彗星实验
彗星实验步骤Comet assay
水稻植株彗星实验步骤
通过将Singh和Gichner等人建立的碱性彗星实验方案应用于水稻（Oryza sativa L.）来确定原发性DNA损伤。
所有的实验步骤都是在冰床上避光进行的。
1、对于每一盆水稻，取鲜叶0.1 g，用刀片切碎，加入2个100 μL装有三羟甲基氨基甲烷盐酸提取缓冲液（Tris-HCl提取液，0.1 M，pH=7.5，4℃保存）的离心管中；
2、每个离心管中取75 μL含细胞核样本添加到150 μL低熔点琼脂糖凝胶（LMPA，1%）中，混合；
3、取75 μL上述混合物，沉积在用正常熔点琼脂糖凝胶（NMPA，1%）制备的载玻片上，然后盖上盖玻片；
4、重复步骤3，每个样品制备3张载玻片，4℃保存15min；
5、在载玻片上添加一层LMPA以保护含有核的凝胶层；
6、将载玻片置于含有强碱性缓冲液（0.3 M NAOH和1 M EDTA，pH＞13）的电泳槽中浸泡15 min，诱导DNA的展开和变性；
7、电泳，电压为25 V，电流为30 mA，持续5 min，将DNA片段从未受损的DNA链中分离出来，温度4℃，避光；
8、观察载玻片，每张载玻片分析30个核，利用连接到图像分析系统的摄像机对彗星进行了检测，并利用图像软件分析；
9、彗星尾部端点强度（TI）与DNA损伤水平呈线性关系。
彗星实验步骤范文
彗星实验步骤范文彗星是一种天体现象，指的是在太阳系内绕太阳运行的一类小天体。
彗星的核心主要由冰和岩石组成，当与太阳接近时，晶体冰会热化并以气体形态释放出来，形成彗尾。
彗星实验可以帮助我们更好地理解彗星的形成和性质。
以下是彗星实验的步骤：材料：-一块冰块-一盆水-一小束干冰-一台射灯或强力手电筒-一个黑暗的室内或夜晚的户外空间步骤1：准备冰块和水在一盆水中放入一块冰块，确保冰块完全浸泡在水中。
这样可以模拟太阳系中的彗核。
步骤2：制作彗尾将一小束干冰放在碗中或任何合适的容器中。
干冰是固态二氧化碳，具有非常低的温度，当它接触到周围的空气时，会迅速蒸发并形成气体。
这模拟了彗星接近太阳时晶体冰的热化过程。
确保干冰不会直接接触到水。
步骤3：创建黑暗环境将彗星模型置于黑暗的室内或夜晚的户外空间中。
这样可以让彗尾更加清晰可见。
步骤4：使用射灯或手电筒将射灯或强力手电筒对准盆中的冰块，并打开它。
这样可以模拟太阳的辐射对彗核的加热作用。
步骤5：观察彗尾的形成当射灯或手电筒照射到冰块上时，干冰会迅速蒸发，并产生一道透明或白色的气体云。
这个气体云模拟了彗尾的形成，它会围绕彗核散开。
步骤6：测量和记录使用测量工具可以测量彗核的直径，以及彗尾的长度和宽度。
同时，记录彗尾的颜色和形态。
步骤7：改变实验条件尝试改变冰块的形状、大小和温度等条件，观察和记录彗尾的变化。
这有助于了解不同条件对彗尾的影响。
步骤8：分析和总结根据观察和记录的数据，分析彗尾的形成和特征。
比较不同实验条件下彗尾的差异，并总结出彗尾的性质和形成机制。
总结：通过这个实验，我们可以更好地理解彗星的形成和性质。
彗尾的形成是由彗核受到太阳辐射的加热而导致晶体冰热化释放出来的气体所形成的。
实验中可以通过改变不同的条件，观察和比较彗尾的差异，更深入地了解彗尾的形成机制。
此外，实验还可以帮助我们理解彗星的形态特征，如彗核的大小、彗尾的长度和宽度等。
在实验的基础上，我们可以进行更深入的研究，以便更好地了解和探索太阳系中的彗星现象。
彗星实验
彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。
本实验对Singh 等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。
