姜黄素对酿酒酵母抗衰老性能影响
姜黄素抗衰老作用及分子机制研究新进展
姜黄素抗衰老作用及分子机制研究新进展作者：张萌李潭林韬徐东辰龚冬梅来源：《中国医药导报》2020年第28期[摘要] 姜黄素是从传统中药姜黄中提取的多酚类活性成分，长期作为中药及调味品在国内外广泛使用。
因作用靶点多样，具有抗氧化、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤等多种作用。
近年来其抗衰老作用备受研究者关注。
本文主要从分子角度总结近5年姜黄素在神经系统、心血管系统及皮肤的抗衰老作用，为药物研发及合理应用提供可借鉴的思路。
[关键词] 姜黄素;抗衰老;氧化应激;炎症[中图分类号] R6 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2020）10（a）-0040-04Recent progress on anti-aging and molecular mechanisms of curcuminZHANG Meng LI Tan LIN Tao XU Dongchen GONG DongmeiDepartment of Pharmacology， College of Pharmacy， Harbin Medical University，Heilongjiang Province， Harbin 150081， China[Abstract] Curcumin is a polyphenolic active ingredient extracted from the traditional Chinese medicine Turmeric， which has been widely used as medicine and seasoning at home and abroad. Due to its multiple targets， it has various effects such as anti-oxidation， anti-inflammation， anti-atherosclerosis， anti-tumor and so on. In recent years， its anti-aging effect has attracted much attention from researchers. This review mainly summarizes the anti-aging effects of curcumin on nervous system， cardiovascular system and skin from a molecular perspective in the recent five years， expecting to shed new light on prospective drug discovery and rational application.[Key words] Curcumin; Anti-aging; Oxidative stress; Inflammation姜黄素是从姜科及天南星科等植物根茎中提取的酸性多酚类化合物，具有β-二酮结构，既是传统中药姜黄的主要成分，也是亚洲地区广泛使用的调味料咖喱中的主料。
生姜提取物在食品贮藏保鲜中的应用
生姜提取物在食品贮藏保鲜中的应用周纷;杨文晶;冯叙桥;张骏龙;刘丹;邓亚军;刘欢【摘要】生姜是药食两用植物,被广泛用作香辛料类调味品.生姜提取物化学成分比较复杂,主要有姜辣素、挥发油和二苯基庚烷等多种天然成分,具有良好的抗菌作用和抗氧化作用,被广泛应用于食品保鲜.该文介绍了生姜提取物的主要成分,阐明了活性成分的抑菌作用,综述了生姜提取物在食品贮藏保鲜中的应用现状,并结合实际展望了生姜提取物的发展与应用前景.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2016(042)010【总页数】6页(P287-292)【关键词】生姜提取物;主要成分;抑菌;贮藏保鲜【作者】周纷;杨文晶;冯叙桥;张骏龙;刘丹;邓亚军;刘欢【作者单位】渤海大学食品科学与工程学院,辽宁锦州,121013;渤海大学食品科学与工程学院,辽宁锦州,121013;渤海大学食品科学与工程学院,辽宁锦州,121013;渤海大学食品科学与工程学院,辽宁锦州,121013;渤海大学食品科学与工程学院,辽宁锦州,121013;渤海大学食品科学与工程学院,辽宁锦州,121013;渤海大学食品科学与工程学院,辽宁锦州,121013【正文语种】中文生姜(Zingiber officinale Rosc)是一种食药两用的植物，是广泛使用的香辛料调味品，无毒副作用。
由于生姜含有蛋白质、多种维生素、胡萝卜素等营养成分和挥发油、姜辣素等多种活性物质，使其在调味料、美容和保健等多方面具有应用价值。
现代科学证实生姜具有抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、抗炎、降血脂、降血糖等药理作用[1-3]，其抗氧化能力类似于叔丁基对苯二酚(TBHQ)、丁基羟基茴香醚(BHA)和丁基羟基甲苯(BHT)的结合[4-6]。
从姜中还可以提取生姜蛋白酶，它是新型的植物蛋白酶资源，其结构和性质与木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等具有很多相似性，可应用于食品中的肉类嫩化[7]。
生姜提取物不仅具有浓郁的香气、独特的辛辣味以及较强的抑菌、保鲜、护色等作用，而且安全性高，具有极大的开发利用价值和应用前景[8]。
基于姜黄素对机体的药理研究及应用前景
