MAPK信号通路presentation

2.2.3 转染
2.2.4 检测
建APP突变基因 真核表达载体构建APP突变基因 真核表达载体
2018/10/20
脂质体介导 瞬时转染
2018/10/20
2.2 设计思路及核心技术
2.2.1 构建BACE1 稳转 HEK293 细胞株 2.2.2 突变构 2.2.3 转染
2018/10/20
APP水解途径
非淀粉样途径：被α分泌酶（C83）和γ-分 泌酶连续切割
淀粉样途径 ：Aβ的 产生，被β-分泌酶 （C99）和γ分泌酶依 次切割
β分泌酶水解670Met～671Asp之间的肽键，将APP一分为二，生成670个 氨基酸的APP片段和带完整Aβ的跨膜C段。
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课题选取的5个APP突变
自左向右：1为Maker；2、3为APPA673T；4、5为APPA673V;6、7为 APPE682K;8、9为APPE693G;10、11为APPE693Q。其中，2、3、4、 6、7、8、9、10、11为阳性结果。说明成功构建APP突变基因真核表达 系统。
2.2 设计思路及核心技术
2.2.1 构建BACE1 稳转 HEK293 细胞株 2.2.2 突变构
2018/10/20
APP基因序列 重叠延伸法PCR引入突变位点 pcDNA4
2018/10/20
采用具有互补 末端的引物,使PCR 产物形成了重叠链, 从而在随后的扩增 反应中通过重叠链 的延伸,将不同来 源的扩增片段重叠 拼接起来的技术。 重叠延伸PCR在 基因的定点突变中 具有重要应用。
老年斑
神经元纤维缠结
5
1.2 淀粉样蛋白级联假说
•Amyloid cascade hypothesis
Amyoid precursor protein(APP)
β- secretase γ- secretase
hereditary factor
Aβ（observed in the brain of patients with ADAD and SAD）
丙氨酸→苏氨酸 丙氨酸→缬氨酸 谷氨酸→赖氨酸 谷氨酸→甘氨酸 谷氨酸→谷氨酰胺
2018/10/20
内容概要
研究背景
研究思路及核心技术
创新点 展望
2018/10/20
2.1 研究出发点
本课题选取5个APP突变，研究不同APP突变对 Aβ 形成过程的不同作用
表征： APP level C99 level Aβ level
A+B
C+D
2018/10/20
引物设计
两端引物
APP(F) APP(R) APPA673T(F) APPA673T(R) APPA673V(F) AAACAAGCTTGCCACCATGCTGCCCGGTTTG CCCCGCTAGTCTAGAGTTCTGCATCTGCTCAA GAAGTGAAGATGGATACAGAATTCCGACATGAC GTCATGTCGGAATTCTGTATCCATCTTCACTTC
突变点引物
APPE682K(R)
APPE693G(F)
APPE693G(R) APPE693Q(F) APPE693Q(R) 2018/10/20
ggtgttctttgcaggagatgtgggttcaaac
gtttgaacccacatctcctgcaaagaacacc ggtgttctttgcacaagatgtgggttcaaac gtttgaacccacatcttgtgcaaagaacacc
Pathogenesis：increased，altered production or reduced clearance of Aβ
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APP水解途径
APP是一种跨膜蛋白质,在体内各种组织广泛存在,而在脑组织的表达最高。
APP C83 非淀粉样途径：被α-分泌酶（C83）和γ-分泌酶连续切割
淀粉样途径 ：Aβ的产生，被β-分泌酶（C99）（670Met～671Asp之间） 和γ分泌酶依次切割
Fomation of brain oligomeric Aβ or deposition of fibrillar Aβ accumulation
environment al factor
neurodegeneration
APP 淀粉样前体蛋白 Aβ 淀粉样多肽 β- secretase β分泌酶 γ- secretase γ分泌酶
2.2.3 转染 2.2.4 检测
பைடு நூலகம்
建APP突变基因 真核表达载体构建APP突变基因 真核表达载体
