发酵工程 2 发酵工业菌种
发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
华根霉 ( Rhizopus chinentis )
酿酒所必须的重要霉菌，也是 酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌 种。
2、毛霉 ( Mucor )
鲁氏毛霉 ( Mucor rouxianus ) 能糖化淀粉且能生成少量酒精；能产生
6、醋酸菌 (Acetobacter)
➢ 不形成芽孢，G－，好气性 ➢ 可生产醋酸.
7、棒状杆菌 (Corynebacterium) ➢ 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌.
8、短杆菌 (Brevibacterium)
氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也是酶法 合成生产辅酶A的菌种.
9、黄单胞菌 (Xanthomonas)
5、假丝酵母 (Candida)
➢能形成假丝，液体培养时能 形成浮膜。 ➢可生产SCP、甘油、脂肪酶。
6、红酵母 (Rhodotorula)
➢有明显的红色或黄色色 素，很多种因生荚膜而形 成粘质状菌落。 ➢可由菌体提取大量脂肪、 -胡萝卜素。
7、棉病针孢酵母 ( Nematspora gossypii )
2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)
与酿酒酵母相似，主要的区别在于葡萄汁酵母能发酵 棉子糖和蜜二糖。
3、汉逊酵母 (Hansenula)
此属酵母多能产生乙酸乙酯，从而增加产品的香 味，可用于酿酒和食品工业。
4、球拟酵母 (Toruiopsis)
此属酵母有些种能产生不同比例的甘油、赤藓 糖、阿拉伯糖；有的能利用烃类生产蛋白质。
复筛 不纯 第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛
第三章 工业发酵菌种
第三章发酵工业微生物菌种微生物发酵工业是利用微生物的生长和代谢活动生产各种有用物质的现代工业，它是以培养微生物进行发酵为主。
而在这个过程中，优良的菌种是一个现代化的发酵工业必不可少的，最为重要的环节。
其他如先进的生产工艺和先进的设备，则是为了更充分发挥优良菌种的性能而设计的。
第一节工业微生物菌种的分离和选育第二节工业微生物菌种的改良第三节发酵工业中菌种的退化第四节工业微生物菌种的保藏第五节工业微生物菌种的扩大培养第一节工业微生物菌种的分离和选育一般来说，从自然界直接分离到的菌种，不能立即适应实际的生产需要，只有通过选育，才能提高代谢产物的产量、改进产品质量直至简化工艺。
在微生物发酵工业中生产菌种的选育方法有：•微生物菌种的分离和选育•菌种的改良第一节工业微生物菌种的分离和选育一、微生物菌种的选育二、微生物常规育种三、根据代谢的调节机理选择高产突变菌株一、微生物菌种的选育从自然界分离新菌种一般包括以下几个步骤：1、采样2、增殖培养3、纯种分离4、性能测定1、采样采样地点的确定要根据筛选的目的、微生物的分布概况及菌种的主要特征与外界环境关系等，进行综合、具体地分析来决定。
如果不了解某种生产菌的具体来源，一般可以从土壤中分离。
①、确定选好地点取离地面5——15cm处的土壤几十克，盛入预先消毒好的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，记录采样时间、地点、环境情况等，以备查考。
②、尽快分离一般土壤中芽孢杆菌、放线菌和霉菌孢子忍耐不良环境能力较强，不太容易死亡。
但一般应尽快分离。
③、酵母菌或霉菌类微生物采样酵母菌或霉菌类微生物，它们对碳水化合物的需要量比较多，一般又喜欢偏酸环境，所以在普通植物花朵、瓜果种子及腐植质等上面比较多。
2、增殖培养收集到的样品，如含有所需的菌种较多，可直接进行分离。
如果样品含有所需要的菌种很少，就要设法增加该菌种的数量，进行增殖（富集）培养。
富集培养：富集培养就是指利用不同微生物之间的生命活动特点的不同，制定出特定的环境条件，使仅仅适应于这种条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加的微生物的分离方法。
发酵工程第二章发酵工业微生物菌种
李 先 磊
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
（一）采样
1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽 土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的 土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果 生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐 败物品，某些水域等。
