基因组测序流程介绍中科院计算所生物信息学试验室共27页文档
二代基因测序流程和试剂
二代基因测序流程和试剂（原创实用版）目录1.二代基因测序的概述2.二代基因测序的流程3.二代基因测序的试剂4.二代基因测序的应用领域5.我国二代基因测序的发展状况正文二代基因测序的概述二代基因测序，也称为下一代基因测序（NGS），是继 Sanger 测序之后发展起来的一种高效、快速的基因测序技术。
二代基因测序技术具有高通量、低成本、高精度等特点，使得基因测序在全基因组测序、转录组测序、基因表达谱分析等领域得到广泛应用。
二代基因测序的流程二代基因测序的流程主要分为以下几个步骤：1.样品准备：将待测样品提取出 DNA，并进行质量和浓度检测。
2.文库构建：将 DNA 片段进行断裂、末端修复、连接接头、PCR 扩增等步骤，构建出文库。
3.测序：将文库片段进行高通量测序，通常采用 Illumina、PacBio、Oxford Nanopore 等技术。
4.数据处理：对测序得到的原始数据进行质量控制、去除接头序列、过滤低质量序列等步骤，得到高质量的序列数据。
5.数据分析：将高质量的序列数据进行比对、拼接、注释等步骤，得到最终的测序结果。
二代基因测序的试剂二代基因测序所需的试剂主要包括：DNA 提取试剂盒、文库构建试剂盒、PCR 扩增试剂、测序反应试剂等。
其中，文库构建试剂盒通常包括末端修复酶、连接酶、接头等。
PCR 扩增试剂包括引物、dNTPs、缓冲液等。
测序反应试剂包括测序平台特定的测序反应液、模板 RNA、酶等。
二代基因测序的应用领域二代基因测序技术在多个领域得到广泛应用，包括：基因组学、转录组学、表观遗传学、基因表达谱分析、基因突变检测、病原体检测等。
在基因组学领域，二代基因测序可以进行全基因组测序，揭示物种的基因组结构和功能；在转录组学领域，二代基因测序可以进行转录组测序，研究不同组织、不同发育阶段、不同处理条件下基因的表达情况。
我国二代基因测序的发展状况我国在二代基因测序领域取得了显著的发展。
2014 年初，国家卫计委和食药监督管理总局共同出台文件叫停二代基因测序服务，并着手推进试点工作。
基因组测序技术
Maxam-Gilbert测序法的特异断裂
化學法
32P 32P
断裂处
ATCGATCG ATCG
断裂处
AT
ATCGATCGAT
32P
ATCGAT
無放射線片段 不能顯像
Specific Reaction to G
Maxam-Gilbert 法所用的化学技术：
• G反应（在G 残基上的裂解） ： DMS使鸟嘌呤的7位氮 原子甲基化，其后断开第8位碳原子和第9位氮原子间的 化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。 • G+A反应（在嘌呤残基上的裂解） ： 甲酸使嘌呤环上的 氮原子质子化，削弱了腺嘌呤脱氧核糖核苷酸和鸟嘌呤 脱氧核糖核苷酸中的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。 • T+C反应（在嘧啶残基上的裂解） ： 肼断开了嘧啶环， 产生的碱基片段能被哌啶所置换。
测序步骤：
①用M13噬菌体做载体获得单链DNA模板，克隆并扩增 待测DNA片段，使其变性。 ②选择一条与DNA单链互补的短链引物，将引物用放 射性同位素标记。 ③引物先同单链模板复性。 ④在四个反应管中分别加入待测DNA单链模板、互补 引物分子、四种的dNTP、DNA聚合酶(Klenow 酶)以 及不同的ddNTP。 ⑤进行聚合反应 ，DNA新生链延长，当掺入ddNTP时， 聚合反应终止。 ⑥在聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶中电泳。 ⑦根据X底片对凝胶曝光所显的条带位置，读出 DNA 序列。
荧光标记物
ddATP
ddTTP
ddGTP
ddCTP
பைடு நூலகம்
聚合反应及产物
5ˊ P DNA聚合酶， dATP，dTTP， dGTP，dCTP
HO
ddATP ddGTP
OH 3ˊ P 5ˊ
测序原理及流程图
测序原理及流程图
测序原理
