植物基因工程操作论文.
基因工程在观赏植物花色育种中的应用专家论文
建议开展更为系统和全面的观赏植物花色遗传改 良研究，包括不同花色类型、不同基因型的花卉 材料等。
同时，应加强基因工程在观赏植物其他性状改良 方面的研究与应用，如抗逆性、抗病虫害等方面 ，以推动观赏植物育种事业的全面发展。
THANKS
基因工程在观赏植物花色育种中的发展趋势
未来基因工程在观赏植物花色育 种中将更加注重基础研究，探索 花色的形成机制和调控原理。
转基因技术将进一步发展，出现 更加高效、精准的基因编辑技术 ，为花色育种提供更为可靠的技
术手段。
基因工程与常规育种将更加紧密 结合，形成优势互补，提高育种 效率和品质，推动花卉产业的持
花色多样性对观赏 植物的重要性
国内外研究进展
国内外专家学者在基因工程和 观赏植物花色育种方面的研究
进展
基因工程技术手段的不断创新 和发展
花色修饰相关基因的发现和功 能研究取得一定成果
研究目的与任务
研究目的：利用基因工程技术手段，探讨观赏植物花色 修饰的新途径，培育出具有优良花色性状的新品种，为 观赏植物的遗传改良提供理论和技术支持。 搜集和筛选具有优良花色性状的观赏植物材料
基因工程在菊花花色育种中的应用
总结词
详细描述
多样性创造
菊花是一种具有高度多样性的观赏植物，基 因工程技术在菊花花色育种中的应用也取得 了很大的进展。通过转基因技术，科学家们 成功地创造了各种颜色的菊花，例如红色、 粉色、黄色、白色等。此外，基因工程还被 用于改善菊花的花期、增加花朵的大小和形
状，以及提高菊花的抗逆性。
通过基因工程技术手段，结合传统育种方法，创制具有 优良花色性状的新品种
研究任务 鉴定和克隆与花色相关的关键基因 验证新品种的花色性状及观赏价值，并进行推广应用。
基因工程论文
基因工程论文基因工程的概述和应用进展摘要：基因工程是一种利用转基因技术对生物体的基因进行改造和编辑的科学领域。
本论文旨在阐述基因工程的原理、方法和工具，并重点探讨其在农业、医学和环境领域的应用。
基因工程为人类提供了改良农作物、研发新药和解决环境问题的新途径，同时也引发了一系列伦理和安全问题。
本文将综述基因工程的优势和挑战，并对其未来发展进行展望。
一、引言基因工程作为一项新兴的科学技术，已经在农业、医学和环境领域取得了显著的进展。
通过改良生物体的基因，基因工程可以实现对生物体性状的控制和调整，为人类社会带来了巨大的潜力和机遇。
二、基因工程的原理和方法基因工程的核心在于对生物体的基因进行编辑和改造。
其中，基因克隆、基因转染和基因编辑是主要的基因工程技术。
基因克隆通过将感兴趣的基因序列插入到载体中，如质粒，然后将其导入宿主细胞中，实现对外源基因的操控。
基因转染则是将外源基因转入目标细胞或生物体中，以达到改变其性状的目的。
基因编辑则通过使用诸如CRISPR-Cas9等技术，直接改变生物体的基因序列，以实现对特定基因的编辑、删除或替换。
三、基因工程在农业领域的应用基因工程在农业领域的应用主要集中在农作物的改良上。
通过转基因技术，科学家们能够改良作物的抗病性、耐逆性和产量等性状，实现对农作物整体性状的优化和提升。
此外，基因工程还可以解决传统农业面临的问题，如除草剂抗性、杂草控制和育种加速等。
四、基因工程在医学领域的应用基因工程在医学领域的应用主要涉及基因治疗和新药开发。
通过改变人体细胞的基因序列，基因治疗可以治疗一些难治性疾病，如癌症和遗传性疾病。
同时，基因工程也为新药的开发提供了新的途径，通过对疾病相关基因的研究和操控，研发出针对特定疾病的靶向药物。
五、基因工程在环境领域的应用基因工程在环境领域的应用主要涉及生物修复和生物能源开发。
基因工程可以改造微生物，使其具备降解有害污染物的能力，从而用于生物修复。
此外，基因工程还可以改造植物和微生物，使其能够高效生产生物燃料，为可再生能源的开发做出贡献。
植物基因工程技术及其在制药业和农作物生产中的应用
植物基因工程技术及其在制药业和农作物生产中的应用植物基因工程技术是对植物基因进行人为干预以实现克服或改变某些特征，这种技术对于促进农业和医药领域的发展具有重要的意义。