用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。
1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％ CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。
1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。
1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；TritonX-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC 分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。
其余生化试剂均为分析纯。
电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.21.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。
实验分为对照组和8个照射组，各照射组分别照射3、5、10、40，60、120、180、240 s，对照组不进行紫外线照射，之后进行彗星实验。
体内彗星试验
附件15体内彗星试验In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay1 范围本规范确定了体内彗星试验的基本原则、要求和方法。
本规范适用于化妆品原料的遗传毒性检测。
2 试验目的评价化妆品用原料的遗传毒性。
3 定义3.1 碱性单细胞凝胶电泳：在单个细胞或细胞核水平检测DNA损伤的一种敏感技术。
3.2 彗星：经过电泳后细胞核的形状，形似彗星。
细胞核部分形成彗星头部，在电场力的作用下脱离细胞核的DNA片断形成彗尾。
3.3 “刺猬状”细胞：显微图像下由小或模糊不清的头以及大的弥漫性尾组成的细胞。
3.4 尾部DNA含量：反应总强度（彗头与彗尾之和）中彗星的强度。
可反应DNA片断的数量，用百分比表示。
3.5 最大耐受剂量：试验期内引起动物产生轻微毒性效应的最高剂量，在这个剂量下，动物产生明显的临床体征，如异常行为或反应，轻微的体重下降或靶组织细胞毒性，但是并不会引起死亡或痛苦。
4 试验原理DNA双螺旋结构在强碱性溶液中（pH>13）会松弛，在电场力的作用下，正常的DNA 保留在原位不动，而单链或双链DNA断裂所形成的DNA片断在会向阳极移动，形成彗星状。
DNA片断所形成的彗星状拖尾的长度及强度可以反应DNA片断的大小和数量。
通过检测尾部DNA含量（%）等终点指标可以评价DNA损伤程度。
5 试验基本原则动物染毒一定时间后处死并解剖动物，获取靶器官，制备单细胞悬液。
单细胞悬液与琼脂糖混合后经过裂解过程去除细胞膜，并暴露于强碱性溶液（pH>13）中进行DNA解旋，经过电泳、固定、染色，在荧光显微镜下观察，通过分析软件对彗星状细胞进行分析，判定DNA损伤程度。
每个样品需分析足够数量的细胞进行最终结果评价。
6 溶液的配制（所有溶液均现用现配）6.1 0.5%(w/v) 低熔点凝胶低熔点胶以0.5%(w/v)的浓度溶于D-PBS（无Ca2+、Mg2+和酚红）溶液中，并利用微波炉加热。
彗星试验
单细胞凝胶电泳分析法单细胞凝胶电泳分析法(彗星分析法)治愈癌症是一个难题,长期以来科学家们一直在苦苦探索.我们目前知道,致癌的过程与许多因素有关，但如果我们能阻止其中的任何一个步骤，癌细胞便无法形成。
因此,探测致癌物质的技术与癌细胞的及时发现就显得尤其重要！然而截至目前为止，科学家们仍无法研究出一种简易基因测试法或综合的方法来检测出可能的致癌物。