基于姜黄素对机体的药理研究及应用前景谢海潭1袁雅佳21.湖南康寿制药有限公司，湖南长沙4102002.湖南株化集团医院，湖南株洲 412000关键词：姜黄素；药理研究；应用前景【摘要】植物提取物是生物医药的核心原料和产品，目前被广泛应用于植物药、食品添加剂、功能性食品、化妆品等生产领域。
随着21世纪生物医药迅猛发展，在新的医学模式影响下，具备活性或功能性的植物提取物产品备受青睐、在世界范围内也得到广泛认可、具有广阔的市场空间、并有效推动了医药对外贸易发展。
姜黄素是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种化学成分，其中，姜黄约含3%-6%，是植物界很稀少具有二酮的色素，为二酮类化合物。
姜黄素为橙黄色结晶粉末，味微苦，不溶于水。
在食品生产中主要用于肠类制品、罐头、酱卤制品等产品的着色。
现代研究发现姜黄素可以抑制炎症反应、抗氧化、抗类风湿的作用。
姜黄素的主要药理作用有抗氧化、抗炎、抗凝、降脂、抗动脉粥样硬化、抗衰老消除自由基及抑制肿瘤生长等。
一、研究背景近年来，我国的集约化养殖业发展迅猛，与此同时也暴露出一个严峻的问题：对动物营养、生理、病理和生态等方面的基础理论和应用技术研究滞后于产业的发展，缺乏充分的科学指导，以致生产中经常出现强化投饲、滥施药物、饲料营养组成不平衡以及添加变质(如酸败油脂和霉变原料)或禁用成份(如某些激素和抗生素)等诸多问题，造成动物病害频繁发生，其中以损伤肝脏和诱发肝脏病变为特征的疾病危害甚大。
动物肝脏病变中最常见和最主要的表现形式是脂肪肝，尤以营养性脂肪肝危害最突出。
脂肪肝是一种可以由多种诱因引起的疾病，同时也是多种肝脏疾病发展中的一个病理过程，是最常见的弥漫性肝病之一，以肝细胞内甘油三酯蓄积过多为主要病理改变。
其原因是多方面的：饲料中营养过剩(如蛋白质含量过高、脂肪或糖类含量过高)、某些营养成分缺乏(如胆碱、磷脂、蛋氨酸、维生素E、维生素B12等)、抗营养因子和毒素的影响、脂肪氧化、长期的滥用或过量使用抗生素和化学合成药物等。
酿酒酵母多肽
酿酒酵母多肽
酿酒酵母多肽是由酿酒酵母经过酶解或发酵等过程得到的一种多肽类物质。
这种多肽类物质在食品、保健品、医药等领域有广泛的应用。
酿酒酵母是一种常用的微生物，具有高度的生长速度和代谢活性，因此常被用于生产各种生物活性物质。
通过特定的酶解或发酵过程，可以将酿酒酵母中的蛋白质降解成多肽类物质，这些多肽类物质具有良好的生物活性和营养价值。
酿酒酵母多肽具有多种生物活性，如抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒等。
它们可以清除体内的自由基，保护细胞免受氧化损伤；可以调节免疫功能，增强机体的抵抗力；还可以促进肠道健康，改善肠道微生态平衡等。
因此，酿酒酵母多肽在食品、保健品、医药等领域有广泛的应用。
在食品领域，它们可以作为食品添加剂，增强食品的营养价值和口感；在保健品领域，它们可以作为保健品的原料，提高保健品的功效和品质；在医药领域，它们可以作为药物的辅助剂或治疗剂，辅助治疗某些疾病。
需要注意的是，虽然酿酒酵母多肽具有一定的生物活性和营养价值，但并不是所有人都适合食用。
对于某些人来说，过量摄入酿酒酵母多肽可能会引起过敏反应或不适。
因此，在食用酿酒酵母多肽之前，最好先咨询医生或专业人士的建议。
姜黄素的功效与作用及禁忌
姜黄素的功效与作用及禁忌姜黄素是从姜黄中提取的一种活性成分，被广泛应用于医学、保健和美容领域。
在过去的几十年里，姜黄素已经成为热门的研究领域，其功效和作用也备受关注。
本文将介绍姜黄素的功效与作用，并列出了一些使用姜黄素时的禁忌。
一、姜黄素的功效与作用1. 抗氧化作用姜黄素是一种天然的抗氧化剂，可以中和自由基，降低氧化应激，保护细胞膜的完整性，减少氧化损伤，有助于预防多种慢性疾病的发生，如心脑血管疾病、肿瘤等。
2. 抗炎作用姜黄素具有强大的抗炎作用，可以抑制多种炎症介质和炎症细胞的活化，减轻炎症反应，缓解疼痛、肿胀和红肿等炎症症状。
姜黄素可用于治疗关节炎、炎症性肠病等炎症性疾病。
3. 免疫调节作用姜黄素可以调节免疫系统的功能，增强机体的免疫力，提高抗感染能力。
姜黄素还可以抑制免疫过度活化，防止自身免疫性疾病的发生。
4. 抗肿瘤作用姜黄素具有抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的作用。
研究发现，姜黄素可抑制肿瘤细胞的生长和迁移，减少肿瘤的侵袭和转移，提高放化疗的疗效。
5. 促进消化作用姜黄素可以增加胃酸和胆汁分泌，促进消化液的生成和排泄，有助于消化食物，减少胃肠道问题的发生，如胃肠胀气、胃灼热、胃溃疡等。
6. 降脂作用姜黄素可以降低血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇的水平，提高高密度脂蛋白胆固醇的水平，预防和改善动脉粥样硬化，降低心脑血管疾病的发病风险。
7. 保护肝脏作用姜黄素可以抑制肝细胞的氧化损伤，减少肝脏脂质过氧化，保护肝细胞的结构和功能，预防和改善脂肪肝、肝炎等肝脏疾病。
8. 抗菌作用姜黄素具有一定的抗菌作用，可以抑制多种细菌、病毒和真菌的生长和繁殖，起到预防和治疗感染性疾病的作用。
9. 抗衰老作用姜黄素可以减少氧化损伤，保护细胞的DNA和蛋白质，提高细胞的抗氧化能力和修复能力，延缓细胞的老化过程，起到抗衰老的作用。
10. 抗癌作用姜黄素可以干扰癌细胞的增殖、侵袭和转移，调节多种信号通路和基因的表达，减少肿瘤的恶性程度，延长患者的生存时间。
姜黄素对酵母细胞影响的荧光分析
