毒性试验整理
001_经口急性毒性试验方法_改良寇氏法
急 性 毒 性 试 验 方 法――改良寇氏法Kärber 法由Kärber 于1931提出，后经Finney 改进，顾汉颐作过改进，1963年孙瑞元教授对该法进一步改进，改进后的计算方法称为点斜法或孙氏法，增加了不含0%和100%死亡率的校正式，所得LD 50及全部有关参数与正规概率单位法相近。
改良寇氏法（Käber）试验设计的原则是：各组剂量按等比级数；各组动物数相等：大致有一半组数的动物死亡率在10%～50%之间，另一半在50%～100%之间，最好出现0 %和100 %的剂量组。
一、剂量选择及分组1、剂量选择剂量设计是否合理是急性毒性试验能否成功的关键。
探求外源化学物的急性毒性，测定其LD 50或LC 50时，应首先广泛查阅文献资料，了解该化学物的化学结构和理化性质，如结构式、分子量、溶解度、挥发度、纯度及杂质含量等，其次确定测定LD 50的计算方法，然后设计剂量。
2、预试验：总的原则是先用少量动物，以较大的剂量间距染毒，求出粗略的致死剂量范围，即确定受试动物全部致死的最小剂量（b ）和全部不致死的最大剂量（a ），即求出待测化学物0 %~100 %的大致致死剂量范围，然后在这个剂量范围内按几何级数的间距设计5~7个剂量组，组间剂量呈等比级数（r ），其比值为1.2~1.5。
进行正式实验。
用于急性毒性试验时，动物的体重为：大鼠180~200g ，小鼠18~22g ，豚鼠200~250ｇ，家兔2~2.5kg ，犬10~12 kg 。
用于实验的同一批动物体重变异范围不得超过所用动物平均体重的20%。
仍然遵守雌雄各半或雌雄兼取的原则。
当预试中发现化学物的毒性有明显的性别差异时，则需要选用雌、雄两种性别的动物分别进行试验，求出各自的LD 50。
通过预试，找出受试化学物引起动物死亡的大致剂量范围，以此为依据设计正式试验的剂量和分组。
按下式设计剂量组：1n abr -= 式中：r —相邻两组剂量的比值，一般为1.2～1.5，b —最低全致死剂量量， a —最高不致死剂量， n —设计的组数。
细胞毒性实验总结
细胞毒性实验总结一、抗HBV药物细胞毒性实验背景知识 (1)二、细胞毒性实验方案的确立 (3)三、细胞毒性实验方法稳定后的部分数据 (4)四、细胞毒性实验质量评价指标 (5)五、细胞毒性实验SOP (6)（一）目的 (6)（二）适用范围 (6)（三）责任人 (6)（四）规程 (6)1. 试验准备 (7)2. 试验操作 (8)3．数据处理和分析 (8)六、总结 (9)一、抗HBV药物细胞毒性实验背景知识细胞毒性是化学物质（药物）作用于细胞基本结构和/或生理过程，如细胞膜或细胞骨架结构，细胞的新陈代谢过程，细胞组分或产物的合成、降解或释放，离子调控及细胞分裂等过程，导致细胞存活、增殖和/或功能的紊乱，所引发的不良反应。
按作用机制可分3种类型：①基本细胞毒性，涉及一种或多种上述结构或功能的改变，作用于所有类型的细胞；②选择细胞毒性，存在于某些分化细胞上，主要通过化学物质的生物转化，与特殊受体结合或特殊的摄入机制所引发；③细胞特殊功能毒性，对细胞结构和功能损伤轻微，但对整个机体损伤非常严重。
类似毒性作用可通过细胞因子、激素和递质的合成、释放、结合和降解影响细胞与细胞间的交流或特殊的转运过程而实现。
毒性作用也可能来自化学物质对细胞外过程的干扰，任何一种非动物检测系统对多种因素都应加以考虑。
1983年Ekwall提出“基本细胞功能”的概念，即多数化学物质毒性作用是对细胞功能的非特异性损伤，却可引起器官功能的特异性改变甚至机体死亡。
