植物叶绿素类胡萝卜素测定方法
植物叶绿素类胡萝卜素测定方法
叶绿素、类胡萝卜素含量的测定一、原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收,利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度,即可用公式计算出提取液中各色素的含量;根据朗伯—比尔定律,某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C 和液层厚度L成正比,即A＝αCL式中：α比例常数;当溶液浓度以百分浓度为单位,液层厚度为1cm 时,α为该物质的吸光系数;各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得;如果溶液中有数种吸光物质,则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和;这就是吸光度的加和性;今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量,只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A,并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度;在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰,所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰;二、材料、仪器设备及试剂一材料：新鲜或烘干的植物叶片;二仪器设备：1分光光度计；2电子顶载天平感量；3研钵；4棕色容量瓶； 5小漏斗；6定量滤纸；7吸水纸； 8擦境纸；9滴管;三试剂：195%乙醇或80%丙酮v丙酮：v乙醇=2：1的95%水溶液；2石英砂；3碳酸钙粉; 暗中2h,,25ml三、实验步骤1取新鲜植物叶片或其它绿色组织或干材料,擦净组织表面污物,剪碎去掉中脉,混匀;2将取好的样品放入25ml容量瓶中,加混合浸提液无水乙醇:丙酮=5:520ml,放在黑暗条件下,浸泡至叶片发白,用浸提试剂定容至25ml,摇匀备用;3把叶绿体色素提取液倒入1cm光径的比色皿内,以浸提试剂为空白测定吸光度;选择波长663 646 和470nm;四、实验结果计算叶绿素a 的浓度 = OD 633 – OD 646叶绿素b 的浓度 = OD 646– OD 663类胡萝卜素浓度=÷229 单位 mg/L Cmg/L 提取液总量ml叶绿体色素含量mg/g= ____________________________ 烟叶重量g1000注意事项：操作避光研磨时间短些。
叶绿体色素的提取与分离、理化性质及含量测定 3
叶绿体色素提取分离与理化性质及含量测定▪（一）实验目的及意义▪（二）实验原理▪（三）实验步骤▪（四）实验报告实验目的和意义▪绿色植物的光合作用是在叶绿体中的叶绿体色素中进行的，了解叶绿体色素的组成、性质及测定对于理解光合作用的本质很有帮助。
▪因此，测定叶绿素含量便成为研究光合作用与氮代谢必不可少的手段，在作物育种、科学施肥、看叶诊断中有着广泛的应用叶绿体在细胞中运动视频叶绿体在细胞中的分布与结构类囊体膜的结构及功能实验原理植物叶绿体色素是吸收太阳光能，进行光合作用的重要物质。
它一般由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。
这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。
实验原理▪色素分离的方法有多种，纸层析是最简便的一种。
当溶剂（有机推动剂）不断从纸上流过时，由于混合物（叶绿素提取液）中各种成分在固定相（滤纸纤维素所吸附的水分）和流动相（有机推动剂）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。
▪叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。
实验原理▪叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。
叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。
叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。
▪叶绿素中的镁可以被氢离子所取代而成褐色的去镁叶绿素。
去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。
实验步骤(1)▪根据朗伯一比尔定律，某有色溶液的吸光度D与其中溶液浓度C和液层厚度L成正比，即：▪D＝KCL▪D：吸光度，即吸收光的量，C：溶液浓度, K：为比吸收系数（吸光系数），L：液层厚度，通常为1cm.▪如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。
植物生理学实验-叶绿体色素的定量测定
植物生理学实验
