2发酵工业菌种制备原理和技术(2)(精)PPT课件
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发酵工程 第2章 发酵工业菌种PPT课件
lys.HCl 2.1 g/l
F6-16 (leu -, Thr -)
20.8 g/l
F9-50 (leu -, Thr -, AEC r)
33.5 g/l
42
代谢工程的定义
利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径进 行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调 控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新 的代谢途径，生产特定目的产物而发展起来的一 个新的学科领域。
13
问题： 生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
例：礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微生 物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
14
的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来筛选 高产菌。
28
放线菌的分离： 以产链霉素菌种的分离为例
（从退化菌种中筛选）
取工业发酵液（含孢子）样品1环 放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀
采用稀释法制平板，获取单菌落
根据高产菌的特点，选择目的菌落
筛ห้องสมุดไป่ตู้模型：形态依据
斜面保藏
高产菌恢复
放大培养，发酵液性能测试
物理：紫外，快中子
{ 诱变剂
化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍
35
（一）、诱变剂的作用原理（略） （二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题
化学诱变剂使用过程的安全性
亚硝酸：0.07MNa2HPO4 亚硝基胍：1MNaOH
诱变剂量的选择
诱变剂的选择 出发菌株的选择
36
（三）、诱变育种的一般步骤 (略)
发酵工艺 第2章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术
微生物菌种保藏机构名称和缩写
中国 缩写
ACCC
SH IA CCGMC AS-IV
CAF
IFFI
ID IV CIVBP
名称 中国农业微生物菌种保藏管理中 心 上海市农业科学院食用菌研究所 中国医学科学院抗菌素研究所 普通微生物菌种保藏管理中心 中国科学院武汉病毒研究所 中国林业科学院菌种保藏管理中 心 轻工业部食品发酵工业科学研究 所 中国医学科学院皮肤病研究所 中国医学科学院病毒研究所 中国兽医药品监察所
最常用的工业微生物
放线菌
– 链霉菌属 – 小单孢菌属 – 地中海诺卡氏菌 – 米苏里游动放线菌
藻类
藻类包括数种不同类以光 合作用产生能量的生物。 它们一般被认为是简单的 植物，并且一些藻类与比 较高等的植物有关。虽然 其它藻类看似从蓝绿藻得 到光合作用的能力，但是 在演化上有独立的分支。 所有藻类缺乏真的根、茎、 叶和其它可在高等植物上 发现的组织构造。藻类与 细菌和原生动物不同之处， 是藻类产生能量的方式为 光合自营性 ；琼脂（棕 藻）
国外重要菌种保藏机构
1、ATCC：美国模式培养物（菌）保藏中心 2、NRRL：美国农业部北方开发利用研究部 3、CSH：美国冷泉港研究所 4、IAM：日本东京大学应用微生物研究所 5、IFO：日本发酵研究所（大阪） 6、NCTC：英国国立标准菌种收藏所 7、CBS：荷兰真菌中心保藏所
三、生产中常用菌种的分离、选 育（screening ）
（一）微生物菌种的分离 四步骤： 样品采集 增值培养 纯种分离 生产性能的测定
1.施加选择压力分离法
施加选择性压力分离法
主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营 养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、 氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微 生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到 使目的菌种占优势．而得以快速分离纯化的目的。如 可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物 分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生 物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在 分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加 选择性。如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗 生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。
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几个应注意的问题
（1）出发菌株 出发菌株应产量高、对诱变剂敏感性大、变异幅度广。
几个应注意的问题
（2）复合诱变因素的使用 野生型菌株用单一诱变因素有时能取得好效果；老
菌种单一诱变因素重复使用突变效果不高，可利用复合 因素、扩大诱变幅度，提高诱变效果。
青霉菌选育：先以氮芥处理很短时间而不引起突变， 再用UV处理，可使诱变频率大为提高。提高突变频率可 获得高产菌株。
目的产物积累
微生物育种的目的
方法：突变、体内重组 体外重组（基因工程）
微生物菌种的选育
经典育种：自然选育和诱变育种 定向育种：转化、转导、接合、原生质体融合、代谢 调控和基因工程等。
自然选育
自然选育：利用菌种自然突变(Spontaneous Mutation)进 行菌种筛选的过程。 自然突变：微生物在没有人工参与下所发生的突变。 引起自然突变两个原因：多因素低剂量的诱变效应和互变 异构效应。
发酵工程原理与技术第二章
第一节 发酵工业微生物菌种的选育
微生物的特性及工业微生物的要求 发酵工业微生物菌种的分离和选育 发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏
发酵工业微生物菌种的分离和选育
微生物菌种的分离 微生物菌种的选育
微生物菌种的分离
施加选择性压力分离法 随机分离方法
自然突变
结果： 1、菌种衰退和生产质量下降； 2、对生产有益的突变。
为此，菌株应定期纯化，保存优良菌种(复壮)。 实际生产中，从高产批号中取样分离单菌落， 从中选 出稳定菌株用于生产。
自然选育
自然选育的优越性:简单易行,可以达到纯化菌 种,防止菌种衰退,稳定生产,提高产量的目的.
