某公司内部的CRISPR-Cas9操作流程

Genloci Classic CRISPR-Cas9内

部操作流程

Protocol No. PT140726-1

Protocol No. PT140726-1

1，CRISPR-Cas9基因编辑实验流程图如下：

pGK1.1

U6 CACC G CAAA 4 5

5’ -5’

3’

-3’ -

- ～20bp

2，操作步骤

实验前，请您务必做好以下验证实验：

A．单细胞生长情况，确保单个细胞可以正常生长形成单克隆，即，低密度的细胞在培养皿中可以形成单克隆。

B．目的基因的表达情况分析，为防止因染色体缺失等情况导致靶基因缺失，首先需要PCR扩增靶基因，并对PCR结果进行测序，确保靶基因的完整存在；其次，您还可以用RT-PCR分

析靶基因的活跃度。

1. 设计Oligo DNA序列

首先，您需要在靶标DNA区域中设计一对20bp左右的oligo DNA，您可以通过以下在线工具设计：

●麻省理工学院的CRISPR Design：/

●德国癌症研究中心的E-Crisp：/E-CRISP/designcrispr

下面我们选择麻省理工学院的CRISPR Design工具来做设计举例，以Fut8基因为例，一次只能输入大小为23～250bp的基因片段，最好一次只输入一个外显子，避免Guide序列跨内含子的。

点击“Download as genbank”按钮，出现以下界面：“Fut8”Array

根据左边的score的高低选取合适的Guide序列，以Guide#1序列为例，2条单链oligo的序列如下（红色字体部分是要与Bbs I酶切后的载体相互补的部分）：

Fut8-F: cacc G AATGAGCATAATCCAACGCC

Fut8-R: aaac GGCGTTGGATTATGCTCATTC

※注意：oligo DNA设计序列的第一个碱基必须是G，如果你选取的Guide序列的第一个碱基不是G，可自行加一个G上去。

另外，需在位点上下游各设计一条引物，用于后续PCR或测序检测阳性克隆，引物能扩增约300bp 的DNA片段，上游引物距突变位点约100bp，下游引物距突变位点约200bp。

将设计后的序列送到值得信赖的公司合成，纯化级别为PAGE。

2. T4 DNA Ligase连接

将合成后的2条单链oligo DNA退火形成双链DNA，再与载体连接，pGK1.1 linear vector是线性化

载体，无需酶切处理，可直接用于T4 DNA Ligase连接反应，pGK1.1载体已经优化过，其转染和敲除的效率比一般CRISPR载体更高。

Protocol No. PT140726-1

Protocol No. PT140726-1

退火反应体系如下：

将以上体系瞬时离心后，置于PCR 仪中95℃孵育3min ，孵育后自然冷却20min 。取1.75μl 的杂交后的双链DNA 进行T4 DNA Ligase 连接反应，反应体系如下：

pGK1.1 linear vector 2μl

双链DNA

1.75μl T4 DNA Ligase 1μl 10xT4 DNA Ligase Buffer 1μl ddH 2O 4.25μl 10μl

※注意：请您根据步骤1自行设计正链Oligo 序列和负链Oligo 序列，合成后的2条单链 oligo DNA 退火复性成双链DNA ，再进行T4 DNA Ligase 连接反应。

连接产物可以直接转化DH5a 高效感受态细胞，转化和筛选阳性克隆的实验步骤请您参考《分子克隆实验指南》，pGK1.1的抗性为卡那霉素抗性，筛选后的阳性克隆，需测序验证序列的正确性。

3. 电转染靶细胞(推荐)

转染前进行质粒大提，确保质粒浓度≥2μg /μl 浓度，再取4～7μg 进行电转染靶细胞，推荐使用Celetrix 细胞电转仪(型号：CTX-1500A)，贴壁细胞的数量需1x106～3x106，悬浮细胞的数量需3x106～5x106。

另外，您也可以使用转染试剂转染靶细胞。

4. 混合克隆pool 检测

48-72小时后做有限稀释，一般5块板足够，并取电转后细胞的pool 1000个细胞以上离心，去上清，PBS 洗一遍，细胞沉淀溶于适量的PBS 中，煮5min 后模板就制备好了，剩余的pool 细胞冻存。

PCR 检测（以Fut8基因为例）：

11步骤所制备的模板 5ul

Fut8-seq-F(10mM): 1ul Fut8-seq-R(10mM): 1ul dNTP Mixture(10mM each): 1ul Taq 酶： 0.5ul 10XTaq 酶buffer ： 5ul Mgcl 2 3ul

H2O: 33.5ul Total 50ul 程序： 95℃ 2min cycles 1x 95℃ 20S

X ℃ 20S

72℃ 30S

72℃ 5min cycles 1x 95℃ 变性 5min

PCR 产物使用Cruiser TM 酶切15-20分钟，酶切产物1%-1.5%凝胶电泳。

正链Oligo(100μM) 0.5μl

负链Oligo(100μM)

0.5μl ddH 2O

18μl Annealing Buffer(20x)

1μl 20μl

}

cycles 35x

上图为混合克隆pool酶切检测，由此图可知此混合克隆pool中有敲除成功的细胞，则进行下一步并计算突变率。

5. Cruiser TM筛选阳性克隆

将剩余的pool的靶细胞有限稀释后，分到96孔板中进行单克隆培养，如果靶细胞是悬浮细胞，推荐使用Cell Plaza™(Cat.No.: GP08250)培养细胞，待细胞长好后，取1000个左右的细胞，提基因组，推荐使用Genloci TNA抽提试剂盒(Cat.No.: GL10851S)。

然后使用核酸内切酶初步筛选阳性克隆，推荐使用Genloci Cruiser TM突变检测试剂盒(Cat.Nos.: GCMD025, GCMD100)，对Cruiser TM筛选后的阳性克隆进行测序分析，并对碱基缺失结果进行比对分析。

Protocol No. PT140726-1