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2、测定光密度
以96%乙醇为空白，比色测定3份样品的光密度；
波长665nm、649nm和470nm
B126室：分光光度计 型号：22PC
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分光光度计的使用：？
功能键
显示屏
样品室
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波长调节旋钮
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测定溶液加到 比色杯的2/3初
空白对准光路
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植物生理学实验
叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光 谱有差异。在使用不同溶剂提取色素时， 计算公式有所不同。
本实验以 96％乙醇为例。
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96％乙醇提取
已知叶绿素a、b的96%乙醇提取液在红光 区的最大吸收峰：a＝665nm；b＝649nm
根据有色物质的加和性，建立方程组： D665=Kaλ665 Ca+ Kbλ665 Cb D649=Kaλ649 Ca+ Kbλ649 Cb
Ka645＝ 16.75 Kb645＝ 45.60
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植物生理学实验
根据加和性原则列出以下关系式： D663 = 82.04Ca+9.27Cb D645 = 16.75Ca+45.60Cb
解方程组得：
Ca (mg/L)= 12.72D663 – 2.59D645 Cb (mg/L)= 22.88D645 – 4.67D663 Ca与Cb相加即得叶绿素总量（CT）： CT (mg/L)= Ca + C整b理课=件20.29D645 + 8.05D663
Enter 输入键，接受当前的状 态或进行测定；
Mode 功能键，按该键显示不 同的功能菜单；
2、测定
实验三十四植物叶绿体色素的提取、分离、表征及含量测定
实验三十四植物叶绿体色素的提取、分离、表征及含量测定摘自王尊本主编,综合化学实验(第二版),第226-244页,北京:科学出版社,2007年9月。
实验三十四植物叶绿体色素的提取、分离、表征及含量测定[1-27]一、叶绿体色素的提取(一) 实验目的1)掌握有机溶剂提取叶绿体色素等天然化合物的原理和实验方法。
2)了解皂化-萃取提取胡萝卜素的原理。
3)了解1,4-二氧六环沉淀法提取叶绿素的原理。
(二) 实验原理植物光合作用是自然界最重要的现象,它是人类所利用能量的主要来源。
在把光能转化为化学能的光合作用过程中,叶绿体色素起着重要的作用。
高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类,主要包括叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素四种。
它们所呈现的颜色和在叶绿体中含量大约比例见表34.1。
表34.1 高等植物体内叶绿体色素的种类、颜色及含量项目叶绿素类胡萝卜素叶绿素a 叶绿素b 胡萝卜素叶黄素颜色蓝绿色黄绿色橙黄色黄色在叶绿体内各色素含量比例 3 1 2 13 1 叶绿素chlorophylls是叶绿酸的酯,它在植物进行光合作用中吸收可见光,并将光能转变为化学能。
叶绿素是植物进行光合作用所必需的催化剂。
在绿色植物中叶绿素主要以叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素b(C55H70O6N4Mg)两种结构相似的形式存在,其差别仅是叶绿素a中一个甲基被叶绿素b中的甲酰基所取代。
叶绿素的基本结构见图34.1。
在叶绿素分子结构中含有四个吡咯环,它们由四个甲烯基联结成卟啉环,在卟啉环中央有一个镁原子,它以两个共价键和两个配位键与4个吡咯环的氮原子结合成内配盐,形成镁卟啉。
在叶绿素分子中还有两个羧基,其中一个与甲醇酯化成COOCH3,另一个与叶绿醇酯化成COOC20H39长链。
类胡萝卜素carotenoids是一类不饱和的四萜类碳氢化合物(例如胡萝卜素,carotenes,或它们的氧化衍生物(例如叶黄素类,xanthophylls。
植物体叶绿素含量的测定实验报告
实验报告植物体叶绿素含量的测定摘要：本实验采用分光光度法，利用95%乙醇提取菠菜叶片中和番茄叶片中叶绿体色素，叶绿素a ，叶绿素b 和类胡萝卜素最大吸收峰的波长分别是665nm 、649nm 和470nm 。
根据分光光度计测定的吸光度值，从而计算出乙醇提取液中叶绿体色素含量。
实验原理：利用95%乙醇提取叶绿体色素，叶绿素a ，叶绿素b 和类胡萝卜素最大吸收峰的波长分别是665nm 、649nm 和470nm 。
根据分光光度计测定的吸光度值，可以计算出乙醇提取液中叶绿体色素含量。
实验目的：掌握分光光度计法对叶绿素a 、叶绿素b 、叶绿素总浓度和类胡萝卜素总浓度测定和计算的方法。