缺点:效率低,进展慢,很难使生产水平大幅度提 高.
几个应注意的问题
（1）出发菌株 出发菌株应产量高、对诱变剂敏感性大、变异幅度广。
几个应注意的问题
（2）复合诱变因素的使用 野生型菌株用单一诱变因素有时能取得好效果；老
菌种单一诱变因素重复使用突变效果不高，可利用复合 因素、扩大诱变幅度，提高诱变效果。
青霉菌选育：先以氮芥处理很短时间而不引起突变， 再用UV处理，可使诱变频率大为提高。提高突变频率可 获得高产菌株。
目的产物积累
微生物育种的目的
方法：突变、体内重组 体外重组（基因工程）
微生物菌种的选育
经典育种：自然选育和诱变育种 定向育种：转化、转导、接合、原生质体融合、代谢 调控和基因工程等。
自然选育
自然选育：利用菌种自然突变(Spontaneous Mutation)进 行菌种筛选的过程。 自然突变：微生物在没有人工参与下所发生的突变。 引起自然突变两个原因：多因素低剂量的诱变效应和互变 异构效应。
发酵工程原理与技术第二章
第一节 发酵工业微生物菌种的选育
微生物的特性及工业微生物的要求 发酵工业微生物菌种的分离和选育 发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏
发酵工业微生物菌种的分离和选育
微生物菌种的分离 微生物菌种的选育
微生物菌种的分离
施加选择性压力分离法 随机分离方法
自然突变
结果： 1、菌种衰退和生产质量下降； 2、对生产有益的突变。
为此，菌株应定期纯化，保存优良菌种(复壮)。 实际生产中，从高产批号中取样分离单菌落， 从中选 出稳定菌株用于生产。
自然选育
自然选育的优越性:简单易行,可以达到纯化菌 种,防止菌种衰退,稳定生产,提高产量的目的.
缺点:效率低,进展慢,很难使生产水平大幅度提 高.
发酵工程 第二章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术讲解
的水生环境中生长
种类：分属于子囊菌纲、担子菌纲及半知菌 类，目前已知的酵母菌有56属，大约500多种， 与其他类群比，种类要少得多。
分布：酵母菌主要分布在含糖质较高的偏酸 性环境，诸如果品、蔬菜、花蜜和植物叶子上， 特别是葡萄园和果园的土壤中，因而称为糖菌 （Sugar fungus）。
裂殖酵母
5. 担子菌——蘑菇（mushroom）
6. 藻类
许多国家已把藻类作为人类保健食品和饲料。 螺旋藻
可通过藻类将CO2转变为石油；国外还有从“藻 类农场”获得氢能的报道。
三、工业微生物的来源
根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工 厂或菌种保藏部门索取或购买 从发酵制品中分离目的菌株 自然界中分离筛选新的微生物菌种 菌种选育：自然选育、人工诱变、原生质体融 合、基因工程改造
第一节 发酵工业常用的微生物菌种
我们的周围存在着多种多 样的微生物，它们和我们 的生活密切相关。
目前已知微生物约有10万种，分布在以下各界中：
原核生物界：例如细菌、蓝藻 真菌界：例如酵母菌 原生生物界：例如草履虫、变形虫 病毒：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒
发酵工业对菌种的要求
能在廉价培养基上迅速生长，目的代谢产物产量高 培养条件易于控制 生长速度和反应速度快，发酵周期短 满足代谢控制的要求 抗噬菌体和杂菌的能力强 遗传性状稳定，菌种不易变异退化 发酵过程产生泡沫少 对前体物质有耐受能力，不作为碳源利用 不是病原菌，不产生有害的生物活性物质
如何在后续的操作中使这种可能性实现？
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要 和基础的步骤。
到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示 一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。
在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种 类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调 整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之 微生物相适应。
种类：分属于子囊菌纲、担子菌纲及半知菌 类，目前已知的酵母菌有56属，大约500多种， 与其他类群比，种类要少得多。
分布：酵母菌主要分布在含糖质较高的偏酸 性环境，诸如果品、蔬菜、花蜜和植物叶子上， 特别是葡萄园和果园的土壤中，因而称为糖菌 （Sugar fungus）。
裂殖酵母
5. 担子菌——蘑菇（mushroom）
6. 藻类
许多国家已把藻类作为人类保健食品和饲料。 螺旋藻
可通过藻类将CO2转变为石油；国外还有从“藻 类农场”获得氢能的报道。
三、工业微生物的来源
根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工 厂或菌种保藏部门索取或购买 从发酵制品中分离目的菌株 自然界中分离筛选新的微生物菌种 菌种选育：自然选育、人工诱变、原生质体融 合、基因工程改造
第一节 发酵工业常用的微生物菌种
我们的周围存在着多种多 样的微生物，它们和我们 的生活密切相关。
目前已知微生物约有10万种，分布在以下各界中：