姜黄素对酵母细胞影响的荧光分析陈晶鑫;连文华;程元初;许建华;张连茹【摘要】以最简单的真核生物——酿酒酵母为材料,利用姜黄素的荧光性质,借助荧光光谱法和荧光显微镜研究了姜黄素在酵母细胞中的定位及其对酵母生长的影响.结果表明,姜黄素可以进入酵母细胞中并抑制酵母生长,初步得到了姜黄素对酵母作用的量效关系和时间效应结果,证明了姜黄素可以与酵母细胞线粒体结合.本文结果为以酵母为模型研究姜黄素通过线粒体影响细胞代谢及其与细胞凋亡的关系奠定了基础.%The simplest eukaryotic Saccharomyces cerevisiae was studied as the material, with the help of fluorescence properties of curcumin, using fluorescence spectroscopy and fluorescence microscopy to observe the localization of curcumin in yeast cells and its impact on yeast growth. The results show that curcumin can enter the yeast cells bind to yeast mitochondrion and inhibit the growth of yeast with a dose and time depend manner. This study provides a basis for further study of how curcumin can influence the cell metabolism by its combination to mitochondria and its relationship with cell apoptosis.【期刊名称】《高等学校化学学报》【年(卷),期】2018(039)001【总页数】7页(P71-77)【关键词】姜黄素;酿酒酵母菌;线粒体;荧光光谱【作者】陈晶鑫;连文华;程元初;许建华;张连茹【作者单位】细胞应激生物学国家重点实验室,厦门大学生命科学学院,厦门361102;细胞应激生物学国家重点实验室,厦门大学生命科学学院,厦门361102;细胞应激生物学国家重点实验室,厦门大学生命科学学院,厦门361102;福建医科大学药学院药理系,福州350122;细胞应激生物学国家重点实验室,厦门大学生命科学学院,厦门361102【正文语种】中文【中图分类】O621;Q932姜黄素类化合物(Curcuminoid)是从姜黄属植物——姜黄和郁金中提取的多酚类化合物, 主要产自印度、中国和印度尼西亚等地. 姜黄中提取的姜黄素类化合物主要有4种, 分别为姜黄素(Cur)、去甲氧基姜黄素、二去甲氧基姜黄素和环姜黄素, 其中含量最多和作用最显著的是姜黄素[1]. 姜黄素为橙黄色的结晶粉末, 不溶于水, 易溶于乙醇和冰醋酸.姜黄素具有很强的药用价值, 在抗炎、抗氧化、抑菌、抑制肿瘤、改善阿尔茨海默症及抑制动脉粥样硬化等方面均有一定的效用[2], 且无明显的毒副作用和遗传毒性[3]. 姜黄素可通过与众多靶点的相互作用起到抗炎的效果. Surh等[4]阐明了姜黄素通过抑制核因子NF-κB活性和一些炎症基因的转录, 进而抑制环氧合酶(COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达, 从而抑制炎症. 姜黄素还可通过抑制TNF-α以及白介素IL-1, IL-2, IL-6, IL-8和IL-12等炎症因子的产生而抑制炎症[5]. 姜黄素对病毒和多种微生物均具有抑制作用[6]; 张梦翔等[7]发现, 姜黄素对5种非白念珠菌的菌丝和生物膜的形成均有显著的抑制作用; 杨建等[8]研究表明, 姜黄素可以增强氟康唑对白色念珠菌的抑制作用, 从而增加凋亡细胞的数目.研究发现, 肿瘤的发生与炎症过程具有一定联系[9], 因此姜黄素的潜在抗肿瘤作用受到广泛关注. 临床研究[10～20]表明, 姜黄素可以作用于肿瘤的发生、生长、增殖和转移等各阶段. 姜黄素的抗癌作用体现在以下方面: (1) 调控细胞周期. 细胞周期紊乱以及促生长的细胞周期因子(Cyclin D1)和细胞周期蛋白质激酶(CDK)等的过度表达通常与肿瘤的发生密切相关[10]. 姜黄素可以通过调控细胞周期因子的表达将肿瘤细胞阻滞在G1和G2期等特定时期, 从而抑制肿瘤的生长[11,12]. (2) 诱导细胞凋亡. 姜黄素可以抑制抗凋亡因子-B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)基因家族的表达, 促进Bcl-2相关凋亡通道蛋白(Bax)的表达[13]; 也可以直接增强半胱氨酸天冬氨酸酶(Caspase)-3, -8和-9的活性, 诱导Caspase依赖的细胞凋亡[14]; 还可以促进分子量为53的抑癌蛋白质(p53)的表达, 进而诱导p53介导的细胞凋亡[15]. 此外, 姜黄素对核因子NF-κB的抑制作用也被认为与凋亡有关[16]. (3) 抑制肿瘤细胞转移. 肿瘤细胞的转移机制比较复杂, 通常认为细胞间的黏附性降低及血管的生成对癌细胞的扩散和转移有重要作用. 姜黄素可以调控一些上游基因的水平, 增加黏附因子的生成(如钙黏蛋白和基质金属蛋白质MMP), 进而抑制癌细胞的转移[17]; 姜黄素还可以抑制血管内皮生长因子(VEGF)的表达, 减少肿瘤血管生成[18]. (4) 抑制炎症因子产生. 癌症的发生与慢性炎症的持续作用密切相关, 姜黄素的抗炎作用对抑制癌症的发生有重要意义. (5) 对癌症疗法有增效作用. 姜黄素具有放射增敏作用, 放疗可能激活肿瘤细胞的NF-κB通路, 使其产生抗性, 而姜黄素会抑制NF-κB, 从而增强放射疗法的效用[19]. 