有研究显示化学物质体外细胞毒性与其引起的动物死亡率及人体死亡的血药浓度之间都存在良好的相关性。
化学物质产生的损伤和死亡，最终可表现为细胞水平上的改变，由此推测体外细胞毒性可以预测体内急性毒性。
体外方法有助于预测化学物质急性暴露引发的全身和局部影响，并评估体内毒性浓度。
目前较为理想的抗HBV药物有拉米夫定（3TC）、恩替卡韦（ETV）等。
3TC是核苷左旋对呋体，早期用于艾滋病的治疗。
毒理学毒性评价试验的原则
统计学方法
数据类别和统计学要求 1．“有或无”数据： 动物间的比较 个别组的比较 非均匀性 与剂量相关的趋势 动物内部比较 个别组的比较 非均匀性 变量问的相关性 2．分级数据： 动物间的比较 个别组的比较 非均匀性 与剂量相关的趋势 动物内部的比较 个别组的比较 非均匀性 与剂量相关的趋势 变量间的相关性 3．连续数据： 动物间的比较 个别组的比较 非均匀性 与剂量相关的趋势 动物内部比较 个别组的比较 非均匀性 与剂量相关的趋势 变量间的相关性 各组变量间相关性的变化 变量随时间而变化
毒理学动物实验设计
外推
一、毒理学毒性评价试验的原则 毒理学实验通常是毒性评价或安全性评价试验， 通常由权威机构规定评价程序。 在描述毒理学的试验中，有三个基本的原则: 1.外来化学物在实验动物产生的作用，可以 外推于人 基本假设为： ①人是最敏感的动物物种； ②人和实验动物的生物学过程包括化学物的 代谢，与体重（或体表面积）相关。
Fisher精确分布检验(不分层的数据) 2×2校正的卡方检验(分层或不分层的数据) 2×K卡方检验(分层或不分层的数据) Armitage检验(分层或不分层的数据) McWemar检验或符号检验 Cochran检验 Fisher精确分布检验2X2校正的卡方检验
Mann Whitney u检验 Kruskal—Wallis单向方差检验 非参数趋势检验 Wilcoxon配对符号秩和检验 Friedman双向方差分析 Page检验 Spearman等级相关系数
急性毒性试验
试验步骤和操作要点
1
试验设计
2
确定试验物质的给药途径、剂量和
暴露时间，合理设计试验组和对照
组，以确保试验数据的可比性。
3
数据分析
4
收集和整理试验数据，进行统计分 析和结果解读，评估化学物质的毒
性潜力和危害等级。
试验准备
准备动物和试验物质，并遵守试验 室安全和伦理规定，保证试验过程 的准确性和可靠性。
试验操作
按照设定的方案进行实验操作，严 格控制剂量和暴露时间，记录动物 的毒性反应和不良效应。
试验结果的解读和评价标准
急性毒性试验结果一般以LD50值为指标进行解读，在国际上有一系列评价标准，用于评估化学物 质的毒性程度和危害等级。
试验的局限性和改进方向
1 动物模型的局限性 2 测试方法的改进
动物模型不能完全代 表人类生物反应，因 此在试验结果的解读 和评估时需要谨慎考 虑。
急性毒性试验
急性毒性试验是一种评价化学物质对生物体的短期毒性潜力的试验方法，通 过暴露一定剂量的物质给实验动物，观察其对动物的毒性反应以及产生的不 良效学物质对生物体的毒性程度及其可能产生的危害， 为了规范评估过程，国际上制定了一系列的试验方法和评价标准。
常用的试验方法和原理
需要进一步发展和改 进更精准、准确的试 验方法，以提高试验 结果的预测性和可比 性。
3 替代和替补模型
发展替代和替补模型， 例如体外细胞实验和 计算机模拟，以减少 对动物实验的依赖。
试验的应用领域和意义