原核生物界：例如细菌、蓝藻 真菌界：例如酵母菌 原生生物界：例如草履虫、变形虫 病毒：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒
发酵工业对菌种的要求
能在廉价培养基上迅速生长，目的代谢产物产量高 培养条件易于控制 生长速度和反应速度快，发酵周期短 满足代谢控制的要求 抗噬菌体和杂菌的能力强 遗传性状稳定，菌种不易变异退化 发酵过程产生泡沫少 对前体物质有耐受能力，不作为碳源利用 不是病原菌，不产生有害的生物活性物质
如何在后续的操作中使这种可能性实现？
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要 和基础的步骤。
到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示 一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。
在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种 类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调 整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之 微生物相适应。
第二章发酵工业微生物菌种制备原理和技术-PPT
筛选一些具有特殊性质得微生物时,需根据该微生物独特 得生理特性到相应得地点采样(极端环境)。如:
高温酶产生菌:温度较高得南方,或温泉、火山爆发处 及北方得堆肥中采集样品;
低温酶产生菌:寒冷得地方,如南北极地区、冰窖、深 海中采样;
耐压菌:海洋底部采样。 耐高渗透压酵母菌:通常到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积处
菌种纯化就是指在特定环境中只让1种来自同一祖先得微生物 群体生存得技术。
菌株分离、筛选虽为两个环节,但却不能绝然分开,因为分离中 得一些措施本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌得筛选 一般包括两大部分:一就是从自然界分离所需要得菌株,二就是 把分离到得野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。
3、分离思路
从自然界筛选
B、采样季节:以温度适中,雨量不多得秋初为好。
C、采土方式:在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取 离地面5-15cm处得土约10g,盛入清洁得牛皮纸袋或塑 料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等, 以备查考。为了使土样中微生物得数量与类型尽少变 化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离。
别出来。
抗生素筛选
6、生产性能得测定
由于纯种分离后,得到得菌株数量非常大,如果对每 一菌株都作全面或精确得性能测定,工作量十分巨大, 而且就是不必要得。一般采用两步法,即初筛与复筛, 经过多次重复筛选,直到获得1～3株较好得菌株,供 发酵条件得摸索与生产试验,进而作为育种得出发菌 株。这种直接从自然界分离得到得菌株称为野生型 菌株,以区别于用人工育种方法得到得变异菌株(亦 称突变株)。
采样。如有人曾在花蜜中分离到一株能耐30%高糖得耐 高渗透压得酵母菌。
(3)含微生物样品得富集培养(优化得过程) ----施加选择性压力分离法
微生物工程发酵二菌种制备原理与技术精品PPT课件
防止退化的方法： • 尽量减少传代； • 经常进行纯化； • 创造良好的培养条件； • 单核细胞的移植传代； • 采用有效的保藏方法；
菌种的复壮
• 在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种 分离和测定生产性能等方法，从衰退的群 体中找到尚未衰退的个体，以达到恢复该 菌种原有性状的措施；
• 方法：纯种分离（单细胞分离）； 淘汰法； 寄生体内复壮法；
2.1.4菌种的制备原理和方法
菌株获得的主要方法： • 向菌种保藏机构索取；
➢ 从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处： 经济性 指导性
• 从自然界分离筛选； • 从某些发酵制品中分离；
从自然界筛选目标菌株的方法与步骤
含微生物样品的采集 （含微生物样品的富集培养）
微生物的分离 野生型目的菌株的筛选
放线菌 • 主要生产抗生素、某些特定的酶； • 常用菌种： • Streptomyces lividans; S. coelicolor; • S. hygroscopicus; Micromonospora echinospora; • Actinoplanes ferrugineus;
酵母 • 主要生产酒精、有机酸、 单细胞蛋白 常用菌种：
• Saccaromyces cerevisiae • Pichia pastoris • Candida glabrata • C. tropicals • Phaffia rhodozyma • Yarrowia lipolitica
霉菌 • 主要生产：抗生素、有机酸、酶、色素； • Penicillium chrysogenum • Aspergillus niger • A. oryzae • Rhizopus oryzae