此外, 姜黄素与一些化疗药物的联合使用也可以增强其作用[20]. 综上所述, 姜黄素因其生物活性而受到广泛关注. 但是, 其生物活性的细胞机制有待阐明.酵母作为真核生物, 具有完整的真核细胞结构, 包括核膜包被的细胞核、内质网、线粒体等细胞器和细胞骨架[21]. 酵母作为单细胞生物, 培养方便, 可以直接在培养基上快速大量繁殖; 其基因组也较简单, 基因数目较少. 1996年, 人类首次完成了酿酒酵母全基因组的测序[22], 发现至少有31%的编码蛋白基因或开放阅读框(ORF)与哺乳动物高度同源[23]. 对酵母基因组的深入研究将有助于加深对复杂真核细胞的基因组结构和功能的了解. 酵母可以进行单倍体和异源双倍体生活, 有利于观察隐性基因的表型[24]. 基于上述优点, 酵母作为一种模式生物在多个领域的研究中得到了广泛的应用. Hartwell等[25]通过对酵母细胞的研究, 发现了一系列控制细胞周期的基因并提出了控制点(Checkpoint)的概念; Fields等[26]发明了酵母双杂交系统, 可用于研究蛋白质之间的相互作用.近年来, 酵母在细胞凋亡研究中日益受到重视. Madeo等[27]最早发现细胞周期调控蛋白质(CDC48)基因的突变可以导致酵母细胞呈现出类似哺乳动物细胞的典型凋亡表型: DNA断裂、核染色质皱缩、细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻和线粒体内细胞色素c释放. 后续研究[28]表明很多内源和外源因素都可以导致酵母细胞的凋亡. 细胞凋亡过程具有很强的保守性. 酵母中控制凋亡的酵母核心调控因子1(Yca1)与哺乳动物细胞内的Caspase具有同源结构[29]. 酵母中的细胞凋亡核介导因子(Nma111p)蛋白与哺乳动物的丝氨酸肽酶2(HtrA2)蛋白具有同源性, HtrA2蛋白可以拮抗Caspase的抑制剂XIAP从而加速凋亡, Nma111p在酵母中的过度表达也可以促进酵母的凋亡[30]. 因此, 以酵母为模式生物研究细胞凋亡对哺乳动物细胞具有一定的替代性.目前, 对于姜黄素作用靶点和作用机制的研究有待进一步深化. 而酵母作为一种最简单的真核模式生物, 以其为材料研究小分子对细胞凋亡和细胞代谢的影响对揭示小分子的作用机制具有重要的参考价值. 本文采用荧光光谱法和荧光显微镜研究了姜黄素对酵母细胞和酵母线粒体作用的量效关系和时间效应, 以期为后续借助酵母细胞研究姜黄素在真核细胞内的作用靶点和抗癌机理奠定基础.酵母菌株取自厦门大学生命科学实验教学中心保存的酿酒酵母(S. cerevisiae). 姜黄素购自Sigma公司; 蜗牛酶购自厦门泰京生物技术有限公司. 所用化学试剂均为分析纯.M-3550型酶标仪(美国BioRad公司); 5417R型超速离心机(美国Eppendorf公司); Satotius BA210型电子分析天平(瑞典Satorious公司); Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司); VCX-TBSonic超声破碎仪(美国Sonic&Materials公司); AX20型荧光显微镜(日本Olympus公司); 96孔板(美国Corning公司).1.2.1 酵母菌液的准备将平板上的酵母转接至酵母浸出粉蛋白胨葡萄糖(YPD)液体培养基中, 于28 ℃摇床上培养过夜. 使用光学显微镜对酵母进行计数, 并将菌液稀释至约3.5×107 cfu/mL备用.1.2.2 试剂的准备 YPD培养基: 取蛋白胨(Peptone) 20 g、酵母浸出物(Yeast Extract)10 g和葡萄糖20 g用水定容至1000 mL, 于115 ℃高压灭菌20 min, 备用. PBS缓冲溶液(pH=7.4, 10 mmol/L): 将Na2HPO4(1.44 g), KH2PO4(0.24 g), NaCl(8 g)和KCl(0.2 g)混合, 用ddH2O定容至1 L, 调节pH=7.4, 于121 ℃高压灭菌20 min. Tris-HCl缓冲溶液(pH=7.4, 100 mmol/L): 将三羟甲基氨基甲烷(Tris, 12.1 g)加超纯水至900 mL, 调节pH=7.4后, 定容至1 L, 于121 ℃高压灭菌20 min. 姜黄素母液(100 mmol/L): 将姜黄素(368.37 mg)加二甲基亚砜(DMSO)定容至10 mL, 分装至小管, 避光保存. 预处理缓冲溶液: 将乙二胺四乙酸(EDTA, 0.1 mol)和二硫苏糖醇(DTT, 20 mmol)定容于1 L PBS缓冲溶液(pH=7.4, 10 mmol/L)中. 酶解缓冲溶液: 将MgCl2(0.25 mol)和山梨醇(0.9 mol)定容于1 L 的PBS缓冲溶液(10 mmol/L)中. 原生质体Lysis buffer: 取Tris-HCl(100 mmol), EDTA(5 mmol)和山梨醇(0.35 mol), 定容于1 L的PBS缓冲溶液(10 mmol/L)中. 线粒体洗涤缓冲溶液: 含有Tris-HCl(100 mmol/L), EDTA(2 mmol/L)和山梨醇(0.5 mol/L)的PBS缓冲溶液(pH=7.4, 10 mmol/L).1.2.3 姜黄素对酵母生长的抑制作用采用微量稀释法测定. 将菌液进一步稀释到3.5×104 cfu/mL, 在96孔板各孔中加入100 μL菌液, 再加入表1所示的姜黄素溶液(因为终浓度梯度跨越较大, 故先将100 mmol/L姜黄素稀释成一定浓度梯度的各个母液); 最后用PBS缓冲溶液补充至总体积为200 μL, 于37 ℃培养24 h, 肉眼观察菌落的形成情况. 