种
7.菌种鉴定：经典方法、现代方法
二 、
菌种鉴定手段包括常规鉴定、 BIOLOG碳源
发 自动分析鉴定和分子生物学鉴定及其他手段
二、发酵工业菌种
发 酵 工 程 — 菌种
发 酵 工 程 — 菌种
发酵工业对菌种的要求
①培养基原料来源广、廉价；
一 、
②培养条件易控制；
发 ③发酵周期短；
酵 工
④菌株高产；
业 菌 种
⑤抗病毒（噬菌体）能力强； ⑥菌株性状稳定，不易变异退化；
概 述
⑦菌体本身不能是病原菌；
一、发酵工业菌种概述
发 酵 工 程 — 菌种
三 化学诱变剂使用过程的安全性
、
优 良 菌
诱变剂量的选择：亚硝酸，0.07M Na2HPO4； 亚硝基胍，1M NaOH；
种
选 诱变剂的选择
育
常 出发菌株的选择
规 育 种
发 酵 工 程 — 菌种
诱变育种的原理
三 、
物理诱变剂：射线如紫外线、X-射线、γ-射 线，快中子；
优 良 菌
物理因素中目前使用得最方便而且十分有效 的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫
速率大的细胞留在培养器中。
发 酵 工 程 — 菌种
4.菌种分离
二 从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌
、 发
种的特性，采用各种筛选方法，准确地把所
酵 工
需要的菌种挑选出来。
业 菌
通过稀释平板、平板划线、平板涂布等手段
种 的
获得单菌落，再进一步获得纯化菌种。
分
离
筛
选
发 酵 工 程 — 菌种
5.菌种初筛、复筛
用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变 进行的筛选，称为诱变育种
常 规
诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称
育 种
为诱变剂
发 酵 工 程 — 菌种
三
、
优
良
菌 种
诱变剂
选
育
常 规 育 种
物理：紫外线，高能粒子（Co60等） 化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍等
发 酵 工 程 — 菌种
诱变剂处理过程中几个有关的问题
不易感染它种微生物或噬菌体
发 酵 工 程 — 菌种
产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学 上最好与致病菌无关）
三 生产特性要符合工艺要求
、
优 工业菌种的育种：
良 菌
运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物
种 选
技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过
育 改造，可使现存的优良性状强化，或去除不
良性质或增加新的性状。
育
发 酵 工 程 — 菌种
育种方法：常规育种、细胞工程、基于代谢
调节的育种、基因工程、蛋白质工程、代谢
三 工程等。
、 优
良 常规育种方法中，包括自然选育、诱变育种；
菌 种 选
育 自然选育
常 规
以微生物的自然变异作为基础的生产选种的
育 种
机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅 10-8-10-9左右。
种 选
酯常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是
育 毒性最小的诱变剂之一。
常 ③吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完
规 育
全中断。
种
发 酵 工 程 — 菌种
④紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色
三 、
体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回 复的缺失突变。但它可能影响邻近基因的性
优 良
能。
菌
种
选
育
常 规 育 种
菌 种 选
(3)改良菌种的评价(包括实验规模和工业生 产规模)。
育
发 酵 工 程 — 菌种
选择育种方法时综合考虑的因素
(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系
三 、
(如批式或连续发酵试验)； (2)对这一特定菌种的遗传和生物化学方面认
优 良
识的明了程度；
菌 (3)经济费用。
种
选
育
发 酵 工 程 — 菌种
种 选
效力等。
育 (2)诱导解除基因表达抑制的突变。
发 酵 工 程 — 菌种
㈡改进菌种的生长效率
提高菌株对底物的利用率方法：
三 、
a.通过确定并改变代谢中的耗能部分; b.由另一菌株的高效低能代谢途径代谢来实
优 良
现。
菌 种 选
c.赋予菌种对多种底物，特别是价廉而丰富 的底物的利用能力，由此可降低操作费用。
二 物理方法、化学方法、诱饵法
、
发 3.富集培养
酵
工 业
使混合微生物群体中某特定微生物比例激增
菌 的培养方法。可用促进某特定微生物生长繁
种 的
殖的选择性培养基或培养条件；或用抑制其
分 离 筛
他微生物生长繁殖的选择性培养基或培养条 件；或用连续培养法，在一定稀释率下，使
选 比生长速率小的细胞溢出培养器，而比生长
良 菌
主。因此在具体方法上就有差异。
种 选
初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某
育 些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的
常 大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。
规 育
在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛
种 的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复
筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。
常 规 育 种
发 酵 工 程 — 菌种
操作步骤
①将细菌培养液以3000r/min离心5min，倾去
三 、
上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离
优 心洗涤。
良 菌
②将菌悬液放入装有玻璃珠的三角瓶内打散
种 选 育
优 良 菌
释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将 突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选
种 选
和获得稳定菌株都是极为重要的。
育
常 规 育 种