因此，致癌物对ＤＮＡ的作用仍是癌症研究的一个重要课题。
遗传毒物学为一专门研究化学及各类物质对人体遗传基因影响的科学。
人体每天暴露在大量的化学物质当中，为了诊测这些物质对人体ＤＮＡ的影响，科学家们发明了多种测定方法，然而，多年来人们所使用的这些测试方法却不能准确与快速的辨识出会使人体致癌的物质。
为了解决这些问题，单细胞凝胶电泳法（Single Cell Gel Assay）应运而生，通常亦称之彗星分析法（Comet Assay）。
它之所以称为彗星分析法是因为被破坏的DNA形似彗星，此方法已被证实是最具敏感性又最具快速性的方法。
研究人员使用这种方法可在２４小时内获得初步结果，在十天之内能得到结论性的证据。
此种测定方法速度远快于其它方法，不仅可以测出某种物质是否是致癌物，而且还可测出被破坏细胞的损害程度。
彗星分析法是用来判别某种物质是否是致癌物，并衡量其对人体ＤＮＡ修补的影响程度，这一分析过程是将健康的人体白血球接触于被测试的物质后，然后再用彗星分析法来进行测试，如果被测试的物质是致癌物质，那么ＤＮＡ将被破坏，而被损坏的ＤＮＡ将开始游离细胞核，形成彗星形状。
ＤＮＡ受到致癌物质的损坏愈大，ＤＮＡ碎段就愈多，愈小的ＤＮＡ碎段游离的速度就愈快，也游离愈远，因而形成了彗星的尾部，而较大的一些碎段位置则靠近细胞核，因而形成彗星的头部。
ＤＮＡ碎段的游动的程度不同 使它呈现出彗星状，使研究人员能很容易看清细胞的损害程，彗星的长度与ＤＮＡ的损害程度有关，此长度是指从细胞核到彗星尾端的距离，也就是说，彗星尾端愈长，细胞的损害程度愈大。
彗星实验
彗星实验收集目标细胞：处死小鼠后，迅速分离肝脏，选取最左叶肝脏，在4℃放置2h的PBS溶液中多次清洗，直至看不到血液。
将肝组织至于含有2 mL4℃PBS 溶液的小烧杯中，用小剪刀剪碎（2-3 mm）。
台盼蓝排斥法检测细胞活力，细胞存活率大于95%方可用于实验，调整细胞密度为5×105-106个/ml。
此步在暗室中进行。
制片：取100 μL置于45℃预热的0.75% NMA滴加于载玻片一侧，迅速盖上盖玻片（24 mm×50 mm），注意不要产生气泡，至4 ℃凝固约20分钟后轻轻移去盖玻片。
吸取10 μL待检测的细胞悬液与100 μL 37℃预热的0.75% LMA混匀，迅速将细胞混悬液滴加到第一层凝固的NMA上，再迅速盖上盖玻片使其均匀铺开，同样需避免起泡。
将玻片至4℃凝固约30 min，操作注意避光，每只动物制作三张平行片。
裂解：轻轻移去盖玻片，将载玻片水平轻缓浸入4℃预冷的裂解液（pH= 10），于4℃避光放置1 h。
解旋：轻轻拿出载玻片，浸入PBS缓冲液5 min，用滤纸吸去多余水分后放入电泳槽。
玻片并列放置，不留空隙。
将新鲜配置的冰冷电泳缓冲应用液轻轻倒入电泳槽，使液面完全覆盖载玻片，放置20 min解旋。
避光进行。
电泳：根据预实验，设置电泳仪25V、300 mA电泳20 min。
避光进行。
中和：切断电源，小心取出玻片，置染缸，中和缓冲液浸洗，3次×5 min/次。
脱水保存：从电泳仪中轻轻取出载玻片，浸入PBS缓冲液2次×5 min/次。
吸干周围水分后放入乙醇脱水，约1 h后取出自然晾干保存。
染色：在玻片上滴加EB染色液50 μL（5 μg/mL）染色，盖上新盖玻片。
用滤纸吸去多余染料，于2 h内使用荧光显微镜镜检。
镜检：EB染色后，未受损细胞在镜下表现为为圆形荧光核心，只有彗星头部，没有明显的尾。
受损细胞则有彗星尾伸向正极，形成一个亮的头部和尾部，形似彗星。
彗星实验
彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。
本实验对Singh 等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。