设置2组平行实验.1.2.4 姜黄素对酵母细胞作用的量效关系测定为了考察姜黄素对酵母细胞作用是否呈现量效关系, 取数个1.5 mL 艾本德(EP)离心管, 每管加入300 μL酵母培养液(3.5×107 cfu/mL), 按表2所示的浓度梯度加入姜黄素溶液. 于37 ℃避光孵育15 min, 以13000 r/min转速离心5 min, 去除上层清液. 然后, 加入400 μL PBS缓冲溶液重悬细胞, 以13000 r/min转速离心5min, 弃去上层清液, 重复洗涤酵母细胞2次. 最后, 将酵母细胞悬浮至400 μL PBS缓冲溶液中. 取200 μL加入96孔板中, 用多功能酶标仪以425 nm波长为激发光, 扫描450～800 nm波长范围内的荧光值, 设置2组实验取平均值.分别从0号、 3号和8号试管中各取一定量细胞制片, 使用荧光显微镜, 以蓝色光为激发光进行显微观察. 以验证姜黄素抑制酵母生长的原因, 并观察荧光在细胞内的分布.1.2.5 姜黄素对酵母细胞作用的时间效应测定为了观察姜黄素进入酵母细胞的时间效应, 取数个1.5 mL管, 按照表2中的7号管的量加样. 每管加入300 μL酵母培养液(3.5×107 cfu/mL)、2.5 μL姜黄素(10 mmol/L)和2.5 μL DMSO, 用PBS缓冲溶液补充至500 μL, 使姜黄素的终浓度达到50 μmol/L. 避光及37 ℃下分别孵育0, 5, 10, 15和20 min后, 参照1.2.4节方法离心2次洗去多余的姜黄素, 用酶标仪测定荧光值. 设置2组平行实验.1.2.6 酵母细胞线粒体的提取酵母的细胞壁主要由葡聚糖和甘露聚糖构成, 将酵母细胞在巯基化合物中预处理后, 使用蜗牛酶可以水解酵母的细胞壁, 获得原生质体[31]. 将酵母接种在YPD液体培养基中, 在28 ℃下扩大培养, 采用蜗牛酶法破除细胞壁, 超声破裂原生质体后, 差速离心提取线粒体.原生质体的制备: 将菌液以11000 r/min的转速离心5 min, 收集酵母细胞. 加入预处理缓冲溶液悬浮细胞, 室温下放置30 min. 离心洗涤, 加入预先配制好的含有蜗牛酶的酶解缓冲溶液(酶浓度为20 mg/mL), 于30 ℃水浴处理60 min破碎细胞壁, 用光学显微镜观察细胞壁的破裂情况.原生质体的裂解: 破壁处理后, 以13000 r/min转速离心去除上层清液, 加入原生质体裂解缓冲溶液(Lysis buffer), 在超声破碎仪21%功率下裂解原生质体.线粒体的获取: 细胞破碎后, 以13000 r/min转速离心10 min, 弃去沉淀, 重复3次. 以18000 r/min转速离心20 min, 弃去上层清液. 将沉淀重悬于线粒体洗涤缓冲溶液中, 以13000 r/min转速离心10 min去沉淀, 以18000 r/min转速离心20 min, 所得沉淀即为线粒体.1.2.7 姜黄素与酵母线粒体的相互作用将获得的线粒体用线粒体洗涤缓冲溶液重悬, 按照V(线粒体)∶V(洗涤缓冲溶液)=1∶5稀释. 按照表3所示的量加入线粒体和一定量的姜黄素溶液(1 mmol/L), 空白管加入等量的DMSO作为对照, 加入PBS缓冲溶液补至总体积为225 μL. 混合均匀后, 于避光及37 ℃条件下孵育15 min, 用酶标仪在425 nm的激发光下扫描450～800 nm波长范围内的荧光值.经37 ℃恒温培养24 h后, 用肉眼观察菌落的形成情况, 结果如图1所示. 0号孔为空白对照, 未加姜黄素, 1～5号孔分别对应的姜黄素浓度为0.1, 1, 10, 50和100 μmol/L. 可见, 空白对照有菌落形成, 说明DMSO本身对酵母的生长无抑制作用; 1～3号孔也有菌落形成, 表明低浓度的姜黄素对酵母生长的抑制作用不明显; 4号和5号孔未见明显的菌落形成, 表明酵母的生长受到了明显抑制. 上述结果表明, 姜黄素的最低抑菌浓度为10～50 μmol/L, 高浓度的姜黄素可以有效抑制酵母的生长. 通过对比发现, 空白对照几乎无荧光, 说明酵母细胞本身在该激发波长下无可测荧光; 随着体系中姜黄素浓度升高, 荧光强度逐渐上升, 于496 nm处出现峰值. 为了更清楚地观察姜黄素对酵母细胞作用的量效关系, 以不同浓度下496 nm的荧光值为纵坐标, 姜黄素浓度为横坐标, 使用GraphPad Prism 6软件作散点图并拟合曲线, 得到图2, 经计算得出姜黄素与酵母细胞的结合常数为12.79 μmol/L. 由图2可见, 姜黄素与酵母细胞相互作用的荧光强度随浓度增加先上升后趋于平稳. 在一定的浓度范围内, 姜黄素对酵母细胞的作用呈现出量效关系, 即酵母细胞数量固定时, 随着姜黄素浓度的增加, 酵母细胞的荧光值上升.每管加入300 μL酵母培养液(3.5×107 cfu/mL), 姜黄素的终浓度为50 μmol/L, 混合均匀后于37 ℃孵育. 参照量效关系实验所得结果, 以425 nm为激发光, 在496 nm波长下测得荧光值和孵育时间的关系, 如图3所示. 由图3可见, 姜黄素进入酵母细胞的速度较快, 5 min后荧光值达最大; 5～15 min时荧光值一直保持在一个较高水平; 15 min后荧光强度开始下降. 推测有2个可能的原因: 一方面, 姜黄素对酵母细胞具有一定的毒性作用, 图1显示50 μmol/L的姜黄素已经明显抑制酵母菌落的生长, 因此处理时间过长可能导致部分细胞死亡或者姜黄素被细胞排出体外, 从而导致荧光值降低; 另一方面, 姜黄素的荧光强度会随着时间延长而逐渐衰减, 导致长时间处理荧光降低. 因此, 实验过程中孵育时间不宜超过15 min.对酵母细胞采用荧光显微观察, 结果如图4所示(放大倍数为40倍). 由图4可见, 姜黄素可以进入酵母细胞中从而使酵母细胞呈现荧光. 空白对照组在蓝色荧光激发下无荧光, 经10和100 μmol/L姜黄素处理过的酵母细胞均产生绿色荧光. 