文章将就相关植物基因工程技术以及在医药和农业领域的应用进行介绍。
1. 基因工程技术基因工程技术是指通过特定的方法，对生物基因进行修改和操作，以达到某种特定目的的技术。
在植物基因工程技术中，主要涉及基因克隆与转化、基因敲除和定向版本编辑技术等。
基因克隆与转化技术是植物基因工程技术的基础。
通过该技术可以将外源基因转入植物体内，进而实现对目标植物的改造。
这种技术将目标基因通过相应载体转入宿主细胞，随后发挥其功能，从而实现植物转化。
这项技术已经被广泛应用，例如将人类重组蛋白合成基因转入蔗糖甘蔗，制备成人源性凝血因子Ⅷ。
基因敲除技术是指通过物理、化学或生物手段，对特定的基因进行抑制或清除，进而实现植物性状的改变。
这种技术可以控制植物中某些负面的性状，例如提高食品中抗氧化物含量，降低植物体内有害毒素含量等。
常见的基因敲除技术包括RNAi技术、TALENs技术和CRISPR/Cas9技术等。
定向版本编辑技术是指一种高效、精准、经济的基因编辑技术，通过直接操控基因编辑器来实现基因的编辑、添加和删除，其中最为常见的是CRISPR/Cas9技术。
这项技术可以实现精准的基因编辑，避免产生额外的突变和意外的副作用。
2. 植物基因工程技术在医药领域的应用植物基因工程技术在医药领域的应用目前相对较少，但受到了越来越多的关注。
在医药领域，植物基因工程技术主要应用于合成可能用于药物生产的复杂有机分子，例如抗癌药物阿霉素和紫杉醇。
同时，植物基因工程技术还可以用于生产用于治疗罕见病的药物。
2019年，澳大利亚生物技术公司Biotech Beyond昆士兰根据“稀有血症患者”VTEL1基因序列，利用DNA合成技术生产出人造遗传物质，并采用植物烟草生物反应器大规模制备人源性VTEL1蛋白，以治疗该病。
基因工程论文.doc
基因工程技术在植物方面的应用学号：081463116 姓名：马春旭摘要：通过基因工程改良品种在未来的农业生产中日益显示出巨大潜力。
尽管科学家们对转基因植物的争论仍在继续，但可以肯定的是，转基因植物作为一项新兴的生物技术的产物，在解决日益膨胀的地球人吃饭问题和在解决长期困惑人类发展的资源短缺、环境恶化、经济衰退三大难题中起着越来越重要的作用。
本文综述了基因工程技术在植物中的应用，就转基因植物的技术、发展、安全性和发展前景作了探讨。
关键词：基因工程技术；转基因植物；安全性；发展前景所谓转基因植物是指利用基因工程技术，在离体条件下对不同生物的DNA进行加工，并按照人们的意愿和适当的载体重新组合，再将重组DNA转入生物体或细胞内，并使其在生物体内或细胞内表达的植物。
自1983年首次获得转基因植物以来，转基因技术发展十分迅速，成功的转基因植物已达60多种，在世界上批准进入田间试验的转基因植物已超过500例。
1植物的转基因技术由于植物的体细胞具有全能性，即单个的细胞经过合适培养后可以生成完整的植株。
将分离能够编码所需产物的DNA片段克隆到适当的载体DNA中形成重组DNA，利用细菌繁殖扩增重组DNA并将重组DNA中的目的基因导入所需的培育的植物细胞中，筛选出所需要的细胞，通过细胞的全能性将转基因植株大规模种植。
其中外源基因导入植物细胞的方法可分为DNA直接转化和以载体为媒介的基因转化。
基因的直接转移是通过物理化学法将外源基因转入受体植物细胞的技术。
常用的方法有化学刺激法、脂质体法、显微注射法和基因枪法等。
其原理是利用物理化学方法暂时改变膜通透性，使DNA进入细胞，并最终整合到植物基因组中。
以载体为媒介的基因转化即使通过农杆菌或植物病毒介导感染受体植物将外源基因转入植物细胞的技术。
目前，载体法主要包括土壤农杆菌Ti质粒、Ri质粒及植物DNA病毒等介导的遗传转化法。
2转基因植物的筛选与检测通过转基因的方法将目的基因转入目的植物的细胞后，转化细胞与非转化细胞相比都只占少数，两者存在竞争，而转化细胞的竞争力通常比非转化细胞弱，因此必须对转化细胞进行筛选和检测。
基因工程技术在植物育种中的应用研究