急性毒性试验在化学品安全评估、药物研发、环境保护等领域具有重要意义， 为保障人类健康和环境安全提供科学依据。
LD50试验 通过确定半数致死剂量（LD50）来评估化学物质的毒性，以毫克/ 千克体重作为单位。 急性口服毒性试验 通过将一定剂量的物质通过口服给予 动物，观察其对动物的毒性反应，用于评估化学物质的毒害程度。 急性皮肤 毒性试验 通过将一定剂量的物质涂抹于动物皮肤上，观察皮肤反应和毒性症 状，用于评估化学物质的皮肤刺激和毒害作用。
新药毒性检验报告
新药毒性检验报告1. 引言本报告为对新药的毒性检验进行详细的分析和总结。
毒性检验是新药研发过程中不可或缺的环节，旨在评估新药在生物体内产生的不良反应、毒性程度和毒性机制等。
本次检验旨在详细研究该新药的毒性作用，为进一步研发和临床应用提供科学依据。
2. 方法2.1 实验设计采用动物实验模型进行新药的毒性检验。
本次实验使用小鼠作为实验动物，构建以下不同剂量组的实验组：•高剂量组：每天口服新药100mg/kg•中剂量组：每天口服新药50mg/kg•低剂量组：每天口服新药25mg/kg•阴性对照组：给予等量的溶剂（如生理盐水）2.2 实验步骤1.准备实验动物：选择健康、体重范围相近的小鼠，并随机分成不同组别。
2.预先观察：在给药前进行一周的预先观察，记录小鼠的一般行为、体重变化等。
3.给药：根据不同组别的剂量要求，使用适量的新药进行口服给药。
4.观察和记录：每天观察小鼠的一般行为、食物摄入、水摄入等，同时记录体重变化。
5.实验结束：在给药结束后，进行动物的解剖和组织取样，进行细胞学和组织学的分析。
3. 结果3.1 一般观察结果在实验过程中，观察到以下情况： - 高剂量组小鼠出现食欲减退、体重下降等症状； - 中剂量组小鼠食欲正常，体重无明显变化； - 低剂量组小鼠食欲正常，体重无明显变化； - 阴性对照组小鼠食欲正常，体重无明显变化。
3.2 体重变化通过每天记录小鼠体重，并绘制成曲线图，结果显示： - 高剂量组小鼠体重迅速下降，在给药后第三天开始出现体重下降，持续至给药结束； - 中剂量组小鼠体重变化较为平稳，无明显波动； - 低剂量组小鼠体重变化与阴性对照组小鼠无明显差异。
3.3 组织学分析对实验结束后的小鼠进行解剖和组织取样，进行了细胞学和组织学的分析，结果如下： - 高剂量组小鼠肝脏组织显示明显的损伤，出现坏死和炎症反应； - 中剂量组小鼠肝脏组织和阴性对照组小鼠无明显异常变化； - 低剂量组小鼠肝脏组织显示轻微的炎症反应，但未出现明显损伤。
药物毒理学长期毒性试验
这对于制定临床试验的剂量方案具有重
要意义
t
预测药物的生殖和发育毒性
某些药物可能对生殖和发育造成不良影
响，长期毒性试验可预测这些潜在毒性
4
方法
进行药物毒理学长期毒性试验时，需要考虑以下因素 实验动物：选择适合的实验动物，如小鼠、大鼠、狗、灵长类等 给药方案：根据药物的性质和实验目的，确定给药的剂量、频率和持续时间 观察指标：在试验期间，定期观察动物的生理指标(如体重、呼吸、体温等)、血液学 指标(如红细胞计数、白细胞计数等)、生化指标(如肝功能、肾功能等)以及其他可能 的毒性反应 病理学检查：在试验结束后，对动物进行病理学检查，以评估药物的毒性作用 数据处理与分析：对试验数据进行整理和分析，评估药物的长期安全性和毒性反应
结果评估
根据上述评估结果，药物开发商可以制定相应的临床 试验方案，确保药物在临床试验中的安全性
x
同时，这些结果也为药物的上市许可提供了重要的参 考依据
-
请各位老师批评指正!
