单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用

陕西师范大学硕士学位论文单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用姓名：罗明志申请学位级别：硕士专业：动物学指导教师：齐浩20050501单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用罗明志摘要单细胞凝胶电泳（ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｓｉｓ，ＳＣＧＥ），又称彗星实验（ｃｏｍｅｔａｓｓａｙ），是一种在单细胞水平进行ＤＮＡ损伤的检测方法，具有简便、灵敏、快捷、样品用量小等优点，广泛用于遗传毒性检测、环境毒性检测、分子流行病学和ＤＮＡ损伤与修复等研究领域。

我们在本实验室建立了单细胞凝胶电泳技术，并对部分操作流程进行了改良，包括（１）制胶方法改良；（２）增加水洗；（３）进行梯度酒精脱水。

在上述改良过程中，我们用“灌胶”法在载玻片上制胶，替代了传统的使用磨砂载玻片上“三明治”制胶，解决了彗星实验中常见的脱胶现象，脱水后有利于获得平整胶面：在裂解后增加了水洗步骤，以消除裂解液中的高盐和去垢剂对后续实验操作的影响；采用直流稳压电源进行单细胞电泳，保证了实验结果的可重复性；对染色的条件进行了筛选，确定了使用ＥＢ作为细胞ＤＮＡ的荧光染料；以ＣＡＳＰ（免费）作为彗星图像的分析软件，建立了图像分析的方法。

这些实验步骤的改良以及实验流程的优化或标准化．简化了操作程序，节省了时间，并使结果分析更加简便。

为了验证上述改良后的实验系统是否可靠，我们用紫外线作为损伤因子处理细胞，诱导细胞ＤＮＡ损伤，然后用彗星实验检测这一损伤。

从这～阳性模型的结果分析来看，发现细胞损伤呈现出很好的时间依赖性，表明该实验系统的可靠性。

我们同时筛选并评价了彗星实验中有关的ＤＮＡ损伤分析指标，发现ＴａｉｌＬｅｎｇｔｈ，ＣｏｍｅｔＬｅｎｇｔｈ，ＴａｉｌＭｏｍｅｎｔ和ＯｌｉｖｅＴａｉｌＭｏｍｅｎｔ作为ＤＮＡ损伤的评价指标比较可靠。

我们建立了肝细胞的组织块原代培养系统。

在建立肝细胞组织块原代培养实验流程中，我们对实验的各个步骤，例如组织块贴壁需要的时间、细胞生长所需的培养基种类、培养基添加剂以及动物组织供体年龄等进行了筛选，建立了小鼠肝细胞组织块的原代培养系统。

我们用单细胞凝胶电泳方法对磁场和抗癌药物对人自血病细胞Ｋ５６２以及小鼠原代肝细胞的ＤＮＡ损伤进行了检测。

结果发现，Ｋ５６２细胞在９ｍＴ稳恒磁场中处理１２ｈ即可引起细胞的ＤＮＡ损伤，这一损伤随处理时间的延长而增加，具有时间依赖效应；同样条件下对原代肝细胞的处理以及更长时间的处理（３６ｈ、４８ｈ、７２ｈ）均未发现细胞的ＤＮＡ损伤。

在使用较低浓度紫杉醇（５０ｎｇ／ｍＬ）处理Ｋ５６２细胞１２ｈ后，即可导致细胞ＤＮＡ损伤，并表现出时间依赖效应，而仅在高浓度长时阳Ｊ的紫杉醇（８００ｎｇ／ｍＬ，２４ｈ）处理下才会引起肝细胞的ＤＮＡ损伤。

８００９９／ｍＬ环磷酰胺处理Ｋ５６２细胞１２ｈ即可引起细胞的ＤＮＡ损伤，而在１２００９９／ｍＬ时方才引起肝细胞的ＤＮＡ损伤。

关键词：单细胞凝胶电泳；ＤＮＡ损伤：ＵＶ；细胞培养；磁场；抗癌药物Ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ－－ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｏｍｅｔａｓｓａｙＬｕｏＭｉｎｇｚｈｉＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｅｃｏｍｅｔａｓｓａｙ，ａｌｓｏｃａｌｌｅｄｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＣＧＥ），ｉｓａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｑｕｉｃｋａｎｄｃｈｅａｐｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｍｅｔｈｏｄｔｏｄｅｔｅｃｔａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｅＤＮＡｄａｍａｇｅｉｎｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｃｅｌｌｓ．ＩｔｗａｓｆｉｒｓｔｄｅｓｃｒｉｂｅｄｂｙＯｓｔｔｉｒｔｇａｎｄＪｏｈａｎ。