基因工程技术在植物育种中的应用研究随着生物技术的发展，基因工程技术已经成为现代农业中不可或缺的重要手段。
通过基因工程技术，可以针对植物疾病抗性、耐旱、耐寒等特性进行改良，进一步提高植物的产量和品质，为全球粮食安全和生态环境保护做出了重要贡献。
本文将介绍基因工程技术在植物育种中的应用研究，探讨其在未来发展中可能面临的挑战和机遇。
一、基因工程技术在植物育种中的应用研究1、转基因作物转基因作物是通过改变植物基因来提高其产量和营养价值、抵抗病虫害等特性的一种农业技术。
转基因作物在全球范围内逐渐普及，并取得了显著的经济效益。
例如，玉米、大豆、棉花、番茄等农作物都已经被转基因改良，使其耐旱、抗虫害及抗草害等特性得到了增强。
在转基因作物中，最常用的基因工程技术是植物转录因子技术，通过研究植物在不同环境下的转录因子变化，来识别并控制植物某些基因的表达，以达到种质改良的目的。
2、基因组编辑技术基因组编辑技术也是一种重要的基因工程技术，在植物育种中的应用领域也越来越广泛。
它通过引入或删除基因片段来改造植物基因组，并实现对植物特征的控制。
例如，通过应用CRISPR/Cas9技术对植物基因进行定向编辑，可以使植物产生更好的品质、更高的产量、更强的抗性等特性。
同时，这种技术还可以应用于研究植物发育、细胞分化等生物学问题。
3、遗传多样性评估遗传多样性评估是一个重要的植物育种研究方向。
它通过对产地、品种、种类等植物样本进行DNA序列分析，针对不同植物特征进行遗传多样性评估，以确定植物材料的可变性和遗传关系。
这种技术可以帮助植物育种者在固有遗传多样性的基础上，更好地把握遗传演化规律，更好地引入优良基因，实现质量提高和品种选育等目标。
二、未来的机遇与挑战尽管目前基因工程技术在植物育种中已经取得了一定的成果，但是在未来的发展中，它仍然面临着一系列挑战和机遇。
1、技术开发当前，基因工程技术在植物育种中应用依旧存在技术瓶颈。
例如，目前的基因组编辑技术虽然能够通过对基因序列进行编辑，来实现植物的遗传改良，但是在具体实施过程中，往往会引起不可预知的遗传变异和代价等问题。
基因工程在植物育种中的应用(终稿)
2.3.2耐盐性 （1）盐渍土重成分复杂； （2）目前研究仍停留在模式植物阶段； （3）盐土作物耐盐性优良，产量、品质等不及淡土作物，开发成本高，利润低。 （4）耐盐遗传基础、代谢生理复杂，整体特性有很多亚特性决定，某些亚特性有可 能由不确定的一些基因决定。
2.3.3生物逆境抗性育种发展方向
植物逆境生理特性
1.3植物基因工程育种一般程序
植物的遗传 转化 载体系统及 其改造 目的基因的 获取 重组DNA 的制备
转基因植株 的鉴定
1.2 基因工程的基本操作程序
一、目的基因的获取
获取目的基因是实施基因工程的第一步。 目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因②利用PCR技术扩增目的基因 （变性，复性，延伸） ③通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成
二、基因表达载体的构建
4.过程: 质粒 DNA分子 同一种限制酶处理
一个切口 两个黏性末端
两个切口 获得目的基因
DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
5.基因表达载体的组成：
复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因
二、基因表达载体的构建
基因表达载体的组成： 目的基因、启动有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌 的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因 基因组基因
部分基因（如:cDNA）（一）从基因中获得目的基因法）
供体细胞中的DNA
颗粒形式
萌发、降解、释放
糊粉层、胚细胞
植酸钙镁（盐）
人畜不能消化
矿物质