THESIS DEFENSE POWERPOINT
XXXXXXXXXX
指导老师：XXX
答 辩 人 ：XXX
2
概念
1
药物毒理学长期毒性试验是 指通过给予实验动物一定剂 量的药物，观察和分析药物
对动物的长期毒性作用
2
长期毒性试验通常采用啮齿类动 物或非啮齿类动物作为研究对象， 连续给药一段时间(如3个月至1 年)，以评估药物的长期安全性
3
目的
药物毒理学长期 毒性试验的主要 目的是评估药物 的长期使用对动 物的毒性作用， 包括
5
结果评估
根据长期毒性试验的结果，可以进行如下评估 毒性反应类型与程度：确定药物引起的毒性反应类 型和程度，如轻度、中度或重度 安全剂量范围：根据不同剂量下的毒性反应，确定 药物的安全剂量范围 致癌性评估：根据药物的致癌性检查结果，评估药 物的致癌风险 生殖和发育毒性评估：根据药物的生殖和发育毒性 检查结果，评估药物对生殖和发育的影响2Βιβλιοθήκη XX药物毒理学长 期毒性试验
【2017年整理】急毒、亚急毒名词
名词解释编辑急性毒性试验是指一次或24小时内多次染毒的试验，是毒性研究的第一步。
要求采用啮齿类或非啮齿类两种动物。
通常为小鼠或大鼠采用经口、吸入或经皮染毒途径。
急性毒性试验主要测定半数致死量（浓度），观察急性中毒表现，经皮肤吸收能力以及对皮肤、粘膜和眼有无局部刺激作用等，以提供受试物质的急性毒性资料，确定毒作用方式、中毒反应，并为亚急性和慢性毒性试验的观察指标及剂量分组提供参考。
2概述及染毒方法编辑一、概念和试验目的(一) 急性毒性概念急性毒性是指机体(人或实验动物)一次(或24小时内多次)接触外来化合物之后所引起的中毒效应，甚至引起死亡。
但须指出化合物使实验动物发生中毒效应的快慢和剧烈的程度，可因所接触的化合物的质与量不同而异。
有的化合物在实验动物接触致死剂量的几分钟之内，就可发生中毒症状，甚至死亡。
而有的化合物则在几天后才显现中毒症状和死亡，即迟发死亡。
此外，实验动物接触化合物的方式或途径不同，“一次”的含义也有所不同。
凡经口接触和各种方式的注射接触，“一次”是指在瞬间将受试化合物输入实验动物的体内。
而经呼吸道吸入与经皮肤接触，“一次”是指在一个特定的期间内实验动物持续地接触受试化合物的过程，所以“一次”含有时间因素。
(二) 实验目的1.求出受试化合物对一种或几种实验动物的致死剂量(通常以LD50为主要参数)，以初步估计该化合物对人类毒害的危险性。
2.阐明受试化合物急性毒性的剂量－反应关系与中毒特征。
3.利用急性毒性试验方法研究化合物在机体内的生物转运和生物转化过程及其动力学变化。
也可用于研究急救治疗措施。
二、实验动物和染毒方法(一) 实验动物选择在卫生毒理学领域中，体内试验以实验动物为研究对象，最终是为了阐明受试外来化合物对人的急性危害性质和危害强度。
所以选择实验动物时，要求在其接触化合物之后的毒性反应，应当与人接触该化合物的毒性反应基本一致，虽然利用任何一种或几种实验动物的急性毒性结果向人外推都必须十分慎重，但这一选择实验动物的原则仍非常重要。
(整理)经口毒性实验
急性经口毒性试验Acute Oral Toxicity Test1 范围本方法规定了动物急性经口毒性试验的基本原则、技术和要求。
本方法适用于评价化学品的急性毒性作用。
2 规范性引用文件OECD Guideline for Testing of Chemicals (No. 401. Feb. 1987 ) OECD Guideline for Testing of Chemicals (No. 425. Feb. 2001 ) USEPA OPPTIS Health Effects Guideline (Series 870.1100 June 1996)3 试验目的3.1 检测化学品对实验动物的急性毒性作用和强度。
3.2 为亚急(慢)性等毒性试验提供剂量选择的依据。
3.3 试验结果可作为化学品急性毒性分级和标签标识。
４定义4.1 急性经口毒性(Acute Oral Toxicity): 一次或在24h内多次经口给予实验动物受试样品后，动物在短期内出现的健康损害效应。