对比图4(E)和(F)可知, 姜黄素浓度越大, 荧光强度越大, 这也印证了姜黄素对酵母细胞作用的量效关系.由图4还可见, 姜黄素主要分布在酵母细胞的细胞质中, 但不能确定是否进入酵母的线粒体中. 为此, 以相同浓度的姜黄素处理大肠杆菌细胞一段时间后, 同样洗去姜黄素, 采用荧光显微镜观察, 在视野下未见类似的酵母细胞[图4(E)和(F)]中的荧光出现. 大肠杆菌无线粒体, 所以进入细胞中的姜黄素无法与线粒体结合, 因而经洗涤后不存在于大肠杆菌的细胞中.线粒体本身几乎无荧光, 随着线粒体浓度的增加, 荧光值逐渐上升, 荧光峰逐渐左移, 推测这可能与结合导致的姜黄素荧光位点结构发生变化有关.为了更直观地分析, 以线粒体与姜黄素同时存在时的荧光峰值为纵坐标, 体系中线粒体的量作为横坐标, 作散点图(图5). 由图5可见, 在姜黄素浓度一定的情况下, 荧光值的强度与加入线粒体的量之间呈现明显的正相关. 推测这是由于姜黄素的浓度过量, 与加入的线粒体结合, 并黏附在线粒体膜或腔内的一些大分子上, 致使荧光区域面积扩大, 荧光值增加. 随着线粒体浓度升高, 姜黄素展开更充分, 荧光值逐渐增大.采用荧光光谱法和荧光显微镜研究了姜黄素对酵母细胞和酵母线粒体的作用, 结果表明, 姜黄素对酵母的生长具有抑制作用. 微量稀释法结果表明, 浓度为50 μmol/L 的姜黄素可以有效阻止酵母菌落的形成. 姜黄素对酵母细胞的作用呈量效关系. 酵母细胞数量固定时, 随着姜黄素浓度的增加, 酵母细胞的荧光值上升. 姜黄素进入酵母细胞的速度较快. 于37 ℃下孵育5 min, 荧光值即可达到最大, 孵育时间不宜超过15 min. 姜黄素可以与酵母细胞线粒体结合, 而且随着线粒体浓度的增加荧光值上升, 呈现线性正相关关系.† Supported by the National Natural Science Foundation of China(No. 81373296) and the Open Research Fund of State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, Xiamen University, China(No. SKLCSB2017KF003).【相关文献】[1] Stanic Z., Plant Food. 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姜黄素对酵母细胞影响的荧光分析
基金项 目：国 家 自然 科 学 基 金 （ 批 准 号 ：８ １ ３ ７ ３ ２ ９ ６ ） 和厦 门大学 细胞应 激生 物学 国家重点实 验室 开放课 题 （ 批 准 号
Ｓ ＫＬ Ｃ Ｓ Ｂ ２ ０ １ ７ Ｋ Ｆ ０ ０ ３ ） 资助．
母生长 ， 初步得 到了姜 黄素对酵母 作用的量效关 系和时 间效应结 果 ， 证 明了姜黄 素可 以与酵母细 胞线粒 体 结合． 本文结果 为以酵母 为模 型研究姜黄素通过线粒体影 响细胞代谢及 其与细胞凋亡的关系奠定 了基础．
关键词 姜黄素 ； 酿酒 酵母 菌 ； 线粒体 ； 荧 光光 谱
子的表达将肿瘤细胞阻滞在 Ｇ １ 和Ｇ ２期等特定时期 ， 从 而抑制肿瘤 的生长¨ Ｊ ． （ ２ ）诱导细胞凋亡． 姜 黄 素可 以抑制 抗凋 亡 因子 一 Ｂ淋 巴细胞 瘤 ． ２ （ Ｂ ｃ ｌ 一 ２ ） 基 因家 族 的表 达 ， 促进 Ｂ ｃ １ ． ２相 关 凋 亡 通 道 蛋 白 （ Ｂ ａ ｘ ） 的表 达 ¨ 引； 也可 以直 接增 强半 胱氨 酸 天冬 氨酸 酶 （ Ｃ ａ ｓ ｐ ａ ｓ ｅ ） 一 ３ ，一 ８和一 ９的活 性 ， 诱导 Ｃ ａ ｓ ｐ ａ ｓ ｅ依 赖的细胞凋亡 ； 还可以促进分子量为 ５ ３的抑癌蛋 白质 （ ｐ ５ ３ ） 的表达 ， 进而诱导 ｐ ５ ３ 介导 的细胞凋 亡［ １ ． 此外 ， 姜黄素对核因子 Ｎ Ｆ ． Ｋ Ｂ的抑制作用也被认为与凋亡有关¨ ． （ ３ ）抑制肿瘤细胞转移． 肿
瘤细胞 的转移机制比较复杂 ， 通常认为细胞间的黏附性降低及血管的生成对癌细胞的扩散和转移有重 要 作用 ． 姜 黄 素可 以调控 一些 上游 基 因 的水 平 ，增加 黏 附 因子 的 生成 （ 如 钙 黏 蛋 白和基 质 金 属 蛋 白质
姜黄素 抗衰研究报告
姜黄素抗衰研究报告姜黄素（Curcumin）是一种天然存在于姜黄中的活性化合物，在中医药中被广泛应用，并被认为具有许多生物活性和药理活性。
最近的研究表明，姜黄素具有抗衰老的潜力，并在许多与衰老有关的疾病的预防和治疗中显示出良好的效果。
首先，姜黄素被发现具有强大的抗氧化和抗炎作用。
自由基的过度积累和炎症反应是衰老过程中的重要因素，可以导致细胞损伤、组织退化和器官功能下降。
姜黄素通过中和自由基、减少氧化应激和抑制炎症反应，有助于维持细胞和组织的正常功能，从而延缓衰老进程。
其次，姜黄素被证明对衰老相关的心血管疾病具有保护作用。
心血管疾病是老年人常见的疾病之一，与血管内皮功能退化、动脉粥样硬化和心肌纤维化等因素有关。
相关研究发现，姜黄素可以改善血管内皮功能，抑制动脉粥样硬化斑块形成，减轻心肌纤维化，并降低心血管疾病的发生风险。
这些都表明姜黄素在预防和治疗心血管疾病中具有潜在的益处。
此外，姜黄素还显示出在预防和治疗衰老相关的神经系统疾病方面的潜力。
神经系统疾病如阿尔茨海默病和帕金森病等在老年人中较为常见，与神经元的退行性损伤以及炎症反应的累积有关。
许多研究显示，姜黄素可以改善神经细胞的存活和功能，抑制炎症反应，减少神经系统疾病的进展。
这表明姜黄素具有潜在的神经保护作用，可用于预防和治疗衰老相关的神经系统疾病。