用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。
1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％ CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。
1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。
1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；TritonX-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC 分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。
其余生化试剂均为分析纯。
电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.2，/index.php下载)；CO2培养箱：BB16HF型(上海力申科学仪器有限公司)；环地牌紫外辐照计(北京师范大学光电仪器厂)。
1.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。
彗星实验_精品文档
彗星实验引言彗星一直以来都是天文学家们极感兴趣的研究对象。
这些神秘的天体经常在夜空中出现，但它们的起源和特性仍然是一个谜。
为了更好地理解彗星，科学家们进行了许多实验研究，探索彗星的成因、组成和行为。
本文将介绍一些与彗星相关的实验研究，以及这些实验对科学理解的贡献。
一、彗星的成因实验彗星的成因一直是科学家们关注的焦点。
根据现代天文学的认识，彗星由冰和尘埃组成的核心围绕太阳运行而形成，当彗星靠近太阳时，由于太阳的热量，核心表面的冰会汽化并形成彗尾。
为了验证这一理论，科学家进行了一系列实验。
实验1：模拟彗星核心科学家使用低温环境下的实验设备，模拟了彗星核心的条件。
他们将不同比例的冰和尘埃混合物注入真空箱中，然后通过控制温度和压力来模拟彗星附近的条件。
结果显示，当冰暴露在太阳热量下时，会出现蒸发现象，形成气体云团。
实验2：热解冰的实验为了更好地理解彗星冰的汽化过程，科学家进行了热解冰的实验。
他们使用激光或加热器对不同类型的冰进行加热，观察其汽化速率和生成的气体成分。
通过这些实验，科学家发现不同类型的冰具有不同的汽化温度和成分。
这些发现有助于推动彗星的起源研究。
二、彗星成分的研究实验除了了解彗星的成因外，科学家们还对彗星的成分进行了深入研究。
彗星的核心主要由冰、岩石和有机物质组成。
为了确定彗星的成分，科学家开展了一系列实验。
实验3：分析彗星样本在现实情况下，样本收集是非常困难的，因为彗星的远离地球。
然而，科学家有机会分析来自彗星的尘埃颗粒和气体，这些尘埃和气体是由彗星释放的。
通过采集和分析这些样本，科学家能够了解彗星中存在的化学物质和元素。
实验4：模拟彗星成分为了更好地理解彗星的成分，科学家基于已有的数据和实验结果，制作了模拟彗星成分的实验材料。
这些材料通常由冰、尘埃和有机物质组成，以模拟彗星核心的成分。
科学家通过研究和分析这些模拟物质，进一步了解彗星成分的可能性。
三、彗星行为的实验研究除了了解彗星的成因和成分外，科学家们还对彗星的行为进行了实验研究。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