2.1.5 适应性进化（菌株驯化）
发酵工程第二章发酵工业微生物菌种
李 先 磊
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
（一）采样
1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽 土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的 土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果 生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐 败物品，某些水域等。
新种分离与筛选的步骤
（五）毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为 生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种， 更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆 壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒 性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的 毒性试验。
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
（三）培养分离
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂
李 先 磊
Fermentation Engineering
生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增殖培 养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一 点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离 法。
李 先 磊
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
李 先 磊
（二）增殖培养 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物 至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择 性培养基，选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维 素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源， 那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常 生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样 对下阶段的纯种分离就会顺利得多。
2发酵工业菌种制备原理和技术(2)(精)
作为种子扩大培养的方法： ① 表面培养法 ② 固体培养法 ③液体培养法（三角瓶摇床震荡或转式培养）； ④载体培养法
24
固体培养法（曲法培养）
浅盘固体培养 深层固体培养
25
优点：
（1）酶活力高。 （2）生产过程中无菌程度要求不很严格。 （3）对于固体发酵，由于产物浓度大，易于分离，可以 有效的降低产品分离成本。
NICPB 卫生部药品生物制品监察所
IV
CIVBP
中国医学科学院病毒研究所
中国兽医药品监察所
CVCC
YM
兽医微生物菌种保藏管理中心
云南省微生物研究所
10
国外重要菌种保藏机构
1、ATCC：美国模式培养物（菌）保藏中心
2、NRRL：美国农业部北方开发利用研究部
3、CSH：美国冷泉港研究所
4、IAM：日本东京大学应用微生物研究所
9
微生物菌种保藏机构名称和缩写
中 国 缩写 ACCC SH IA CCGMC AS-IV CAF IFFI ID 名称 中国农业微生物菌种保藏管理中心 上海市农业科学院食用菌研究所 中国医学科学院抗菌素研究所 普通微生物菌种保藏管理中心 中国科学院武汉病毒研究所 中国林业科学院菌种保藏管理中心 轻工业部食品发酵工业科学研究所 中国医学科学院皮肤病研究所 缩写 ISF CACC SIA AS CFCC CICC CMCC 名称 中国农业科学院土壤肥料研究 所 抗菌素菌种保藏管理中心 四川抗菌素工业研究所 中国科学院微生物研究所 林业微生物菌种保藏管理中心 工业微生物菌种保藏管理中心 医学微生物菌种保藏管理中心
22
（5）接种量
移入种子的体积 接种量＝ ————————— 接种后培养液的体积
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1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
本章内容
一、常用的工业微生物菌种选育 二、工业微生物种子的扩大培养 三、种子培养基及其制备
2
第一节 常用的工业微生物菌种选育
微生物工程工业生产水平 的三个决定要素:
生产菌种的性能 发酵和提取工艺条件 生产设备
获得优良的生产菌种是实现高水平微生物工程 工业生产的第一环节.