新种分离与筛选的步骤
（五）毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为 生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种， 更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆 壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒 性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的 毒性试验。
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
（三）培养分离
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂
李 先 磊
Fermentation Engineering
生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增殖培 养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一 点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离 法。
李 先 磊
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
李 先 磊
（二）增殖培养 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物 至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择 性培养基，选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维 素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源， 那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常 生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样 对下阶段的纯种分离就会顺利得多。
高中发酵工程的知识点总结
高中发酵工程的知识点总结一、发酵工程的基本概念1. 发酵工程的定义发酵工程是以微生物或酶等生物催化剂为基础，通过控制合适的环境条件，利用微生物或酶的代谢作用，进行有选择地生产物质或提取有用产品的工程技术。
2. 发酵工程的原理发酵工程利用生物催化剂在适宜的温度、pH、氧气供应等条件下对原料进行代谢作用，使其产生有用的化学产物。
发酵过程分为有氧发酵和无氧发酵，有氧发酵是指微生物在充分供氧的情况下进行代谢作用，而无氧发酵则是微生物在缺氧条件下进行代谢作用。
3. 发酵工程的应用发酵工程在食品、医药、酒类、饲料、化工等领域都有重要的应用，可以生产出酒精、乳酸、维生素、抗生素、酶等多种产品。
二、微生物学基础1. 微生物的分类微生物是一类极小的生物体，包括细菌、真菌、酵母菌、病毒等。
其中，细菌可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，酵母菌主要是酵母菌科的酵母菌，真菌包括霉菌和酵母菌。
2. 微生物的生长特性微生物的生长需要适宜的温度、pH值、氧气供应等条件，不同微生物的生长特性有所不同。
典型的微生物生长曲线包括潜伏期、对数生长期和平稳期。
3. 微生物的代谢特点微生物的代谢分为呼吸代谢和发酵代谢两种形式。
呼吸代谢需要有氧气，产生CO2和H2O，而发酵代谢不需要氧气，产生乳酸、酒精、醋酸等产物。
4. 微生物的培养方法微生物的培养方法包括液体培养和固体培养两种形式，培养基的选择对微生物的生长有重要影响。
三、发酵工程的工艺流程1. 发酵工程的基本流程发酵工程的基本流程包括发酵菌种的培养和保存、发酵罐的设计和运行、发酵过程的控制和调节、产品的分离和提取等步骤。
2. 发酵工程的发酵罐发酵罐是进行微生物发酵的设备，按照不同的设计要求可分为批式发酵罐和连续式发酵罐。
3. 发酵工程的发酵菌种发酵菌种是进行发酵的微生物，可以是细菌、酵母菌、真菌等。
合适的发酵菌种是发酵工程成功的关键。
4. 发酵工程的发酵过程控制发酵过程的控制包括温度、pH值、氧气供应、营养物质的添加等方面，需要根据不同的菌种和发酵产品进行调节。
微生物菌种
虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目 前广泛使用的育种手段。
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