植酸酶基因（烟曲霉菌）
直接排出 研究热点：增强植酸酶的热稳定性（籽粒加工）
减少植酸盐含量
Fe：铁缺乏是人类矿物质 缺乏的最普遍形式，它对世界 30%的人口产生影响（WHO， 1992）。补充铁元素的另一种 方法是增加以及细菌体内的铁 离子结合形成一种种子中与铁 离子结合的其他成分，如铁蛋 白，它能与植物、动物储备物 质。 处于发育阶段的水稻种子 中表达大豆铁蛋白基因，可使 铁离子含量增加2～3倍。 Zn、Se：取决于土壤，遗传 工程无能为力！！！
植物基因工程技术的研究与应用
植物基因工程技术的研究与应用植物基因工程技术是近年来飞速发展的生物技术领域之一。
它利用基因工程的原理和方法，对植物的基因进行修改和重组，使植物获得新的性状或功能。
植物基因工程技术在农业、医药和环境等多个领域具有广泛的应用前景。
本文将从基本原理、研究进展和应用领域等方面，详细介绍植物基因工程技术的研究与应用。
植物基因工程技术的基本原理主要包括基因克隆、基因转化和基因表达等环节。
首先，基因克隆通过PCR扩增等技术，将感兴趣的基因从自然界中分离出来。
然后，通过基因转化技术，将外源基因精确地导入目标植物细胞中，使其与植物基因组发生稳定的整合。
最后，通过适当的调控机制，使外源基因在目标植物中表达出来，实现新的性状或功能的产生。
随着分子生物学和生物技术的发展，植物基因工程技术取得了显著进展。
在基因克隆方面，PCR技术和基因库构建技术的不断完善，大大提高了外源基因的获取效率。
而基因转化技术方面，植物组织培养和农杆菌介导的基因转化技术已经成为常用的方法。
借助这些技术的进步，已经成功地对多种植物进行了基因转化，包括小麦、水稻、玉米等重要经济作物。
此外，基因表达技术的不断推进，使得对目标基因进行高效、特异性的表达成为可能。
植物基因工程技术的应用领域非常广泛。
首先，农业领域是植物基因工程技术的主要应用领域之一。
通过对作物基因的改良，可以使作物具备抗虫、耐病、抗旱等重要性状，提高作物产量和品质。
例如，转基因棉花通过转入Bt基因，使得棉花具备对棉铃虫的抗性，从而减少了农药的使用量，提高了农业生产效益。
此外，通过植物基因工程技术还可以改善作物的风味、营养价值和抗性等特性，进一步提升作物品质。
其次，植物基因工程技术在医药领域也有重要的应用。
植物不仅是重要的农作物，也是许多药用植物的来源。
通过植物基因工程技术，可以将药用植物的有效成分基因转移到其他植物中，实现大规模的生产。
这种方法成为植物生物合成药物的有效途径，不仅提高了药物的产量，还降低了药物的成本。
基因编辑在植物方面的应用研究-基因工程论文-生物学论文
基因编辑在植物方面的应用研究-基因工程论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——基因编辑论文（专业热点范文8篇）之第五篇摘要：基因编辑技术能够让人类对目标基因进行编辑, 实现对特定DN 段的敲除、加入。
本文主要综述基因编辑技术在增加植物抗性、改良作物品质、作物育种等方面的重要作用。
关键词：基因编辑,增加抗性,改良品质,作物育种基因编辑技术中, 以ZFN (zinc-finger nucleases) 和TALEN (transcription activator-like effector nucleases) 为代表的序列特异性核酸酶技术以其能够高效率地进行定点基因组编辑, 在基因研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力。
CRISPR/Cas9是继ZFN、TALEN之后出现的第三代基因组定点编辑技术, 它主要由Cas9蛋白和单链RNA组成, 在RNA的引导下对目标基因进行编辑, 是科研、医疗领域的有效工具。
1 在植物领域中的应用1.1 增加植物抗性禾本科植物在保护草地资源和促进草地畜牧业可持续发展中发挥着重要作用, 但杂草极大地影响了饲草的产量和品质。
禾本科植物中抗拿捕净除草剂的关键基因是乙酰辅酶A羧化酶(ACCase) , 将CT区的一个异亮氨酸突变成亮氨酸, 就会改变其对拿捕净的抗性[1]。