3
一．工业常用微生物
细菌：枯草杆菌，短杆菌，大肠杆菌 酵母：酿酒酵母（啤酒，葡萄酒），酒
26
液体深层培养法
27
优点： （1）生产效率高，便于自动化管理。 （2）生产过程中温度、溶氧、pH值等参数可以实现全
面控制。 （3）通常生产液体种子，整个生产周期较短。 缺点： （1）无菌程度要求高，相对生产设备投资较大。 （2）对于某些种类的发酵，液体培养因投资大、生产
密度大而难以实现。
28
精酵母，假丝酵母 霉菌：黑曲霉，土曲霉，米曲霉，红曲
霉，根霉，木霉，青霉 放线菌：单孢菌 其他：藻类
4
最常用的工业微生物
细菌
枯草芽孢杆菌 醋酸杆菌 棒状杆菌 短杆菌 大肠杆菌
5
最常用的工业微生物
酵母菌
酿酒酵母 假丝酵母属
产朊假丝酵母 解脂假丝酵母 热带假丝酵母
毕赤酵母属、汉逊酵母属
浅盘固体培养 深层固体培养
25
优点：
（1）酶活力高。 （2）生产过程中无菌程度要求不很严格。 （3）对于固体发酵，由于产物浓度大，易于分离，可以
有效的降低产品分离成本。
缺点：
（1）生产劳动强度较大，占地面积大，不宜自动化生产。 （2）周期长。 （3）培养过程中环境条件控制较难。 （4）生产过程中，由于无菌程度较低，其菌种不纯。
17
（3）种子罐级数的确定 种子罐级数：是指制备种子需逐级
扩大培养的次数，取决于：
菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖 速度；
所采用发酵罐的容积
18
✓ 细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少， 二级发酵。 茄子瓶→种子罐→发酵罐
✓ 霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液→一级种子罐（27˚C,40小时孢子 发芽，产生菌丝 ）→二级种子罐 （ 27˚C,10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌 丝体）→发酵罐
为每次发酵罐的投料提供相当数量的 代谢旺盛的种子。
12
种子扩大培养定义
种子扩大培养：是指将保存在砂土管、 冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种 接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇 瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数 量和质量的纯种过程。
这些纯种培养物称为种子。
13
种子制备的过程大致可分为：
实验室种子制备阶段 生产车间种子制备阶段
14
1.实验室种子制备 实验室种子的制备一般采用两种方式
固体培养基培养孢子 液体培养法
15
2.生产车间种子制备
（1）种子罐的作用：
种子罐
主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌 （丝）体，接入发酵罐能迅速生长， 达到一定的菌体量，以利于产物的 合成。
16
（2）种子罐接种： 微孔接种法 火焰保护法 压差法
缩写
ISF
CACC SIA AS CFCC CICC CMCC NICPB CVCC YM
名称 中国农业科学院土壤肥料研究 所 抗菌素菌种保藏管理中心 四川抗菌素工业研究所 中国科学院微生物研究所 林业微生物菌种保藏管理中心 工业微生物菌种保藏管理中心 医学微生物菌种保藏管理中心 卫生部药品生物制品监察所 兽医微生物菌种保藏管理中心 云南省微生物研究所
的一个方面
21
（4）种龄
种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐 或发酵罐时的培养时间。 种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。 原则：对数生长期，细胞活力强，菌体浓度相对较大， 但是最终由实验结果定。
22
（5）接种量
移入种子的体积 接种量＝ —————————
接种后培养液的体积
接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长 繁殖的速度。
10
国外重要菌种保藏机构
1、ATCC：美国模式培养物（菌）保藏中心 2、NRRL：美国农业部北方开发利用研究部 3、CSH：美国冷泉港研究所 4、IAM：日本东京大学应用微生物研究所 5、IFO：日本发酵研究所（大阪） 6、NCTC：英国国立标准菌种收藏所 7、CBS：荷兰真菌中心保藏所
11
第二节 工业微生物种子的扩大培养 菌种扩大培养的目的：
通常接种量，细菌1~5%，酵母菌5~10%， 霉菌7~15%、有时20~25%。
23
3、发酵工业种子培养
⑴静置培养法（厌气性发酵）； ⑵通气性培养（好气性发酵）；
作为种子扩大培养的方法： ① 表面培养法 ② 固体培养法 ③液体培养法（三角瓶摇床震荡或转式培养）； ④载体培养法
24
固体培养法（曲法培养）
6
最常用的工业微生物
霉菌 曲霉属 米曲霉 黑曲霉 青霉属 青霉菌：点青霉、产黄青霉 桔青霉 根霉属 德氏根霉 米根霉、小麦曲根霉 红曲霉属 紫红曲霉
7
最常用的工业微生物
放线菌
链霉菌属 小单孢菌属 地中海诺卡氏菌 米苏里游动放线菌
8
微生物工业对菌种的要求
能在廉价原料制备的培养基上迅速生长 和生成所需的代谢产物产量高。
培养条件易于控制 生长迅速，发酵周期短 满足代谢控制的要求 抗噬菌体能力强 菌种不易变异退化 安全性（不是病源菌，不产毒素）