原始菌株（出发菌株）
活细胞计数 诱变剂处理 活细胞计数 中间培养
突变株分离
诱变预备处 理
初筛 复筛 生产性能试验
工业微生物来源
想菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需
菌株。
从自然界采集分离。
从一些发酵制品中分离目的菌株。
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
微生物菌种的选择性分离
工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合 成产物； 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造 的可操作性要强；
分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
目的微生物富集的一些基本方法
让目的微生物在种群中占优势，使筛选变 富集的目的： 得可能。
富集的三种方案：
定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的
条件（加热、膜过滤等），进行培养。
当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分
能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明 圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。
分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、 脂肪酶、核酸酶等；
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌 土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然 后铺在pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白 质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性 蛋白质，产生一透明圈。
遗传性能要相对稳定；
不易感染它种微生物或噬菌体； 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与 致病 菌无关）； 生产特性要符合工艺要求。
《发酵工程》02 工业发酵菌种选育
（2）增殖培养
➢目的： 富集目的微生物，让目的微生物在种群中 占优势，使筛选变得可能。
富集方法 1、养分 3、培养时间
2、pH条件 4、培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、 液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。
（３）纯种分离
•
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
例： 礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微 生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
• 细菌（bacteria）：常用的有枯草芽孢杆菌、 醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。
短杆菌：GA、Gln、lys…… 枯草芽孢杆菌：淀粉酶（BF7658）、碱性蛋白酶等 地衣芽孢杆菌：HASS(耐高温α-淀粉酶) αAmylase 苏云金芽孢杆菌短：杆B菌T生物农药…棒…状杆菌 梭状芽孢杆菌：丙酮、丁y酸ea等sts的发酵
啤棒酒状酵杆母菌
• 酵母菌（yeast）：属单细胞真核生物，主 要分布于含糖较多的酸性环境中。常用的 有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。
啤酒酵母：酿酒、辅酶类物质的发酵
酒香酵母：酿酒
汉逊酵母：酿酒，用于乙酸乙酯的发酵
假丝酵母：单细胞蛋白生产，石油发酵
霉菌
• 霉菌（mould）：喜偏酸性环境。可用于生产多种 酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。
黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业、糖化酶 黄曲霉：酱油生产，面酱 青霉菌：青霉素的生产 红曲霉：红曲制造，南方红曲酒（女儿红）；红色；豆腐 乳 赤霉菌：赤霉素的生产
【发酵工程】余龙江版-第2章-发酵工业菌种