实验材料：生物材料：菠菜叶片0.25g ，自己培养的全素番茄苗叶片0.2g ，缺磷番茄苗叶片0.2g ；试剂：95%乙醇、石英砂、碳酸钙；仪器：分光光度计、电子天平、研钵、漏斗、玻璃棒、小烧杯、10ml量筒、50ml 容量瓶、剪刀、滤纸、滴管。
实验步骤：1.叶绿体色素的提取取新鲜菠菜叶片0.25g ，擦干，去中脉，剪碎放入研钵，加入少许石英砂和CaCO 3，再加入95%乙醇3ml,研磨成匀浆，再加95%乙醇10ml ，静置10min ，用漏斗滤去残渣，用乙醇反复冲洗研钵、残渣至无色；用容量瓶定容至50ml 。
2.吸光度的测定取光径1cm 比色杯，注入上述叶绿素提取液，以95%乙醇注入另一同样的比色杯内作为空白对照，在波长665、649、和470nm 下测定吸光度。
3.结果计算依据下列计算公式，分别计算出叶绿素a 、B 的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的浓度。
C a （叶绿素a ）=13.95A 665 – 6.8A 649C b （叶绿素b ）=24.96A 649 – 7.32A 665C T （叶绿素）=C a +C b =18.16A 649 + 6.63A 665C x.c （类胡萝卜素）=(1000A 470 – 2.05C a -114.8C b )/248叶绿体色素含量 = ）样品鲜重（稀释倍数）提取液体积（）色素浓度（g /mg ⨯⨯L L实验结果：菠菜叶片提取液吸光值：1、测定叶绿素ab为什么选用红光波长？叶绿素吸收红光和蓝紫光，故有两个吸收峰，光合色素还有类胡萝卜素，只吸收蓝紫光，所以不能选蓝紫光区测定，否则被类胡萝卜素干扰，只能用红光。
叶绿体色素定量测定及性质实验报告-叶绿素的定量测定
.取两支试管，向一支试管中加入 5mL 叶绿体色素提取液，然后将其 存在的问题，改进栽培方式，提高产量，这对于农业生产有很大的现实意
一部分倒入另一支试管中，作为对比。向试管里加入 1~2 滴 0.5mol/L HCl 义；在水体治理中，通过测定叶绿素含量，了解水中植物的光合能力，借
后摇匀。
此查找治理方案。总之，测定植物叶片叶绿素含量对于我们生产实践具有
光物质〔稀溶液〕时，其吸光值与吸光物质的浓度 C 及汲取层厚度 d 成正
式中，C、Cb 和 Cx·c 分别为叶绿素、b 和类胡萝卜素的浓度。
比，及=KCd。
2、叶绿素理化性质鉴定
假如溶液中含有数种吸光物质，则混合液在某一波长下的总吸光值等
叶绿素是一种双羧酸，其中一个羧基被甲醇所酯化，另一个被叶醇所
于各组分在此波长下吸光值的总和。如欲测定叶绿素混合提取液中叶绿素、 酯化。故可与碱起皂化反应而生成醇〔甲醇和叶绿醇〕和叶绿素的盐。皂
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叶绿体色素定量测定及性质实验报告:叶绿素的定量 测定
应选择叶绿素在红光区的最大汲取峰。 已知叶绿素、b 分别 663nm 和 645nm〔80％丙酮提取〕有最大汲取值；
同时已知在波长 663nm 下，叶绿素、b 汲取系数分别为 82.04 和 9.27；在
4、在分管光度计上，分别测定 663nm，645nm 和 470nm 处的吸光值，
夹，酒精灯。
以 80％丙酮为空白对比。
2、试验试剂：80％丙酮，纯丙酮，碳酸钙，20％KOH 甲醇溶液，苯，
5、结果计算
0.5molmol/L?HCl，醋酸铜粉末。
按原理中的公式分别计算叶绿素、b 和类胡萝卜素的浓度〔mg/L〕，
叶绿素测定分光光度法
叶绿体色素含量的测定——分光光度法叶绿体色素含量的测定——分光光度法叶绿体色素溶液各组成成分在可见光谱中具有不同的特征吸收峰。
因此，应用分光光度计在某一特定波长下所测定的吸光度，根据经验公式即可计算出色素溶液中各色素浓度，不同溶剂所提取的色素吸收光谱有差异，因此，应使用不同的计算公式。
叶绿体色素的提取常用丙酮和乙醇有机溶剂。
叶绿体色素80 ％丙酮提取液中叶绿素a 和 b 及类胡萝卜素分别在663nm 、646nm 和470nm 波长下有最大吸收峰，而95 ％乙醇提取液中它们则在665nm 石49nm 和470nm 波长下具有最大吸收峰，据此所测得的吸光度值代人不同的经验公式（见结果计算），计算出叶绿体色素丙酮（或乙醇）提取液中叶绿素 a 和 b 的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的总浓度，并依据所使用的单位植物组织（鲜重、干重或面积），求算出色素的含量。
[ 实验目的]掌握分光光度法对植物叶绿体色素提取液中叶绿素 a 和 b 的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的总浓度测定与计算方法，以及植物材料中各种色素含量的求算方法。
[ 器材和试剂]1 ．植物材料新鲜（或烘干）植物叶片，如菠菜叶片等。
2 ．实验器材分光光度计、天平、研钵、剪刀、漏斗、滤纸、棕色容量瓶、吸水纸、擦镜纸和滴管。
3 ．实验试剂80 ％丙酮（或95 ％乙醇）、石英砂和碳酸钙粉。
[ 操作步骤］1 ．色素的提取①称取新鲜（或干材料）的洗净擦于的植物叶片0.5g （或一定面积），去中脉、剪碎后放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2~3ml80 ％丙酮（或95 ％乙醇），冰浴中研磨至组织变白，再加丙酮10ml ，研成匀浆，暗处静置约10m in 。