4.2 经口半数致死剂量（Oral Median Lethal Dose）: 经口一次或24h内多次经口给予受试样品后，引起实验动物总体中半数死亡的毒物的统计学剂量。
以单位体重接受受试样品的质量(mg/kg bw或g/kg bw)来表示。
4.3 剂量-反应关系(Dose-response Relationship)：表示化学毒物的剂量与某一群体中质效应的发生率之间的关系。
5 试验基本原则以经口灌胃法给予各试验组动物不同剂量的受试样品，每组用一个剂量，染毒剂量的选择可通过预试验确定。
染毒后观察动物的毒性反应和死亡情况。
试验期间死亡的动物要进行尸检，试验结束时仍存活的动物要处死并进行大体解剖。
本方法主要适用于啮齿类动物的研究，但也可用于非啮齿类动物的研究。
6 试验方法6.1 受试样品的处理受试样品应溶解或悬浮于适宜的赋形剂中，（不溶性固体或颗粒状物质研磨、过100目筛）建议首选水或食用植物油（如玉米油）作溶剂，也可考虑使用其它赋形剂（如羧甲基纤维素、明胶、淀粉等）等配成混悬液；不能配制成混悬液时，可配制成其它形式(如糊状物等)，但不能采用具有明显毒性的有机化学溶剂。
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实验一发光细菌的急性毒性评价试验一、实验器材1.菌株明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum）2.培养基酵母膏0.5%，胰蛋白胨或多聚蛋白胨（Polypetone）0.5%，甘油0.3%，NaCl 3%，Na2HPO4 0.5%, KH2PO4 0.1%，pH6.5。
固体培养基再加琼脂2%。
3.溶液、试剂及待测物质酵母粉，蛋白胨，NaCl（AR），Na2HPO4（AR），KH2PO4（AR），甘油（AR），二甲基亚砜（AR），乙酸乙酯（AR），HCl（1M），去离子水。
4.仪器及其他用品生物毒性测试仪；电热恒温鼓风干燥箱；振荡培养箱；DELTA 320pH计；氮吹仪；镊子，移液枪，三角锥形瓶等。
二、目的要求1.学习了解发光细菌的急性毒性评价试验的基本原理。
2.掌握发光细菌的急性毒性评价试验的操作要领和评价方法。
三、基本原理发光细菌是指在正常的生理条件下能够发射肉眼可见的蓝绿色荧光的细菌，这种可见荧光波长在450-490 nm之间，在黑暗处肉眼可见。
不同种类发光细菌的发光机理是相同的，都是由特异性的荧光酶(LE)，还原性的黄素(FMNH2)，八碳以上长链脂肪醛(RCHO)，氧分子(O2)所参与的复杂反应，大致历程如下：FMNH2+LE→FMNH2·LE+O2→LE·FMNH2·O2+RCH→LE·FMNH2·O2·RCHO→LE+FMN+ H2O+RCOOH+光具体来说，生物发光反应由分子氧作用，胞内荧光酶催化，将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为FMN及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长为407-409 nm处的蓝绿光。
发光细菌法是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光细菌发光强度的影响。
发光细菌含有荧光素、荧光酶、ATP等发光要素，在有氧条件下通过细胞内生化反应而产生微弱荧光。
当细胞活性升高，处于积极分裂状态时，其ATP含量高，发光强度增强。
发光细菌在毒物作用下，细胞活性下降，ATP含量水平下降，导致发光细菌发光强度的降低。
实验显示，毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系，因而，可以根据发光细菌发光强度判断毒物毒性大小，用发光度表征毒物所在环境的急性毒性。
四、操作步骤1. 待测样品处理1) 萃取将降解后的培养液组(样品，30 mL)用等体积的乙酸乙酯萃取四次，前两次不酸化，后两次需用HCl酸化（浓盐酸，一滴，约0.2 mL）。
步骤如下：先加一滴浓盐酸（如需酸化），再加入30 mL乙酸乙酯，将锥形瓶用封口膜及报纸封口，放入摇床摇30分钟，取出，将上清液与下层液体分离，继续进行下一次，上清液即我们所需样品。