目前关于测序方法主要采用双脱氧链终止法，双脱氧链终止法又称为Sanger法，其原理是DNA模板在DNA聚合酶、引物、四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)存在下进行复制时，在四管反应体系中分别按一定的比例引入四种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。
由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’-OH基团，当ddNTP掺入链的末端时，该链就会停止延伸。
如此每管反应体系中就产生了一系列长度不等的以ddNTP为3’端的DNA片段。
反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳以分离长短不一的DNA片段，相邻的片段长度相差一个碱基。
经放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可获得合成片段的碱基排列顺序。
我们使用的是ABI3730测序仪以及配套的BigDye Terminator Kit，original v3.1我公司目前采用Applied Biosystems 3730XL测序仪是高质量的长片段读取和序列分析的测序平台，应用灵活而广泛。
3730XL可同时分析96个样品，该仪器采用4色荧光同时检测，可不间断24小时运行，自动灌胶，上样，电泳分离，检测及数据分析。
测序流程图。
二代基因测序流程和试剂
二代基因测序流程和试剂的步骤和流程引言二代基因测序是一种高通量、高效率的基因测序技术，能够大规模地获取DNA或RNA的序列信息。
本文将详细描述二代基因测序的流程和试剂的步骤和流程，确保流程清晰且实用。
流程概述二代基因测序的流程可以分为样品准备、DNA或RNA提取、文库构建、聚合酶链式反应（PCR）、测序和数据分析等步骤。
下面将详细介绍每个步骤的具体操作和试剂使用。
1. 样品准备样品准备是整个二代基因测序流程的关键步骤，合理的样品准备可以保证后续步骤的顺利进行。
样品可以是组织、细胞、血液等，需要根据研究目的进行选择。
样品准备的步骤包括：1.1 样品收集根据研究目的选择合适的样品，并采用合适的方法进行收集。
例如，对于组织样品，可以通过手术获取；对于细胞样品，可以通过培养或离心分离等方法获取。
1.2 样品保存采集后的样品需要及时保存，以防止样品质量的降低。
常用的保存方法包括冷冻保存和固定保存。
冷冻保存可以使用液氮保存或低温冰箱保存，固定保存可以使用甲醛等试剂进行固定。
2. DNA或RNA提取DNA或RNA提取是获取样品中的核酸的关键步骤，常用的提取方法包括酚-氯仿法、盐酸法和商用试剂盒法等。
下面以商用试剂盒法为例进行介绍：2.1 样品裂解将样品加入裂解缓冲液中，通过离心等方法使细胞或组织破碎，释放出DNA或RNA。
2.2 蛋白酶处理加入蛋白酶将样品中的蛋白质降解，以便后续纯化DNA或RNA。
2.3 DNA或RNA纯化将裂解液加入商用试剂盒中，通过离心等方法将DNA或RNA与其他杂质分离。
根据试剂盒的不同，可以使用硅胶膜或磁珠等材料进行纯化。
2.4 洗脱DNA或RNA将纯化后的DNA或RNA从硅胶膜或磁珠上洗脱下来，得到纯化后的DNA或RNA。
3. 文库构建文库构建是将提取到的DNA或RNA转化为测序所需的文库，常用的文库构建方法包括PCR文库构建法和片段文库构建法。
下面以PCR文库构建法为例进行介绍：3.1 DNA片段制备将提取到的DNA通过限制性内切酶或超声波等方法制备成适当的片段。
基因组测序方法和流程
基因组测序方法和流程基因组测序是一种重要的分子生物学技术，用来确定生物个体的全基因组序列。
下面将介绍几种常见的基因组测序方法和其流程。
Sanger测序方法Sanger测序是最早被广泛应用的测序方法之一。
它通过DNA链终止反应来测定DNA序列。
Sanger测序的流程如下：1. DNA片段的扩增：通过聚合酶链反应(PCR)或其他扩增方法，将待测序的DNA片段扩增。
2. 序列反应：将DNA片段与DNA聚合酶、起始引物和四种特殊的二进制核苷酸（即各种类型的氮碱基）一起反应，使DNA聚合酶在复制DNA过程中停止。