2018/10/20
2.2 设计思路及核心技术
2.2.1 构建BACE1 稳转 HEK293 细胞株
2.2.2 突变构
2.2.3 转染 2.2.4 检测
建APP突变基因 真核表达载体构建APP突变基因 真核表达载体
app基因 碱基序列 突变位点
2217 2218 2244 2278 2277
碱基替 换
G→A C→T G→A A→G G→C
APP蛋白氨 基酸序列突 变位点
673 673 682 693 693
密码子改变
氨基酸替 换
A→T A→V E→K E→G E→Q
密码子名称
GCA→ACA GCA→GUA GAA→AAA GAA→GGA GAA→CAA
淀粉样前体蛋白(APP)的突变在 淀粉样多肽（Aβ）形成过程中作 用研究
王德美 2014.12.1 7
内容概要
研究背景 研究思路及核心技术 创新点 展望
2018/10/20
内容概要
研究背景
研究思路及核心技术 创新点
2018/10/20
1.1 阿尔茨海默症（Alzheimer's disease, AD）
65-69
70-74
75-79
80-84
85-89
90-94
95-99
年龄 (年)
1906年报道1例51岁女性患者，进行性记忆 和语言能力丧失及识别能力障碍，病情逐渐 恶化、4年半后死亡，病解发现脑萎缩、老 年斑和神经原纤维改变。
4
病理特征：β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau 蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经元纤维缠结。
gaagtgaagatggatgtagaattccgacatgac
APPA673V(R)
APPE682K(F)
gtcatgtcggaattctacatccatcttcacttc
ccgacatgactcaggatacaaagttcatcatcaa ttgatgatgaactttgtatcctgagtcatgtcgg
突变及检验
重叠延伸法PCR结果 A673T A673V E682K E693G E693Q 2.3kb
MarkerⅢDNA Ladder
双酶切结果 5.0kb 2.1kb
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APP WT
A673T
A673V E682K
E693G
E693Q
pcDNA4
重组检验
双酶切验证结果 成功构建5个APP突变基因真核表达载体。野生APP基因约为2.3kb，pcDNA4为 5.1kb，选用内切酶为HindⅢ和XbaⅠ，下图为琼脂糖凝胶电泳结果（酶切后两片段 约为2.1kb和5.0kb）：
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内容概要
研究背景 研究思路及核心技术 创新点
展望
2018/10/20
4.展望 系统构建疾病相关突变库
2018/10/20
2.2 设计思路及核心技术
2.2.1 构建BACE1 稳转 HEK293 细胞株 2.2.2 突变构 2.2.3 转染 2.2.4 检测
建APP突变基因 真核表达载体构建APP突变基因 真核表达载体
2018/10/20
2018/10/20
2.2 设计思路及核心技术
2.2.1 构建BACE1 稳转 HEK293 细胞株 2.2.2 突变构
2.2.4 检测 建APP突变基因 真核表达载体构建APP突变基因 真核表达载体
2018/10/20
检测APP、C99和Aβ Western Blot 、 ELlSA 、质谱
2018/10/20
APP水解途径
APP是一种跨膜蛋白质,在体内各种组织广泛存在,而在脑组织的表达最高。
APP C83 非淀粉样途径：被α-分泌酶（→C83）和γ-分泌酶连续切割
淀粉样途径 ：Aβ的产生，被β-分泌酶（670Met～671Asp之间）（→C99） 和γ分泌酶依次切割
2018/10/20
内容概要
研究背景 研究思路及核心技术
创新点
展望
2018/10/20
3.创新点
目前国内还没有对APP突变的系统研究
突变位点
673
氨基酸残基替换
A →T
A→V
突变命名
冰岛人突变
发现时间
2012年Nature
2009年Science 2011年
682
E→K
693
E →G
北极人突变
2001年Nature Neuroscience
1990年Science
E→Q
荷兰人突变
选取理由：2个早期发现突变E693G和E693Q，剩余3个为近些年发现 的突变。对比研究。