于东洋等通过构建ACCase的CRISPR/Cas9表达载体, 编辑燕麦的ACCase基因, 将关键位点由异亮氨酸突变为亮氨酸, 从而改变燕麦对拿捕净的抗性。
经过载体构建、基因枪法转化以及对转化效率的计算, 结果表明, CRISPR/Cas9在转基因植株中能敲除ACCase基因, 虽表现出脱靶现象, 但该研究为继续进行燕麦基因组编辑工作提供了理论依据和创建方法。
1.2 改良作物品质随着物质水平的提高, 人们更加追求食物的营养和健康, 低直链淀粉含量(13%～18%) 和有香味的理想稻米尤其受消费者青睐。
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瓜叶菊Mlo基因片段的克隆摘要瓜叶菊（Pericallis hybrida B. Nord.）是菊科（Compositea）多年生草本植物，是元旦、春节重要的观赏盆栽早春花卉，具有广阔的开发前景和现实意义。
近年来，白粉病（Powdery Mildew）逐渐成为制约瓜叶菊商品化产业发展的重要病害之一。
瓜叶菊白粉病的传统生物防治方法不仅使病原产生抗药性，还会造成成本增加和环境污染等问题。
因此，利用基因工程手段培育具有广谱抗白粉病的瓜叶菊种质资源具有非常重要的意义。
Mlo基因是一种新型的抗病基因，可能参与瓜叶菊白粉病的调控过程。
它与显性R基因控制的抗病基因不同，它是由单基因控制的隐性抗病基因，具有非小种专化的持久抗性，其功能类似于G蛋白偶联受体。
Mlo基因可能对细胞坏死具有负调控作用，即抑制细胞坏死，类似于其它突变体基因以寄主死亡来抵抗病原菌的入侵，Mlo基因突变为mlo基因后，对细胞死亡的负调控作用被解除，被侵染细胞可能更易死亡，由此引发广谱的抗病性。
任何感病的野生型都可以通过对Mlo基因进行诱变而获得抗性。
这种抗性，即便是在粗放的栽培管理条件下，也可以在田间得到持久保存，即便没有病原菌的侵染，突变的mlo植物也表现出自身细胞壁加固（cell wall appositions，CW As）和叶细胞的自发死亡现象。
因此，对该基因的克隆以及结构和功能的研究，为瓜叶菊的抗病育种奠定了基础并提供了新思路。
本研究以瓜叶菊（Pericallis hybrida B. Nord.）为试材，通过PCR方法克隆了Mlo基因片段的cDNA序列，并采用生物信息学方法对其进行预测和分析，为进一步研究瓜叶菊Mlo 基因的功能和表达情况提供了理论依据。
关键词: 瓜叶菊；Mlo基因片段；PCR扩增；1.研究的目的及意义在温室生产的条件下，白粉病（Powdery Mildew）逐渐成为瓜叶菊（Pericallis hybrida B. Nord.）栽培的主要病害，发病后严重影响瓜叶菊的生长发育和观赏性能，随着元旦、春节人们对于盆栽早春瓜叶菊需求的逐年增加，目前瓜叶菊白粉病已成为制约瓜叶菊商品化产业发展的重要病害之一。
迄今为止, 化学杀菌剂的喷施是目前防控瓜叶菊白粉病的主要手段，但又往往损伤叶片和花朵，影响了观赏价值和带来环境污染[1]。
在生产上，主要通过常规杂交选育的方法培育抗白粉病的瓜叶菊品种，可是由于白粉病原菌优势小种的更替及突变速度快，导致抗病选育往往落后于小种更替[2]。
近年来，人们采用RNA干扰MLO(Mycoplasma-like Organism)基因技术进行白粉病的防治取得一定进展[3,4]，如果该技术应用于瓜叶菊白粉病的防治上，那么有望从根本上解决防控白粉病的问题。
瓜叶菊白粉病的Mlo基因防治机理认识还不是十分清楚，但是在大麦、番茄等作物上有研究表明，作为一种新型抗病基因，Mlo基因会使植物产生叶细胞的自发死亡现象，且在抗性调控的过程中起负调控因子的作用[5,6]。
即使没有病原菌存在时，携带mlo突变基因的大麦也易引发植物本身自发性的细胞坏死，说明在细胞坏死过程中，野生Mlo基因可能起负调控作用，即抑制细胞坏死[7,8]。