总结来说，姜黄素作为一种天然草药化合物，具有抗衰老的潜力。
其强大的抗氧化和抗炎作用有助于维持细胞和组织的正常功能，延缓衰老过程。
此外，姜黄素还展现出在心血管疾病和神经系统疾病预防和治疗中的潜在益处。
然而，需要进一步的研究来揭示姜黄素的抗衰老机制，并开发更加有效的姜黄素衍生物作为抗衰老药物的候选。
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生物工程技术姜黄素对酿酒酵母抗衰老性能影响学院（系）：生命科学学院专业：生物工程学生姓名：张馨予徐瑶学号： 20161102137 20161102131 指导教师：崔京春老师完成日期：2016年12月22日大连民族大学摘要：姜黄素衍生物对酵母抗衰老性能影响。
在分别添加0.5g/L 4 种外源抗氧化物质的条件下培养酿酒酵母，测定不同培养时期酵母形态，絮凝速率及抗氧化酶活性。
结果表明，四种姜黄素衍生物能不同程度地改善因酵母衰老而表现出的细胞变瘪和表面褶皱，并有效降低酵母絮凝速率，提高酵母胞内抗氧化酶活性，以减少胞内 O2-.含量。
四种姜黄素衍生物均能降低活性氧氧化损伤，增强酵母抗衰老能力。
腺嘌呤姜黄素衍生物增强酵母抗衰老能力较强，而鸟嘌呤姜黄素衍生物相对较弱。
关键词：酿酒酵母；姜黄素衍生物；抗衰老；抗氧化酶一．背景1.1抗氧化剂抗氧化剂是指具有还原性，可抑制启动自由基链反应，阻止自由基反应传播并终止自由基反应的一类化合物，主要包括多酚、黄酮类化合物等。
它们在机体不同的微环境和代谢调节中起到抗氧化作用，并以此广泛参与、介导机体代谢，细胞分裂，基因表达等过程，在生命活动中起着十分重要的桥梁作用。
姜黄素是一种相对分子量较低的多酚类化合物，是含有多种功能基团的独特抗氧化剂，其酚基团是清除活性氧自由基所必须的，而甲氧基的存在进一步增加其抗氧化活性。
姜黄素是一个自由基清除剂和氢供体,具有亲氧化剂和抗氧化剂的双重活性，是未来最具潜力的抗癌药物之一，但因其水不溶性限制了它的研究与应用，刘巨涛等人对其进行了衍生化修饰，大大改善了其水溶性。
1.2酿酒酵母1.2.1酿酒酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种常用的工业微生物生产菌，在其发酵生产中细胞衰老、絮凝、沉降，失去活力。
Harman提出的自由基学说认为，需氧生物体内不断产生超氧阴离子自由基(Super oxygen anion，O2-.)、羟基自由基、脂氧自由基等活性氧自由基，同时体内的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)和过氧化物酶(peroxidase，POD)等抗氧化酶类不断地清除上述自由基，以免除机体活性氧损伤。
机体衰老时，清除自由基能力减弱，内源性自由基损伤生物分子，特别是 DNA、生物膜与蛋白质。
因此，抗氧化酶类活性及自由基水平对酵母生长及衰老有很大影响。
酵母作为研究真核生物的模式生物，其抗衰老研究可进一步为真核生物的抗癌、抗衰老研究提供一定的理论参考。
1.2.2酿酒酵母衰老模式及影响因素机体老化时，清除自由基能力下降，内源性自由基加重损伤生物分子。
因此，抗氧化酶类活性及自由基水平对酵母生长及老化有很大影响。
酵母中已确立的衰老模式有两种:复制型衰老和时序型衰老，分别用复制寿命和时序寿命衡量。
复制寿命定义为单个母细胞在其死亡前能进行有丝分裂的次数，可以用来模拟多细胞生物的细胞衰老，测定方法是用显微操作仪将酵母细胞所出的芽移走，计算母细胞在死亡之前的出芽次数; 时序寿命则表示一定数量不分裂的酵母细胞在其稳定期的存活时间，可以模拟有丝分裂后的细胞衰老，一般是通过单菌落数的统计来确定。
酿酒酵母复制衰老和时序衰老同样存在许多不同点。
比如两种衰老模型所用的培养基、细胞的表型、细胞的细胞骨架、细胞壁结构和代谢都不相同。
除此之外，两者的分子机制也有诸多差异。
物种最高寿期不同的决定因素，都认为基因是内在的决定因素，而有氧代谢所产生的氧自由基所造成的氧化应激是主要的外在因素。
因此，笔者在酿酒酵母发酵过程中分别添加四种姜黄素衍生物：腺嘌呤、鸟嘌呤、二氯腺嘌呤、2，6-二氨基腺嘌呤姜黄素衍生物。
发现它们可不同程度地提高酵母抗氧化能力，进而增强酵母抗衰老性能。
随着培养时间增加，醇母沉降逐渐加快。
酵母絮凝速度加快的因素可能是由于酵母在衰老过程中由于细胞壁權皱程度增加，导致了细胞间表面粘附力增强，从而促进了细胞的聚集引起絮凝速率加快，也有可能是由于菌体在衰老过程中胞内活性氧积累，脂质过氧化加剧，导致细胞或组织损伤，从而导致细胞絮凝速率加快。
所以酿酒酵母的衰老可以用絮凝速率来表达，即600nm处的吸光值。
二．实验材料与方法2.1实验材料2.1.1菌种酿酒酵母，大连民族大学微生物实验室提供。
2.1.2实验试剂试剂：Tris、牛血清白蛋白、腺嘌呤、鸟嘌呤、二氯腺嘌呤、2，6-二氨基腺嘌呤；以上试剂均为分析纯。
培养基：强化 YPD 培养基：6 %葡糖糖、2 %蛋白胨、1 %酵母浸粉；四种姜黄素衍生物分别经 0.22 μm 无菌滤膜除菌后添加到 YPD 发酵培养基中。
仪器与设备：高速冷冻离心机、冷冻干燥机紫外可见分光光度计、手持糖度计、立式高压蒸汽灭菌锅、全温落地式摇床。
2.2实验方法2.2.1培养基固体培养基：YPD固体培养基，高温灭菌20min；液体培养基：6%葡糖糖、2%蛋白胳、1%酵母浸粉，121℃灭菌20min2.2.2酵母细胞培养实验以斜面保藏的酵母经液体培养活化后，在对数生长期时按照5.0X104cfu ／mL的接种浓度分别接入到两种发酵培养基中，培养条件为28.5℃、160r／min。
定时取样检测OD值及残糖，当发酵残糖低于5.0k／L时，终止发酵。