ｓｏｎｉｎ１９８４ａｎｄＷａｓｌａｔｅｒｍｏｄｉｆｉｅｄｂｙＳｉｎｇｈ，Ｔｈｅｃｏｍｅｔａｓｓａｙｈａｓｂｅｅｎｕｓｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｉｅｌｄｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇａｇｉｎｇ，ｃｌｉｎｉｃａｌｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ，ｇｅｎｅｔｉｃｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｉｎｔｈｅｐａｓｔｆｅｗｙｅａｒｓ．Ｗｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｔｈｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅｏｆａｌｋａｌｉｎｅｃｏｍｅｔａｓｓａｙｉｎｏｕｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｗｅｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄｔｈｅｐｒｏｔｏｃｏｌｏｆａｌｋａｌｉｎｅｃｏｍｅｔａｓｓａｙｓｔｅｐｂｙｓｔｅｐ，ａｎｄｍｏｄｉｆｉｅｄｓｏｍｅｓｔｅｐｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｇｅｌｓｌｉｄｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｗａｔｅｒｗａｓｈｉｎｇａｎｄｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎＩｎｏｒｄｅｒｔｏｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｔｈｅａｄｈｅｓｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｉｎｌａｙｅｒｓｏｆｌｏｗｍｅｌｔｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｇａｒｏｓｅａｎｄａｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓｌｉｄｅ，ａｃｌｅａｎｓｌｉｄｅｎｅｅｄｔｏｂｅｄｉｐｐｅｄｉｎｎｏｍａｌｍｅｌｔｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｇａｒｏｓｅｆｏｒｌｒａｉｎａｎｄｔｈｅｎｄｒｉｅｄａｔ３７℃ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ．ＴｈｕｓａｎｅｗｍｅｔｈｏｄｏＰ‘ｐｏｕｒｉｎｇ＇’ｇｅｌｈａｓｂｅｅｎｕｓｅｄｔｏｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｔｈｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ“ｓａｎｄｗｉｃｈ＂’ｍｅｔｈｏｄＩｎｔｈｉｓｗａｙ，ｇｅｌ’ｓｔａｋｉｎｇｏｆｆｆｒｏｍｔｈｅｓｌｉｄｅｓｗａｓａｖｏｉｄｅｄ．Ｔｏａｖｏｉｄｔｈｅｔｈｅｓａｌｔａｎｄｄｅｔｅｒｇｅｎｔｏｆｔｈｅｌｙｓｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎｗｈｉｃｈｉｎｔｅｒｆｅｒｅｔｈｅｅｌｅｃｔｒｉｃｆｉｅｌｄ，ｔｈｅｓｌｉｄｅｓｈａｖｅｔｏｂｅｗａｓｈｅｄｂｙｔｒｉｄｉｓｔｉｌｌｅｄｗａｔｅｒｔｈｒｅｅｔｉｍｅｓ．Ａｆｔｅｒｔｈｅｓｌｉｄｅｓｄｅｈｙｄｒａｔｅｄｂｙｇｒａｄｓａｌｃｏｈｏｌ，ｍｏｓｔｃｅｌｌｓｉｎｔｈｅｇｅｌｗａｓｌｏｃａｔｅｄａｔａｓｉｍｉｌａｒｐｌａｎｅ；ＥＢ（Ｅｔｈｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）ｗａｓｓｅｌｅｃｔｅｄａｓｔｈｅｂｅｓｔｄｙｅｆｏｒＤＮＡｓｔａｉｎｉｎｇｔｏａｖｏｉｄｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｂｌｅａｃｈｉｎｇ．ＷｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｔｈｅＣＡＳＰｓｏｆｔｗａｒｅ（ｆｒｅｅ）ｆｏｒｔｈｅｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｍａｇｅａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｕｓ，ａｎｏｐｔｉｍｉｚｅｄａｎｄｓｔａｎｄａｒｄｍｅｔｈｏｄｈａｓｂｅｅｎｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ，ｔｈｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅｐｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄａｎｄｔｈｅｔｉｍｅｓａｖｅｄ．Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｖｅｒｉｆｙｔｈｅｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｍｅｔｈｏｄ，ａｓｗｅｌｌａｓｔｈｅｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙａｎｄｔｈｅｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅＣＡＳＰｓｏｆｔｗａｒｅ，ｗｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｐｏｓｉｔｉｖｅｍｏｄｅｌ：ｔｈｅＤＮＡｄａｍａｇｅｏｆＫ５６２ｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＵＶｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｃｏｍｅｔａｓｓａｙ．Ａｇｏｏｄｄｏｓｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｆｆｅｃｔｗａｓｆｏｕｎｄ，ｓｈｏｗｅｄｔｈｅｍｅｔｈｏｄｈａｓａｇｏｏｄｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔａｌｓｏｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｆｏｕｒｐａｒａｍｅｔｅｒｓ．Ｔａｉｉｌｅｎｇｔｈ，ＣｏｍｅｔＬｅｎｇｄｌ，１硪ｆＭｏｍｅｎｔａｎｄＯｌｉｖｅ１１ａｉｌＭｏｍｅｎｔ．ｈａｖｅａｇｏｏｄｄｏｓｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｆｆｅｃｔ・ｗｈｉｃｈｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＣＡＳＰｓｏｆｔｗａｒｅａｎｄｔｈｅｆｏｕｒｐａｒａｍｅｔｅｒｓｈａｖｅａｇｏｏｄｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ．Ｔｈｒｏｕｇｈｄｉｓｃｕｓｓｉｎｇｔｈｅｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｐｒｏｔｏｃｏｌｓｓｔｅｐｂｙｓｔｅｐ，ｉｎｖｏｌｖｉｎｇｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｔｈｅｔｉｓｓｕｅａｄｈｅｒｅｉｎｇｔｏｔｈｅｍａｔｒｉｘ，ｔｈｅｋｉｎｄｓｏｆｔｈｅｍｅｄｉｕｍａｎｄｔｈｅａｇｅｏｆａｎｉｍａｌｓ，ｗｃａｌｓｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｔｈｅｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．ＴｈｅｎｗｅｔｅｓｔｅｄＤＮＡｄａｍａｇｅｏｆＫ５６２ａｎｄｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｍａｇｎｅｔｉｃｆｉｅｌｄＩＩａｎｄａｎｔｉｃａｎｃｅｒｄｒｕｇｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｍａｇｎｅｔｉｃｆｉｅｌｄ（９ｒｏＴ，１２ｈ）ＣａｌｌｉｎｄｕｃｅＤＮＡｄａｍａｇｅｏｎＫ５６２ｃｅｌｌｓ，ａｎｄｗｉｔｈｔｈｅｅｘｐｏｓｕｒｅｅｘｔｅｎｄｅｄ，ＤＮＡｄａｍａｇｅｉｎｃｒｅａｓｅｄ；ＢｕｔｗｈｅｎｔｈｅｈｅｐａｔｏｃｙｔｅＷＲＳｅｘｐｏｓｅｄｔｏｍａｇｎｅｔｉｃｆｉｅｌｄ（９ｒｏＴ）ｅｖｅｎｍｏｒｅｔｈａｎ１２ｈ（３６，４８，７２ｈ），ｎｏＤＮＡｄａｍａｇｅｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ａｔａｌｏｗｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（５０ｎｇ／ｍＬ），ＴａｘｏｌｃａｎｉｎｄｕｃｅＤＮＡｄａｍａｇｅｏｎＫ５６２ｃｅｌｌｓａｆｔｅｒ１２ｈｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｔｈｅｄａｍａｇｅｗａｓａｄａｍａｇｅｃａｎｏｎｌｙｂｅｄｅｃｔｃｔｅｄｗｈｅｎｔｈｅｄｏｓｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐａｔｔｅｒｎ．Ｂｕｔｉｎｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ，ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｔｉｍｅｏｆＴａｘｏｌｗａｓ８００ｎｇ／ｍＬａｎｄ２４ｈｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＤＮＡｄａｍａｇｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ（８００¨ｇ／ｍＬ，１２ｈ）ｃｏｕｌｄｂｅｄｅｔｅｃｔｅｄＯｉｌＫ５６２ｃｅｌｌｓ．Ｗｈｉｌｅｉｎｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ，ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｔｉｍｅｏｆｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅＷａＳ１２００Ｕｇ／ｍＬａｎｄ１２ｈ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ＤＮＡｄａｍａｇｅ；Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ；ｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ；ｍａｇｎｅｔｉｃｆｉｅｌｄ；ａｎｔｉｃａｎｃｅｒｄｒｕｇｓＩＩＩ学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

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