这些停止的位置代表了DNA序列中的不同碱基。
3. 凝胶电泳：将反应产物经过凝胶电泳分离，根据酶在不同位置停止的情况，可以逐个测定DNA序列。
454测序方法454测序是一种高通量测序技术，利用酶依赖法合成技术进行测序。
其流程如下：1. DNA片段的制备：将待测序的DNA片段通过PCR扩增，得到大量的DNA片段。
2. 测序反应：将DNA片段与特殊的引物和酶（即磷酸巯基核苷酸转化酶）一起反应，使每个DNA片段在酶的作用下合成一链自由的DNA。
3. 测序仪读取信号：将反应产物加载至测序仪中，通过光学信号或电信号读取DNA合成时释放的磷酸巯基核苷酸的数目和位置，从而确定DNA序列。
Illumina测序方法Illumina测序是当前最常用的高通量测序技术之一。
其流程如下：1. DNA片段的制备：将待测序的DNA片段通过PCR扩增，得到大量的DNA片段。
2. 测序反应：将DNA片段和两种特殊的引物一起反应，引物与DNA片段的一端连接，形成桥式PCR产物。
然后，引物依次结合并延伸DNA链，生成补充DNA链。
3. 测序仪读取信号：将反应产物加载至测序仪中，通过荧光信号的强度和位置来确定DNA序列。
测序方法是一种基于单分子实时测序技术的测序方法。
其流程如下：1. DNA片段的制备：将待测序的DNA片段通过PCR扩增，得到大量的DNA片段。
生物信息学中基因测序技术使用教程与方法论
生物信息学中基因测序技术使用教程与方法论基因测序技术在生物信息学研究领域具有重要的应用价值，可以揭示基因组结构和功能。
本文旨在介绍基因测序技术的使用教程和方法论，以帮助研究人员高效地利用这一技术并获取可靠的数据结果。
一、介绍基因测序技术基因测序是指通过对DNA或RNA进行测序，以获取DNA或RNA序列的方法。
它是生物信息学研究的重要工具，可以揭示基因组的遗传信息。
目前常用的基因测序技术主要包括Sanger测序、二代测序和三代测序。
1. Sanger测序Sanger测序是第一代测序技术，也是目前最可靠和最常用的测序方法之一。
它基于DNA聚合酶和链终止剂的作用原理，通过不断复制DNA链、添加不同的荧光标记链终止剂来测定序列。
Sanger测序适用于短序列的测定，常用于小规模基因测序、验证测序以及检测特定位点突变等。
2. 二代测序二代测序是指新一代高通量测序技术，其主要特点是高效、高通量并且成本较低。
其中最常用的技术包括Illumina 测序、Ion Torrent 测序和 SOLiD 测序。
二代测序的基本原理是将DNA片段固定在测序芯片上，并且利用高效的平行测序技术进行测序，从而实现大规模基因组测序。
二代测序适用于大规模基因组测序、全基因组关联分析和转录组测序等。
3. 三代测序三代测序是近年来发展起来的新型测序技术，其具有高通量、高速度和长序列的特点。
常见的三代测序技术包括PacBio测序和Nanopore测序。
与二代测序相比，三代测序可以获得更长的读长和更完整的基因组信息，具有更高的分辨率和敏感性。
三代测序适用于长序列的测定、分析基因组结构和功能以及检测基因变异等。
二、基因测序技术使用教程1. 实验前的准备工作在进行基因测序之前，需要对样本进行提取和纯化，并确定实验所要使用的测序技术。
对于Sanger测序，通常需要进行PCR扩增和净化；对于二代和三代测序，通常需要进行文库构建和DNA片段测序。
2. 基本实验步骤基因测序的基本实验步骤包括样品准备、文库构建、片段测序、数据分析和结果解读。
基因组测序与序列组装讲课文档
基因的不连续性
Intron 和Exon:
大多数真核生物蛋白 质基因的编码顺序 (Exon)都被或长或短 的非编码顺序(Intron) 隔开
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基因家族
一群具有一致的或相似顺序的基因,有的还担负类似的生 物学功能, 可以相互补偿, 比如:E2f transcripti EST为基因的编码区,不包括内含子和基因间区域,一次 测序的结果足以鉴定所代表的基因;
现在三十八页，总共三十九页。
本章内容结束，谢谢!