2.2.3残糖含量测定利用手持糖度计，在每日固定时间测定发酵液的糖浓度并做好记录。
2.2.4醇母絮凝能力的测定取经无菌水洗涤2次的酵母菌体，用生理盐水稀释至1.0-3.0X104／mL，摇匀，分装，每管20mL，室温静置，每隔30min从管中取样3ml，检测其600nm 处吸光值。
悬浮细胞浓度以600nm处吸光度表示。
2.2.5抗氧化酶活性及 O2-含量的测定SOD 酶活性的测定：邻苯三酚自氧化法。
CAT 酶活性的测定：钼酸铵比色法。
POD 酶活性的测定：愈创木酚法。
O2-.含量的测定：羟胺氧化法。
三．实验结果与讨论3.1酿酒酵母的降糖能力及外加抗氧化物质浓度的确定已知酿酒酵母经12h进入对数期，24h进入稳定期，216h后到达发酵终点。
故本实验选取24h、72h、120h、168h、216h酵母为研究对象进行后续试验。
前期研究表明，在酿酒酵母培养过程中添加姜黄素衍生物，随姜黄素衍生物浓度升高，降糖速率有所加快，且浓度为0.5g/L时促进作用接近极限，故本研究选取添加腺嘌呤、鸟嘌呤、二氯腺嘌呤、2，6-二氨基腺嘌呤姜黄素衍生物浓度为0.5g/L。
为比较四种抗氧化物质对酵母的影响，确定腺嘌呤、鸟嘌呤、二氯腺嘌呤、2，6-二氨基腺嘌呤添加浓度同为 0.5 g/L。
在酿酒酵母培养过程中，分别添加 0.5 g/L 的腺嘌呤、鸟嘌呤、二氯腺嘌呤、2-6二氨基腺嘌呤，可见，此4种抗氧化物质对酿酒酵母的生长代谢具有一定的促进作用，且促进作用的大小依次为腺嘌呤＞鸟嘌呤＞二氯腺嘌呤＞2,6-二氨基腺嘌呤。
图1.酿酒酵母发酵过程中糖浓度和600nm处OD值变化曲线2.2酿酒酵母的细胞形态及絮凝能力酵母细胞培养过程中，在其培养初期细胞代谢稳定，分裂有序进行，培养24 h后其形态稳定，表面光滑无褶皱，而培养 216 h 后的细胞经多次分裂产生芽痕，表面粗糙且如被絮状物质包裹，细胞变大，影响细胞与外界环境进行物质交换，增强细胞表面的粘附力，使细胞絮凝、沉降，衰老。
而外加抗氧化物质培养酵母216h 后，细胞虽变瘪、表面出现明显褶皱，但细胞形态相对保持较为完好。
同时，由图2酵母絮凝曲线可知，外源抗氧化物质对酿酒酵母培养初期细胞的絮凝性影响较小，但随着培养时间的延长，姜黄素衍生物组的酵母细胞的絮凝速率比对照组降低了10%-20%。
故添加外源抗氧化物质对酵母细胞形态的维持有一定的积极作用，进而延缓酵母细胞的絮凝，从而改善酵母发酵能力，并且四种种抗氧化物质影响作用大小顺序为腺嘌呤＞鸟嘌呤＞二氯腺嘌呤＞2,6-二氨基腺嘌呤。
图2.外源抗氧化物质对不同培养时间酿酒酵母絮凝能力的影响四．实验总结在酿酒酵母培养过程中分别添加四种姜黄素衍生物，都能不同程度的提高酵母抗氧化活性，从而降低活性氧对细胞的氧化损伤，有效延缓细胞衰老。
结合絮凝曲线，四种物质对酵母细胞抗衰老作用影响大小顺序为腺嘌呤＞鸟嘌呤＞二氯腺嘌呤＞2,6-二氨基腺嘌呤本实验研究了不同培养时间糖代谢速率，絮凝速率，细胞形态变化。
以上研究表明，随着随培养时间増加，酵母糖代谢速率减慢，絮凝速率加快，细胞变大。
姜黄素衍生物的确能影响抗氧化酶类活性从而对酵母生长及老化有很大影响。
具有抗炎、抗肿瘤、抗衰老活性的姜黄素作为未来最具潜力的抗癌药物之一，经衍生化修饰，在改善了其水溶性后仍具有较好的生物学活性，为拓展其应用研究奠定了基础。
附录实验记录第一天12月24号一.清洗11个摇瓶，烘干后放入高压蒸汽锅灭菌1.5h。
二.配置强化 YPD 培养基（6 %葡糖糖、2 %蛋白胨、1 %酵母浸粉）；强化YPD培养基配制方法：1．溶解25g Yeast Extract（酵母膏）,50g Peptone（蛋白胨）于1800ml 水中。
并高压 121度 20min。
2.在灭菌后培养基中，加入150ml 经膜过滤的150g葡萄糖，并用无菌水定容至2500ml。
（注：葡萄糖，yeast extract ,peptone溶液混合后在高温下可能会发生化学反应，导致培养基成分变化，所以要分别灭菌后再混合。
葡萄糖可以过滤除菌。
）三. 在无菌操作台进行如下操作。
挑取单菌落接至两管含有强化YPD培养基试管，进行菌种活化。
培养条件：将含有20ml强化YPD培养基的试管放入摇床，将转速为160r/min,温度为28.5度。
培养时间:12月24号晚上9:40到12月25号12:40约15个小时左右。
四．在无菌操作台将培养基注入11个摇瓶，每瓶200ml培养基后封存。
第二天12月25号一.清洗摇瓶，烘干后放入高压蒸汽锅灭菌1.5h。
二．在无菌操作台中，将活化后菌种接入两瓶含有强化YPD培养基的三角瓶中扩培。
培养条件：将含有20ml强化YPD培养基的试管放入摇床，将转速为160r/min,温度为28.5度。
培养时间：12月25号1:00到12月26号12:00约23小时左右。
第三天12月26日一．在11瓶灭菌后的摇瓶中每瓶注入1ml菌液。
二．把10个姜黄素衍生物样品溶于1ml酒精后注入10个培养基中，剩余一瓶培养基作为对照组加入1ml酒精。
三．把11瓶菌液放入38.5度160r/min摇床中培养。
培养时间：12月26日1：30到12月27日1:30第四天-第十四天12月27日-1月5日一．测量OD值1. 一般测菌体密度的OD的波长范围是580nm-660nm，波长在紫外范围内才够测量2.如用水做空白，需要离心洗涤菌体；如用不接种的培养基做空白就不需要洗涤,不接种的培养基要和接种的同时培养,以求条件一致3.OD值最好控制在0.1-0.4内，在这个区间得到的值很可靠，最好不要超过1.0；如果大于2.0，要稀释后再测，OD太大时，分光光度计的灵敏度会显著降低4.测吸光值的整个实验过程中，要保持发酵液或菌体的稀释倍数一致，可保证整个实验点有可比性（吸光值与稀释倍数不一定成正比）；取值的时候要连续读数，重复3次的数最好。