应用慧星试验研究细胞D NA损伤的原理与方法山西大学生命科学系环境生物毒理学研究室(太原030006) 孟紫强中国辐射防护研究院二所 张连珍 提 要 对应用慧星试验(即单细胞微凝胶电泳(SCGE技术)研究细胞DNA损伤的操作过程、技术原理以及实验操作过程中应注意的事项,进行了详细介绍和讨论。
关键词 慧星试验 单细胞微凝脉电泳 DNA损伤 哺乳类细胞 淋巴细胞 诱变剂往往是通过引起DNA损伤而诱发细胞突变和癌变。
近年来由Singh等改进和建立的慧星试验(Com et assay)即单细胞微凝胶电泳(SCGE)技术,是一项测定和研究细胞DNA损伤的新技术,该技术在国外有关研究领域内已得到广泛的应用〔1,2〕。
但在我国有关研究报道甚少。
为此,本文对我们研究室建立和改进的SCGE技术作了详细报道,以期与国内同行交流和进一步改进。
1 SCGE测定原理哺乳类细胞和人血淋巴细胞,其DNA的分子量很高且具有严密的超螺旋结构。
在理想的实验条件下,对淋巴细胞的分离、处埋、裂解、碱处理等过程均保持在避光条件下小心谨慎地操作,使细胞DNA不受损伤,其DNA结构仍象在活细胞中那样完整,外加电泳电场就不会使DNA在凝胶中泳动。
因此,在理想条件下,正常对照组细胞DNA在电泳之后仍应保持在原来位置。
在SCGE实验中,细胞DNA之所以从原位向电泳电场的阳极迁移,形成慧星状图象,其原因是:当细胞DNA受损伤产生链断裂时,DNA的超螺旋结构受到破坏;在细胞裂解液作用下,细胞膜、核膜及其它膜结构受到破坏,细胞内的蛋白质、RNA及其它成分均可进入凝胶而扩散到裂解液中,而核DNA分子量很高不能进入凝胶,只能留在原位。
在碱处理和碱性电泳液的作用下DNA解螺旋,使DNA的断链和碱易变性DNA片断从严密的超螺旋结构中释放出来;由于这些DNA断链分子量较小且碱变性为单链,所以在电泳电场中就可以离开核DNA在凝胶分子筛中向阳极移动,形成慧星状图象。
DNA受损伤愈严重,产生的断链和碱易变性片断就愈多,断链也愈小;在相同电泳条件下迁移的DNA量就愈多,迁移的距离就愈长。
因此,通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定DNA损伤程度,确定电离辐射或其它因素作用剂量与DNA损伤效应之间的关系。
我们的实验也表明,未处理的对照组淋巴细胞DNA在SCGE实验中也表现有微弱的迁移现象。
我们认为这主要是由于人血淋巴细胞从静脉血分离出来之后,体外条件必竟是一种非生理条件,离开活体的细胞不可避免地会受到某些非生理条件的不利影响,使细胞中的DNA受到不同程度的损伤,导致微量DNA在电泳中迁移。
我们在用碱洗脱法和DNA碱解旋速率法测定DNA单链断裂时,也发现未处理对照组的人血淋巴细胞和其它哺乳类细胞的DNA单链断裂占总DNA的5～30%〔3—5〕,也表明非生理条件能诱发DNA 损伤,与本实验结果一致。
2 SCGE实验方法211 细胞分离和处理 (1)人血淋巴细胞分离:从健康人静脉采血015～1mL,沿离心管管壁滴加在等体积淋巴细胞分离液液面上,3500r m in离心2m in,吸取中间层淋巴细胞於10m l离心管中,加磷酸盐缓冲液(PBS)至5m l,1500r m in离心8m in,如此重复洗涤细胞两次,再将细胞悬于PBS,置4℃待用。
(2)其它细胞的分离制备:对于体外培养的细胞株,若为贴壁生长的细胞,当细胞处于对数生长期时,可弃去培养液,加适量011%胰蛋白酶H ank’s溶液,在37℃下3-5m in,使细胞脱离瓶壁,用PBS洗涤细胞2—3次,调节至适当的细胞密度即可;若为悬浮培养的细胞,只需用PBS 洗涤细胞两次即可。
对于实体肿瘤、胸腺、脾及其它组织,可用不锈钢剪去除结缔组织,剪碎,压研通过60目不锈钢网,再用PBS洗涤细胞2—3次,调节适当细胞密度即可。
对于肝细胞的分离制备比较复杂,需经过含胶原酶和透明质酸酶的缓冲液进行器官灌注,再分离肝细胞。