通过缺失或移码的方式，Mlo基因突变成为mlo后，正常功能的MLO蛋白不能被合成，因此解除了这种负调控作用，而植物的叶表皮细胞会积累具有抗真菌活性功能的酚类物质以及H2O2和O2-，其中H2O2能够直接杀死感病细胞和侵染的病原菌，从而阻碍了白粉病的入侵，并加固细胞壁，产生广谱抗病性[9,10]。
本实验以瓜叶菊（Pericallis hybrida B. Nord.）为试材，采用RT-PCR 和RACE方法克隆了Mlo基因cDNA全长序列，并采用生物信息学方法对其进行预测和分析，为进一步研究瓜叶菊Mlo基因的功能和获得具有广谱和持久的白粉菌抗性的瓜叶菊种质资源奠定基础。
2材料与方法2.1 实验材料2.1.1 植物材料瓜叶菊（Pericallis hybrida B. Nord.）由东北农业大学园艺实验站提供，取样液氮速冻保存于-80℃冰箱中备用。
2.1.2 实验试剂TRIZOL购自Invitrogene公司；总RNA抽提试剂盒购自北京天根；第一链cDNA合成试剂盒，PCR扩增试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒均购于北京全式金公司，其它生化试剂均为进口或国产分析纯产品。
2.1.3 菌株及载体大肠杆菌（E. coli）菌株Trans5α、TransT1购置于北京全式金，克隆载体pMD18 T-Vector 购置于TaKaRa公司。
2.2 实验方法2.2.1 瓜叶菊Mlo基因片段的克隆及序列预测分析2.2.1.1 瓜叶菊RNA的提取方法一：TRIZOL法提取RNA（1）剪取100~200mg新鲜的瓜叶菊叶片，液氮研磨后，置入1.5ml离心管中，加入lm1预冷的TRNzol Reagent试剂，振荡lmin，室温放置5~10min；（2）4℃，12000r/min，离心10min，去除沉淀；（3）取上清，并将其液移入一新的离心管，加入等体积的氯仿（1:1），剧烈振荡30sec，室温静置2~3min；（4）4℃，12000r/min，离心10min；样品分成三层：黄色有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新的离心管中；（5）加入等体积的异丙醇，室温沉淀10~30min；（6）4℃，12000r/min，离心10min，沉淀RNA；（7）去上清，加入lm175%的乙醇（DEPC处理过的水配制）清洗，4℃，7500r/min，离心5min；重复一次；室温晾干10min左右；（9）加入50μl无RNase的灭菌双蒸水（ddH2O），溶解RNA；（10）260mn下测OD值定量RNA浓度；方法二：参照北京天根总RNA抽提试剂盒说明书2.2.1.2 设计简并引物将GeneBank上登录的外源植物Mlo基因的核苷酸及氨基酸序列进行下载，通过DNAMAN软件进行序列比对，根据比对结果为上下游引物确定两个合适的保守区域，使用primer5.0设计简并引物。
2.2.1.3 RT-PCR扩增目的片段参照北京全式金EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix,反转录试剂盒说明书。
（1）瓜叶菊cDNA第一链的获得反转录反应体系如下：瓜叶菊RNA 3 ulAnchored Oligo(dT)18(0.5 μg/μl) 1 ul2×TS Reaction Mix 10 ulTransScript RT/RI Enzyme Mix 1 ulRNase- Free Water to 20 ul反转录反应条件如下：42℃30min，85℃5min。
（2）Mlo基因的PCR扩增PCR反应体系如下：TemplateDNA 2 ulForward Primer(10 μM) 1 ulReverse Primer(10 μM) 1 ul10×TransTap HiFiBuffer 5 ul2.5mM dNTPs 4 ulTransTap TM HiFi DNA Polymerase 0.5 ulddH2O to final volum 50 ulPCR反应条件如下：94℃pause94℃ 3 min94℃30 s51℃ 1 min 35 Cycles72℃ 1 min72℃10 min4℃pause反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，利用紫外凝胶成像系统进行拍照及分析，观察是否扩增出目的片段大小的条带。