2）氮吹四次萃取液合并后，摇匀，并取10 mL的萃取液于试管内在40℃下氮吹至乙酸乙酯挥发干净，并放入-20℃冰箱待用。
2.培养基的配置以及发光细菌的培养配置培养基所需试剂及剂量如下表所示：培养基成分培养基含量（g/L）酵母粉 5蛋白胨 5NaCl 30Na2HPO4 5KH2PO4 1甘油 3培养基为100 mL，按上表加入各成分后，需将pH调整至7.2，发光细菌的接种量为10%，培养温度为18℃，需放置在150 rpm的暗摇床中，培养18-20个小时后达到发光细菌的稳定生长期，即可以进行毒性评价使用。
接种：接种前，配置好的培养基应放入灭菌锅内灭菌，灭菌结束后，取出放入无菌操作台内冷却至室温，同时无菌操作台用紫外灯消毒15分钟，消毒完成后打开通风，点燃酒精灯（一切操作要在酒精灯边完成），将培养基封口膜打开约三分之二，然后将原本保存在冰箱内的装在EP管内的发光细菌用移液枪移入培养基内，即可，随后放入暗摇床内培养。
3.利用发光细菌进行毒性评价在冷藏的样品中加入2.5 mL配置好的2%DMSO和98%的3%NaCl混合溶液进行溶解，由于样品是放在-20℃的冰箱内保存，氮吹后的样品较难以溶解，故可以在60℃的水浴锅内进行水浴10分钟。
用配置好的DMSO和NaCl混合溶液(98%的3%NaCl和2%的DMSO)调节发光细菌溶液浓度，使其（空白样）发光度在800-1200范围内，然后即可测定样品的发光度：在溶解了的2.5mL样品中取0.2 mL于小试管中，并加入1.8 mL的DMSO和NaCl混合溶液，再加入200 μL可供检测的菌液，摇匀，静置5 min后测定并记录结果。
每个样品做3组平行样，得出的结果取平均值，作图，得到结果。
4.数据处理与分析方法相对发光率(%)=样品发光强度*100%/对照发光强度实验二蚕豆微核率检测实验一、实验器材4.实验对象松滋蚕豆（Vicia faba）5.溶液、试剂及待测物质5mol/L HCl溶液；卡然诺氏溶液：无水乙醇（或95%乙醇）：冰醋酸3:1，需现配现用；Shiff试剂：0.5g碱性品红加100ml蒸馏水于三角烧瓶中煮沸5min，并不断搅拌使之溶解。
冷却到58℃时，过滤于棕色试剂瓶中，待滤液冷却至25℃时再加入10ml 1mol/L HCl 和1g Na2S2O5（或K2S2O5）充分振荡使其溶解。
塞紧瓶塞用黑纸包好，置暗处24h后，检查染色液，若透明无色即可使用。
可将其置于4℃冰箱保存，若出现沉淀则不能继续使用；SO2洗涤液：现配现用，取10% Na2S2O5（或10%K2S2O5）溶液5ml，加1mol/L HCl溶液5ml，再加100ml蒸馏水配置而成。
4.仪器及其他用品显微镜，解剖盘，培养皿，尼龙纱布等。
二、目的要求1.学习了解蚕豆微核率检测实验的基本原理。
2.掌握蚕豆微核率检测实验的操作要领和评价方法。
三、基本原理蚕豆根尖细胞在分裂时，染色体要进行复制，在染色体的复制过程中常发生断裂，断裂下来的断片在正常情况下能自行复位愈合，这样细胞可以维持正常生活。
如果在细胞分裂是受到外界诱变因子的作用，不仅会阻碍染色体片段的愈合，而且有随因子作用使断裂程度加重的趋势，于是在细胞分裂中会出现一些染色体片段，这些片段由于不具有着丝点而不受纺锤丝牵引，游离在细胞质中。
当新的细胞核形成时，这些片段就独自形成大小不等的小核，即微核。
由于产生的微核数量与外界诱变因子的强弱成正比，所以可以利用微核率来表观环境中毒性物质的毒理情况，如：多环芳烃的影响程度。
四、操作步骤1.浸种松滋青皮豆种子于自来水（或蒸馏水）25℃温箱26 h-30 h，期间至少换水2次（水事先置于25℃中）2.催芽待种子吸胀后，用纱布包裹与解剖盘内，保持湿度，25℃催芽12h-24h。
待初生根露出2-3mm，再选取发芽良好的种子放入尼龙纱网中并将其放入盛有自来水（蒸馏水）的解剖盘中，使根尖与水接触，仍置于25℃温箱继续催芽，每天换水，经36h-48h初生根至2-3cm 时，选择粗细，长短一致且发育良好的种子用于检测。
3.染毒每组6-8粒，放入盛有被测液的培养皿中，根据文献报道，可设置待检液的浓度梯度及对照组。