培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。 另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌“附着材料”，如
无菌的植物组织或土壤浸出液。 通过改变培养温度和培养周期可选择性富集嗜冷性细菌、
中温菌和嗜高温菌。
次代培养及纯化步骤
1. 采样
(2) 采样对象
土壤、水、空气及枯枝落叶等，以土壤为主。
从土壤中采样要考虑土壤的以下特点：
① 有机质含量和通风状况
耕地、菜园 山坡上的森林
（有机质丰富、通气保水性能好）——细菌、放线菌
（有机质丰富、阴暗潮湿）——霉菌、酵母菌
沙土、无植被土壤、新开垦的生土、贫瘠的土地
——微生物少
② 取样的土层深度：5-25cm
3. 富集培养
富集培养的策略
（2）控制培养条件
➢ 溶氧浓度——好氧/厌氧 ➢ 高温——嗜热微生物 /非嗜热微生物 ➢ PH——嗜酸性/嗜碱性
4. 菌种分离
平板划线分离法 稀释分离法 毛细管分离法 小滴分离法
• 稀释倒 平板法
稀释分离法
• 平板 涂布法
注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。
1. 采样
③ 土壤的酸碱度
偏碱——细菌、放线菌 偏酸——霉菌、酵母菌
④ 土壤的植被状况
葡萄成熟时——根部酵母菌增多
⑤ 地理条件
南方土壤比北方土壤微生物含量多
⑤ 季节条件
秋季菜土样最理想
2.样品的预处理
（1）物理方法
热处理：根据目的菌较非目的菌的耐热性高 从而增加目的
菌的比例。
膜过滤法：浓缩水中的微生物细胞。 离心法：同上。
植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出 液适度培养取样，洗涤，取1ml经适度稀释后涂 布平板。
工业发酵菌种选育
纯种分离的方法有稀释分离法、划线分离法等
现代发酵技术
稀释分离法
现代发酵技术
平皿划线分离法
a.分区划线分离法
b.连续划线分离法
现代发酵技术
菌种筛选（初筛+复筛）
（1）平板筛选（初筛）
从产物角度出发
根据产物的性质有目的地设计培养基来筛选菌种
从形态角度出发
现代发酵技术
抑菌圈法
测试菌苔 含药物滤纸
抑菌圈
琼脂培养基
现代发酵技术
其他鉴定—毒性试验
自然界天然微生物可能产生毒素
据规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲
霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作 为与食品工业有关的菌种，均需通过两年以上的毒性试验。
现代发酵技术
2、诱变育种
从野生菌转向变异菌 自然选育转向代谢育种 从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。
现代发酵技术
二、菌种选育的主要目的
提高产量
改进质量
增加新品种 改善工艺条件
现代发酵技术
实
例
工业生产菌
不再分泌黄色色素
原始产生菌 青霉素产生菌产黄色色素
土霉素产生菌产大量泡沫
泡沫减少
红霉素产生菌不耐噬菌体
2、工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，大量高效地合成产物 有关合成产物的途径尽可能地简单
遗传性能相对稳定 不易感染它种微生物或噬菌体
产生菌及其产物的毒性低
生产特性要符合工艺要求
现代发酵技术
3、理想的生产菌种
生长繁殖迅速； 产量高； 易培养； 发酵周期短； 耐噬菌体； 纯种。
如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。
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3）根霉属(Rhizopus) 米根霉（R oryzae）：米根霉在我国酒药和
酒曲中常见。其淀粉酶活力相当强，有淀粉糖化 能力和转化蔗糖的性能，还能产生脂肪酶。能发 酵产生乳酸、反丁烯二酸。
华根霉：华根霉多出现在我国酒药和酒曲中， 具较强的耐高温性能（45℃能生长），淀粉酶液 化力强，有溶胶性，能产生酒精、芳香脂类、乳 酸及反丁烯二酸，能转化甾族化合物。
2 发酵工业菌种
思考题 1、常见的工业微生物包括哪些类群？ 2、作为工业生产菌株应具备哪些基本特性？ 3、了解发酵工业中的细菌、酵母菌、霉菌、放 线菌及其生产的产品。 4、掌握菌种分离筛选的基本过程。
5、诱变育种及其原理。 6、常用的化学诱变剂。 7、菌种退化、原因与防治。 8、菌种保藏的方法。
广义的微生物： 包括病毒、立克次氏体、细菌、放线菌、酵母菌、 霉菌、单细胞藻类、原生动物和支原体等。
工业上常用的包括面包酵母、酒精酵母、 啤酒酵母、葡萄酒酵母、假丝酵母、丝赤酵母 等。用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶、单细 胞蛋白等。