(3)紫外线或Χ-线照射:取新鲜分离的淋巴细胞或其它细胞悬液,用PBS调细胞浓度为1×105个细胞 m l,于冰水浴中经紫加线或60Co-Χ线照射,照后细胞置于冰水浴中,并立即用于SCGE测定。
(4)化学处理:新鲜分离的淋巴细胞或其它细胞,在SCGE测定前用待测化学物在37℃下处理2-4h,细胞密度均为1×105个 m l。
随后将细胞保存在4℃下或冰水浴中,立即进行测定。
212 制片 (1)磨砂载玻片:用水砂纸(粒度,N o. 380)将普通光学显微镜用的载玻片(厚度较薄为宜)单面加水轻磨,使形成的磨砂面均匀细密。
磨时谨防加压过大、用力过猛,以免在载玻片面上形成粗纹痕迹。
实验发现如磨砂面有粗纹划痕,细胞裂解液处理后,载玻片上的凝胶容易脱落,选用的载玻片宜薄不宜厚,过度时会导致用荧光显微镜观察时调焦距离不够。
(2)制胶板:分作三层,第一层为正常熔点琼脂糖(NM A)层,第二层为含有细胞的低熔点琼脂糖(LM A)层,第三层又为LM A层。
第一层除了使第二层紧密附着外,还可使第二层的所用细胞处在相同条件下,第三层可防止第二层细胞DNA在碱处理和电泳时脱离凝胶,使所有细胞DNA在同样的电泳条件下。
第一层凝胶的制备:将上述磨好的载玻片,磨砂面向上,预热40℃左右,将预热45℃的100uL015%正常熔点琼脂糖(NM A)的无Ca2+、M g2+磷酸盐缓冲液(PBS)滴在载玻片上,迅速盖上干净的1号盖玻片,再置4℃下10m in使NM A 凝固。
在第一层凝胶制备过程中,特别注意载玻片不可象个别文献介绍的那样预冷,而是要预热。
我们的实验证明载玻片预冷使凝胶凝固过快、铺展不匀、且易脱落。
另外,1号盖玻片必需清洗干净,用前用无水酒精擦洗干净,盖在第一层凝胶上之后要立即放入4℃冰箱中,以便在下步移开盖玻片时不会把第一层胶破坏。
第二层凝胶的制备:将10ΛL含有1000个受检人血淋巴细胞的PBS和75Λl含015%LM A的无Ca2+、M g2+ PBS分别在37℃下预热并相混。
继之,轻轻揭去盖玻片,迅速将含细胞的LM A滴到第一层琼脂糖上,立即盖上另一干净盖玻片,置4℃10m in使第二层LM A 凝固。
第三层凝胶的铺制:第二层LM A凝固后,在室温下小心移去盖玻片,滴加预热37℃的75Λl含015% LM A的无Ca2+、M g2+PBS,如上盖上盖玻片4℃下凝固。
(3)细胞裂解:移去盖玻片,将凝胶水平浸入新配制的预冷的4℃细胞裂解液(215mo l L N aC l,100mmo l L N a2ED TA,10mmo l L T ris-HC l pH10,1%肌氨酸钠,用前加1%T riton X-100,10%二甲基亚砜)中至少2h。
这一处理可使细胞膜、核膜和其它生物膜破坏,细胞内的蛋白质、RNA、及其它成份扩散出胶进入裂解液内,只有细胞DNA由于它的高分子量和超螺旋结构,仍保持在原处,对于正常的未处理的细胞其DNA结构在理想条件下应仍象在细胞中那样。
(4) DNA碱解旋:将凝胶取出,用吸水纸吸干裂解液,并列置于水平电泳槽的阳极端,电泳槽中盛有新配制的碱性电泳缓冲液(1mmo l L N a2ED TA,300mmo l L N aOH),约覆过凝胶胶面0125c m左右,放置40m in,以便使DNA在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段,使DNA断链在电场中易于迁移。
我们在预试中观察到碱解旋时间延长可使DNA迁移长度增加。
(5)单细胞电泳:在电压25V、电流300mA下,电泳40m in,电压、电流可用改变缓冲液面高低来调节。
在预试中观察到电泳时间加长可使DNA迁移长度增加。
(6)中和与染色:电泳后将载玻片凝胶平放在小瓷盘内。