用被测液浸泡根尖4-6h即可。
4.恢复将处理的种子用自来水（蒸馏水）浸洗3次，每次2-3min。
洗净后的种子再放入铺好脱脂棉的培养皿中25℃温箱恢复22-24h。
5.固定将恢复后的种子从根尖顶端切下1cm的幼根放入烧杯中，加卡诺氏固定液固定24h（固定后的幼根若不及时制片可换入70%乙醇中4℃冰箱保存）。
6.染色1）固定好的幼根用蒸馏水浸洗2次，每次5min。
吸净蒸馏水后，再加5mol/L HCl浸泡，连瓶放入28℃水浴锅中水解幼根10min至幼根软化。
7.脱色用蒸馏水浸洗幼根2次，每次5min。
吸净蒸馏水后，在暗室或遮光条件下加shiff试剂，用量掩住幼根高出2mm为宜，4-6h。
随后，再用SO2洗涤液浸洗幼根2次，每次5min，再用蒸馏水浸洗5min后将幼根放入新换的蒸馏水中4℃冰箱保存，供随时制片。
8.制片将幼根放在干净的载玻片上，用解剖针截下1mm左右根尖，滴上少许45%的醋酸溶液，用解剖针将根尖捣碎后加上盖玻片，并在盖玻片上加一小块滤纸后轻轻敲打压片。
9.镜检先置低倍镜下找到分生组织区且细胞分散均匀，膨大，分裂相较多的的视野，再换高倍镜（物镜40×）下观察。
实验三单细胞凝胶电泳（彗星实验）实验一、实验器材1.细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。
2.培养基培养基：10％新生牛血清，90％RPMI-1640培养液；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；Triton X-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。
3.溶液、试剂及待测物质Tris-HCl (pH7.5) 缓冲液或双蒸水，溴化乙锭，生化试剂均为分析纯。
4.仪器及其他用品电泳仪；电泳槽；显微镜；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.2，/index.php下载)二、目的要求1.学习了解彗星实验的基本原理。
2.掌握彗星实验的操作要领和评价方法。
三、基本原理彗星实验(Comet assay)，又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE)，各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可在单细胞水平灵敏、快速地检测DNA 损伤。
可用该方法检测，并在统计学基础上对损伤程度做出评估。
本实验对受类重金属，重金属及有机污染物等污染的实际场地的提取水样进行细胞培养，诱导K562细胞DNA损伤，用彗星实验检测损伤程度，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标来评价污染样的毒理特征。
四、操作步骤1. 各种培养的K562细胞用冰冷的PBS 洗1~2次，离心收集，用PBS 0.3 ml重悬，密度为1×105-6个/ml。
2. 铺胶下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS 配制：第1层凝胶的制备：用微波炉加热溶解正常熔点琼脂糖(NMA)，再冷至45～60℃，取适量（100μL~1ml）铺于载玻片上，立即盖上干净盖玻片，再置4℃下至少30min 使NMA 凝固。
也可以先铺胶，晾干后无尘存放，1周内使用。
第2层凝胶的制备: 低熔点琼脂糖LMA在微波炉中加热使之完全溶化，冷至37℃（可以放置于细胞培养箱中或水浴箱冷却至37℃，低熔点琼脂糖LMA在37℃可维持3小时）。
移去盖玻片，将20μL 细胞悬液和75μL的LMA 混合均匀,然后，迅速将适量含细胞的LMA 滴到第1 层琼脂糖上，立即盖上干净盖玻片，置4℃30min 使第2 层LMA 凝固。
注意，使用盖玻片的目的是使琼脂糖平整，显微镜下方便观察。
3. 细胞裂解移去盖玻片，将载玻片置于平皿中，轻轻加入预冷的新鲜配置的细胞裂解混合液(PH 10.0)。