②将提取液过滤到50 ml 棕色容量瓶中，用丙酮反复冲洗研体与研棒数次并用少量丙酮反复冲洗滤纸和残渣，直至无绿色为止，以使色素全部转移入容量瓶。
最后用丙酮定容至50 ml ，摇匀，并保存于暗处备用待测。
生理指标的测定2
1 色素含量的测定（叶绿素、类胡萝卜素）采用95%乙醇浸泡法（李合生，2000），称取剪碎的新鲜样品0.1g放入试管中，取95%乙醇15ml，在黑暗条件下浸泡24h，期间摇晃2-3次，至叶片表面变白，取上清液，在波长665nm、649nm、470nm下测定吸光度。
计算公式：叶绿素a（mg/L）=13.95*OD665－6.88*OD649叶绿素b（mg/L）=24.96*OD649－7.32*OD665总叶绿素=（6.63* OD665+18.08* OD649）*15/100类胡萝卜素（mg/L）=（1000OD470－2.05C a－114.8C b）/245色素含量（mg/g）=（色素浓度×提取液体积×稀释倍数）/样品鲜重2 细胞膜透性的测定取新鲜样品1g放入试管中，取25ml蒸馏水，浸泡1h，测得此时电导率值a，再至于沸水浴中处理15min，冷却至室温，测得电导率值b，细胞膜透性=a/b。
注意：煮后一定要冷却到室温才测，可以用冰，煮过后值大致相同。
3 组织含水量的测定4 类黄酮及总酚含量的测定取1g样品（一般用粉末），加入1%的盐酸甲醇溶液（量取27ml分析纯盐酸用分析纯甲醇定容到1000ml）25ml，浸提2h，过滤到50ml容量瓶中，用盐酸甲醇溶液定容到刻度，在325nm和280nm进行比色，分别测定类黄酮和总酚的含量。
4.1.4.8多酚氧化酶(PPO)的测定方法粗酶液的制备:称取西兰花花蕾部分1.0g，加入磷酸缓冲液印pH6.8,0.05m。
比,含l%聚乙烯毗咯烷酮)20mL,冰浴匀浆,离心Zomin(r0000Xg,4oC),上清液即为粗酶液。
酶活性测定:磷酸缓冲液印H6.8,0.05m川几)1.5mL,加入0.1mo比儿茶酚底物2.0mL,35℃保温巧min;再加入0.5mL酶液后迅速混匀,每隔105记录吸光度值灿2。
的变化,共记录3min,试验重复3次。
酶活性以U德.min表示,以翰。
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叶绿素、类胡萝卜素含量的测定
??? 一、原理
??? 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A 与其中溶质浓度C 和液层厚度L 成正比，即A ＝αCL 式中：α比例常数。
当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm 时，α为该物质的吸光系数。
各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。
这就是吸光度的加和性。
今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a 、b 和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A ，并根据叶绿素a 、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。
在测定叶绿素a 、b 时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
???? 二、材料、仪器设备及试剂
??? （一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。
??? （二）仪器设备：1）分光光度计；2）电子顶载天平（感量0.01g ）；3）研钵；4）棕色容量瓶；? 5）小漏斗；6）定量滤纸；7）吸水纸； 8）擦境纸；9）滴管。
??? （三）试剂：1）95%乙醇（或80%丙酮）（v 丙酮：v 乙醇=2：1的95%水溶液）；2）石英砂；3）碳酸钙粉。
暗中2h ，0.5g ，25ml
??? 三、实验步骤
??1）取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。
??2)将取好的样品放入25ml 容量瓶中，加混合浸提液（无水乙醇:丙酮=5:5）20ml ，放在黑暗条件下，浸泡至叶片发白，用浸提试剂定容至25ml ，摇匀备用。
3）把叶绿体色素提取液倒入1cm 光径的比色皿内，以浸提试剂为空白测定吸光度。
选择波长663 646 和470nm 。
??? 四、实验结果计算
叶绿素a 的浓度 = 12.21 ? OD 633 – 2.81 ? OD 646
叶绿素b的浓度 = 20.13 ? OD
646– 5.03? OD
663
类胡萝卜素浓度=（1000A470-3.27C a-104C b）÷229 单位mg/L
C(mg/L)*提取液总量（ml）
叶绿体色素含量（mg/g）= ____________________________
烟叶重量（g）*1000
注意事项：操作避光研磨时间短些。