为使凝胶中的碱液中和,缓缓沿壁加入014mmo l L T ris-HC l(pH715)缓冲液,将凝胶淹没15分钟,再将T ris-HC1缓冲液吸去,用滤纸将盘内液体吸干,再缓缓加入无水乙醇将凝胶浸埋1h。
之后,吸去乙醇,凉干或室温下过夜。
每凝胶加50u l30ug m l溴化乙锭(EB)水溶液,再盖上盖玻片染色20m in。
本实验发现酒精处理可明显增强DNA荧光强度。
EB染液在4℃下至少可保存6个月,而不是个别文献所说的只能保存二周。
213 观察和拍照 EB梁色后的样本应尽快在荧光显微镜下观察电泳图象,本实验采用奥林帕斯荧光显微镜紫外光(U)激发、DNA图象呈橙黄色,可清楚地观察到核DNA和迁移的DNA(即慧星尾)。
每个样本随机选择25个细胞,尽快用目镜测微尺测定核DNA直径和DNA迁移的长度。
有条件者可借助图象分析仪进行分析。
对细胞DNA电泳图象也可拍照记录,本实验拍照条件为目镜10X、物镜40X,采用乐凯黑白卷(A SA400)。
3 讨 论311 SCGE技术的优点及应用 一些化学、物理和生物性的诱突变剂或诱癌剂往往可引起DNA的损伤。
DNA 链断裂是细胞DNA损伤的主要类型之一。
测定细胞DNA链断裂的方法很多,例如中性或碱性蔗糖密度梯度离心法、DNA碱解旋法、中性或碱性滤膜洗脱法、DNA 粘度测量法等〔1,2〕。
这些方法所获得的结果反映了群体细胞DNA损伤效应,不能对单个细胞进行分析,而且除粘度法以外均需要对活细胞进行放射性同位素标记,设备条件和技术条件要求高,使它们的应用有一定局限性。
近年来由Singh等改进和建立的SCGE技术,与传统方法相比,其操作简便、快速、灵敏,无需放射性标记、所需细胞少,适于体内、外不同类型实验和各种类型细胞DNA 损伤的研究。
因此,SCGE法在国外有关研究领域内已得到了广泛的应用〔2〕。
SCGE技术能够对单个细胞的DNA损伤进行研究,从而避免了只能对细胞群体的DNA改变进行测定的不足。
加之,DNA荧光测定极为灵敏,这就使SCGE技术的灵敏度大为提高。
SCGE不仅可研究活细胞DNA的损伤,也可研究死细胞的DNA损伤,从而避免了只能用活细胞研究(如染色体畸变、微核、姐妹染色单体互换等)的限制,使SCGE不仅可研究低剂量下的生物效应,也可研究高剂量下的生物效应。
由于SCGE的上述优点,SCGE技术不仅可用来研究物理、化学、生物学因子,单独或联合时对细DNA的损伤和修复的效应,而且可用于研究抗癌药物的抗癌作用机理,细胞调亡(A pop to sis)过程、放射和化学防护、肿瘤放射治疗监护等领域的问题,相信SCGE技术将迅速在我国推广应用起来。
312 SCGE试验操作的几点体会 本文在方法建立中发现,制胶时环境温度很重要,尤其是第一层凝胶的铺制,载玻片必须预温40℃左右。
有的文章介绍预冷载玻片是不可取的,预冷的玻片往往使融化的琼脂糖液来不及铺展就凝固起来,导致制胶失败;制胶用的载玻片要用水磨细砂磨匀,胶片的各项处理,均要轻拿轻放,以防胶板从载玻片上滑落;盖玻片应用洗液洗净,浸泡于70%乙醇中,用前用无水乙醇擦净、凉干、保持清洁,以防盖玻片与凝胶粘连,移去盖玻片时破坏胶板;为了增强DNA荧光强度,一方面可选择效优的荧光染料,增高荧光染料的浓度(本文用EB浓度达13ug mL),另一方面可先用无水酒精处理胶板,使DNA聚集而浓缩,对提高DNA的荧光强度很有效果;DNA用EB染色,用目镜测微法测定DNA迁移长度时,荧光显微镜的激发光宜为紫外光,因为DNA对260nm的紫外光吸收最大,使插入DNA分子中的EB 分子产生的荧光也最强,有的文章报告用515～560nm 光作激发光,在本试验中是不可取的;对细胞DNA迁移长度及光密度进行测定要迅速,激发光照射DNA 时间过长,荧光将减弱,影响测定。