4．霉菌(mould) 是一群在营养基质止形成绒毛状、网状或絮状
菌丝真菌的通称。
1）曲霉属(Aspergillus) 黑曲霉（A. niger）：有多种活性强大的酶系，
是酶制剂工业广泛应用的菌种之一。用以生产酸 性蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、纤 维素酶等，它的变异菌株可产生柠檬酸、葡萄糖 酸、草酸及抗坏血酸。
2）青霉属（Penicillium） 产黄青霉：是青霉素的最重要生产菌，并能
产生葡萄糖氧化酶及葡萄糖酸、柠檬酸、抗坏血 酸等。
展开青霉：主要用于生产抗真菌的抗生素－ 灰黄霉素。
自然选育、诱变育种、抗噬菌体菌种的选育、 杂交育种、原生质体融合技术、基因工程、蛋 白质工程、代谢工程技术等都被用优良生产菌 种的选育。
菌株选育典型流程
出发菌株（砂土管或冷冻管）
原种特性考擦
斜面
或摇瓶培养24h
小试 培养基优化
单孢子悬液
菌悬液
挑出高产菌株
诱变处理 处理前后计数
稀释涂平板 观察单菌落形态
四、发酵工业菌种鉴定
1、经典的分类鉴定方法 形态学特征： 生理生化特性： 血清学试验与噬菌体分型： 氨基酸顺序和蛋白质分析：
2、现代分类鉴定方法 DNA的碱基组成： 核酸的分子杂交： 遗传重组特性分析： rRNA序列分析： 细胞化学成分特征分类法：
五、发酵工业菌种改良
菌种选育改良的目标： 提高目标产物的产量； 提高目标产物的纯度，减少副产物； 改良菌种性状，改善发酵过程； 改变生物合成途径，以获得高产的新产品。
1）链霉菌属(Streptomyces)产生的抗生素：包 括链霉素、新霉素、卡那霉素、妥布拉霉素、 越霉素、春雷霉素、土霉素、金霉素、螺旋霉 素、红霉素、麦迪霉素等。
2）其它放线菌产生的抗生素：庆大霉素、利福 霉素、指孢囊霉素、马杜拉霉素。
3．酵母(yeast)
酵母是单细胞真核微生物,具有典型的细胞 结构,生长温度范围在4-30℃,最适温度为2530℃。酵母在自然界分布很广，主要生长在偏 酸性的含糖环境中。
1、样品的采集
采样原则： 材料来源越广泛，越有可能获得新的菌种。在一 些极端环境（高温、高压、高盐等），可找到能 适应苛刻条件的微生物类群。 了解目标产物的性质和可能产目标产物的微生物 种类及其生理特征，可提高效率，事半功倍。
2、样品的预处理 目的：提高菌种分离效率。 物理方法：热处理（用于减少样品中的细菌数）； 膜过滤法和离心法（用于浓缩水中的微生物）； 化学方法：通过在培养基中添加某些化学成分来 增加特定微生物的数量。 诱饵法：将一些物质（如石蜡、花粉、毛发等） 加到待分离的样品中作诱饵富集目的菌。
挑选单菌落转种斜面
摇瓶初筛
对照组比较
摇瓶复筛 传种斜面 保藏菌株 挑出高产斜面
1、自然选育 不经人工处理，利用微生物的自然突变进行
菌种选育的过程称为自然选育（spontaneous mutation）。
自然选育最为成功的例子是目前被广泛使 用的卡介苗(BCG vaccine)。法国的卡尔密脱 (Calmette)和介林(Guerin)把牛型的结核分枝 杆菌接种在牛胆汁、甘油、马铃薯培养基上， 连续传代培养230代，前后经历13年时间，终 于在1923年获得显著减毒的结核杆菌----卡介 苗。
（2）生长较快，发酵周期短；；
（5）菌种不易变异退化，以保证发酵生产和产品质 量的稳定；
（6）对放大设备的适应性强； （7）菌种为非病原菌，不产生任何有害的生物物质
和毒素。
三、发酵工业菌种的分离与筛选
菌株分离（Strain Separation)就是将混杂着各种 微生物的样品按照实际需要和菌株的特性采取 迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛 选，进而得到所需微生物的过程。 分离微生物新种的具体过程大体可分为采样、 增殖、纯化和性能测定。
常见的工业微生物： 细菌、放线菌、酵母菌、霉菌及危害细菌、放 线菌生长的噬菌体等 。
一、工业微生物常用菌种
1．细菌（bacteria ） 发酵工业常用的细菌有枯草芽孢杆菌、醋酸
杆菌、乳酸菌、棒状杆菌、短杆菌等。用于生 产酶制剂、醋酸、乳酸、氨基酸、肌苷酸等 。
2．放线菌(actinomyces)
4）红曲霉属(Monascus) 菌丝呈红色以至紫色， 可由我国南方红曲中分离得到。
5．其它 担子菌：香菇、灵芝等。 藻类：螺旋藻、单胞藻等。 基因工程菌：基因工程菌在发酵工程已得到广泛
应用，如酶制剂、胰岛素、干扰素、生长激素、 乙型肝炎病苗等的生产。
二、工业生产对菌种的要求
（1）能在廉价原料制成的培养基上生长，且 生成的目的产物产量高、易于回收；
3、富集培养 通过富集培养增加待分离的目标微生物的数量。 控制培养基的营养成分：碳源或氮源； 控制培养条件：温度、pH、渗透压、溶解氧浓 度等。
4、菌种分离 平板划线分离法 稀释分离法 涂布分离法
5、菌种的筛选
对菌株的筛选必须要有一个好的方法（最 简单的方法）来加以鉴定，如颜色的变化、抑 菌圈、透明圈等。