9
微生物菌种保藏机构名称和缩写
中国 缩写
ACCC
SH IA CCGMC AS-IV CAF IFFI ID IV CIVBP
名称
中国农业微生物菌种保藏管理中心
上海市农业科学院食用菌研究所 中国医学科学院抗菌素研究所 普通微生物菌种保藏管理中心 中国科学院武汉病毒研究所 中国林业科学院菌种保藏管理中心 轻工业部食品发酵工业科学研究所 中国医学科学院皮肤病研究所 中国医学科学院病毒研究所 中国兽医药品监察所
几种深层培养法
①放大法 ②两步法 ③控制培养法 ④分批培养法(间歇发酵法) ⑤连续培养法 ⑥补料分批培养法(流加法)
✓ 放线菌：生长更慢，采用四级发酵 ✓ 酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用
一级种子
19
20
确定种子罐级数需注意的问题
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响 种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会； 级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一
般2-4级。 在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要
本章内容
一、常用的工业微生物菌种选育 二、工业微生物种子的扩大培养 三、种子培养基及其制备
2
第一节 常用的工业微生物菌种选育
微生物工程工业生产水平 的三个决定要素:
生产菌种的性能 发酵和提取工艺条件 生产设备
获得优良的生产菌种是实现高水平微生物工程 工业生产的第一环节.
3
一．工业常用微生物
细菌：枯草杆菌，短杆菌，大肠杆菌 酵母：酿酒酵母（啤酒，葡萄酒），酒
26
液体深层培养法
27
优点： （1）生产效率高，便于自动化管理。 （2）生产过程中温度、溶氧、pH值等参数可以实现全
面控制。 （3）通常生产液体种子，整个生产周期较短。 缺点： （1）无菌程度要求高，相对生产设备投资较大。 （2）对于某些种类的发酵，液体培养因投资大、生产
密度大而难以实现。
28
精酵母，假丝酵母 霉菌：黑曲霉，土曲霉，米曲霉，红曲
霉，根霉，木霉，青霉 放线菌：单孢菌 其他：藻类
4
最常用的工业微生物
细菌
枯草芽孢杆菌 醋酸杆菌 棒状杆菌 短杆菌 大肠杆菌
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最常用的工业微生物
酵母菌
酿酒酵母 假丝酵母属
产朊假丝酵母 解脂假丝酵母 热带假丝酵母
毕赤酵母属、汉逊酵母属
浅盘固体培养 深层固体培养
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优点：
（1）酶活力高。 （2）生产过程中无菌程度要求不很严格。 （3）对于固体发酵，由于产物浓度大，易于分离，可以
有效的降低产品分离成本。
缺点：
（1）生产劳动强度较大，占地面积大，不宜自动化生产。 （2）周期长。 （3）培养过程中环境条件控制较难。 （4）生产过程中，由于无菌程度较低，其菌种不纯。
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（3）种子罐级数的确定 种子罐级数：是指制备种子需逐级
扩大培养的次数，取决于：
菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖 速度；
所采用发酵罐的容积
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✓ 细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少， 二级发酵。 茄子瓶→种子罐→发酵罐
✓ 霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液→一级种子罐（27˚C,40小时孢子 发芽，产生菌丝 ）→二级种子罐 （ 27˚C,10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌 丝体）→发酵罐
为每次发酵罐的投料提供相当数量的 代谢旺盛的种子。
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种子扩大培养定义
种子扩大培养：是指将保存在砂土管、 冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种 接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇 瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数 量和质量的纯种过程。
这些纯种培养物称为种子。
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种子制备的过程大致可分为：
实验室种子制备阶段 生产车间种子制备阶段
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1.实验室种子制备 实验室种子的制备一般采用两种方式
固体培养基培养孢子 液体培养法
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2.生产车间种子制备