2.2.1.4 凝胶回收目的片段按照TIANgel Midi Purification Kit（离心柱型）胶回收试剂盒说明书进行。
（1）柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL，12000 rpm离心1min，弃收集管中的废液，然后把吸附柱放回收集管中。
（2）DNA样品经1%琼脂糖凝胶电泳后，EB染色，紫外灯下从凝胶上将目的条带DNA切出放入干净的1.5ml Eppendorf管中称取重量。
（3）向胶块中加入3倍体积PN溶胶液（如凝胶重0.1g，其体积可视为100μl，依此类推），50℃水浴放置10min，期间不断上下翻转离心管，确保胶块的完全溶解。
如果胶块没有完全溶解，可再加入些溶胶液或继续放置几分钟，直至胶块彻底融化。
（4）将融化的胶溶液转移到一个吸附柱CA2中，室温放置2min，12000 rpm离心30~60s，弃收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
（5）向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW。
12000 rpm，离心30~60s后，倒掉收集管中的废液。
（6）将吸附柱CA2放回收集管中，12000 rpm，离心2min，尽量去净漂洗液，将吸附柱CA2 置于室温放置数分钟，彻底晾干，防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
（7）将吸附柱CA2放入干净的离心管中，向吸附膜中央位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB （65~70℃预热后效果更好），室温放置2min。
12000 rpm，离心2min收集DNA溶液（洗脱液体积应不少于30μl）。
回收DNA可立即使用或保存于-20℃备用。
（8）1％琼脂糖凝胶电泳检测回收结果。
2.2.1.5 PCR产物与T载体连接pMD18-T Vector，在10μl连接体系中加入以下成分：表2-1 连接反应体系Tab.2-1 The reaction system of connect成分10 μl/管PCR回收产物 4 ulpMD18-T Vector 1 ulSolution I 5 ul置于冰上操作，之后放于16℃反应过夜。
2.2.1.6 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞（Trans5αChemically Competent Cell）购于TRANS。
操作说明如下：（1）取感受态细胞100μl，置于冰上融化，加入10μl pMD18-T Vector连接产物，轻轻混匀，冰浴30min。
（2）于42℃水浴中热激90s，之后迅速将管移到冰浴中2min，该过程不要剧烈摇动。
（3）向每个离心管中加入500μl无菌的LB液体培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃，200 r/min培养1h，使细菌复苏。
（4）8000rpm离心5min，留50-100μl菌液，将感受态均匀涂开，将平板倒置于37℃培养箱中过夜。
2.2.1.7 重组质粒的PCR鉴定在25μl的PCR反应体系中，取模板为0.2μl的质粒cDNA 或1μl的菌液，进行正常程序的PCR反应，同时设负对照，电泳检测是否扩增出特异条带。
2.2.1.8 重组质粒的酶切鉴定本实验中用Hind III单酶切、EcoR I单酶切和Hind III/EcoR I双酶切来对重组质粒进行酶切鉴定。