现在三十九页，总共三十九页。
其读码结构互不相同
---ATG-----//------AATGCC ----//---ATAACG---//--TAA---A*
ATGCCN----NNATAA B
现在十三页，总共三十九页。
*部分重叠 如：K和C
*两个基因共用少数
碱基对 如：D和J
D 终止密码子 -------TAATG-------
5 G TTAG ATC
1 ATAC G TTA
3 TACGTTAG
4 ACGTTAGA
2
C G TTAG AT
5
G TTAG ATC
计算机分析杂交图象 并由探针的重叠情况 推导样品的核酸序列
互 补 序 列 为 ： ATAC G TTAG ATC 样 品 序 列 为 ： TATG C A ATC TAG
Maxam-Gilbert 法所用的化学技术
碱基 G
A+G
C+T C
特异修饰方法
Ph8.0,用硫酸二甲酯对 N7进行甲基化,使 C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性
pH2.0 哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子化,从 而导致脱嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤 的糖苷键
全基因组测序实验流程
全基因组测序实验流程英文回答：Genome sequencing is a powerful technique used to determine the complete DNA sequence of an organism's genome. It provides valuable information about the genetic makeupof an individual or a species, allowing researchers tostudy the structure and function of genes, identifydisease-causing mutations, and understand evolutionary relationships.The process of whole-genome sequencing involves several steps. First, DNA samples are obtained from the organism of interest. These samples can be collected from blood, saliva, or tissue samples. Next, the DNA is extracted and purifiedto remove any contaminants. This ensures that the sequenced DNA is of high quality and free from interference.Once the DNA is purified, it is fragmented into smaller pieces. This can be done using physical methods, such assonication, or enzymatic methods, such as restriction digestion. The resulting DNA fragments are then ligatedwith adapters, which allow for the attachment of sequencing primers.The prepared DNA fragments are then amplified using a process called polymerase chain reaction (PCR), which produces multiple copies of the DNA fragments. This step is necessary to ensure that there is enough DNA for sequencing.The next step is sequencing the DNA fragments. Thereare several sequencing technologies available, including Sanger sequencing and next-generation sequencing (NGS). Sanger sequencing, also known as capillary electrophoresis sequencing, was the first method developed for DNA sequencing. It involves the use of fluorescently labeled nucleotides to determine the sequence of the DNA fragments.NGS technologies, such as Illumina sequencing andPacific Biosciences sequencing, have revolutionized thefield of genomics. These methods allow for the simultaneous sequencing of millions of DNA fragments, resulting in amuch faster and more cost-effective process.After sequencing, the raw data is generated in the form of short DNA sequences called reads. These reads are then aligned to a reference genome or assembled de novo to reconstruct the complete genome sequence. This step requires advanced bioinformatics tools and algorithms to accurately assemble the reads.Finally, the assembled genome sequence is analyzed to identify genes, regulatory elements, and other functional elements. This can involve comparing the genome sequence to known databases, predicting gene coding regions, and studying the genetic variation within the genome.中文回答：全基因组测序是一种强大的技术，用于确定生物体基因组的完整DNA序列。