（1）种子罐的作用：
种子罐
主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌 （丝）体，接入发酵罐能迅速生长， 达到一定的菌体量，以利于产物的 合成。
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（2）种子罐接种： 微孔接种法 火焰保护法 压差法
缩写
ISF
CACC SIA AS CFCC CICC CMCC NICPB CVCC YM
名称 中国农业科学院土壤肥料研究 所 抗菌素菌种保藏管理中心 四川抗菌素工业研究所 中国科学院微生物研究所 林业微生物菌种保藏管理中心 工业微生物菌种保藏管理中心 医学微生物菌种保藏管理中心 卫生部药品生物制品监察所 兽医微生物菌种保藏管理中心 云南省微生物研究所
的一个方面
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（4）种龄
种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐 或发酵罐时的培养时间。 种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。 原则：对数生长期，细胞活力强，菌体浓度相对较大， 但是最终由实验结果定。
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（5）接种量
移入种子的体积 接种量＝ —————————
接种后培养液的体积
接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长 繁殖的速度。
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国外重要菌种保藏机构
1、ATCC：美国模式培养物（菌）保藏中心 2、NRRL：美国农业部北方开发利用研究部 3、CSH：美国冷泉港研究所 4、IAM：日本东京大学应用微生物研究所 5、IFO：日本发酵研究所（大阪） 6、NCTC：英国国立标准菌种收藏所 7、CBS：荷兰真菌中心保藏所
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第二节 工业微生物种子的扩大培养 菌种扩大培养的目的：
通常接种量，细菌1~5%，酵母菌5~10%， 霉菌7~15%、有时20~25%。
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3、发酵工业种子培养
⑴静置培养法（厌气性发酵）； ⑵通气性培养（好气性发酵）；
作为种子扩大培养的方法： ① 表面培养法 ② 固体培养法 ③液体培养法（三角瓶摇床震荡或转式培养）； ④载体培养法
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固体培养法（曲法培养）
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最常用的工业微生物
霉菌 曲霉属 米曲霉 黑曲霉 青霉属 青霉菌：点青霉、产黄青霉 桔青霉 根霉属 德氏根霉 米根霉、小麦曲根霉 红曲霉属 紫红曲霉
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最常用的工业微生物
放线菌
链霉菌属 小单孢菌属 地中海诺卡氏菌 米苏里游动放线菌
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微生物工业对菌种的要求
能在廉价原料制备的培养基上迅速生长 和生成所需的代谢产物产量高。
培养条件易于控制 生长迅速，发酵周期短 满足代谢控制的要求 抗噬菌体能力强 菌种不易变异退化 安全性（不是病源菌，不产毒素）
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微生物菌种保藏机构名称和缩写
中国 缩写
ACCC
SH IA CCGMC AS-IV CAF IFFI ID IV CIVBP
名称
中国农业微生物菌种保藏管理中心
上海市农业科学院食用菌研究所 中国医学科学院抗菌素研究所 普通微生物菌种保藏管理中心 中国科学院武汉病毒研究所 中国林业科学院菌种保藏管理中心 轻工业部食品发酵工业科学研究所 中国医学科学院皮肤病研究所 中国医学科学院病毒研究所 中国兽医药品监察所
几种深层培养法
①放大法 ②两步法 ③控制培养法 ④分批培养法(间歇发酵法) ⑤连续培养法 ⑥补料分批培养法(流加法)
✓ 放线菌：生长更慢，采用四级发酵 ✓ 酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用
一级种子
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确定种子罐级数需注意的问题
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响 种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会； 级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一
般2-4级。 在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要