时间分辨荧光免疫分析
时间分辨荧光免疫 镧系元素
时间分辨荧光免疫镧系元素
时间分辨荧光免疫分析是一种用于检测和测量样品中存在的特定物质的方法。
在这种分析中，使用镧系元素作为荧光标记物，其具有独特的荧光特性，能够在特定激发光的作用下发出特定的荧光信号。
以下是关于时间分辨荧光免疫和镧系元素的一些方面：
1. 方法原理，时间分辨荧光免疫分析是基于样品中目标物质与特定抗体结合形成复合物，然后加入标记有镧系元素的二抗，通过激发光激发镧系元素，测量其发出的荧光信号来定量分析目标物质的含量。
2. 镧系元素的选择，镧系元素由于其稀土特性，具有多种发射波长和长寿命的荧光特性，能够减少背景干扰，提高检测灵敏度和准确性，因此被广泛应用于时间分辨荧光免疫分析中。
3. 应用领域，时间分辨荧光免疫分析结合镧系元素标记物已被广泛应用于生物医学、环境监测、药物研发等领域，用于检测蛋白质、激素、细胞因子等生物分子的含量和活性。
4. 技术优势，与传统的荧光免疫分析方法相比，时间分辨荧光
免疫分析结合镧系元素标记物具有更高的检测灵敏度、更低的背景干扰和更广泛的应用范围，因此受到了广泛关注和应用。
总的来说，时间分辨荧光免疫分析结合镧系元素标记物是一种高效、灵敏度高的分析方法，在生命科学和医学领域有着广泛的应用前景。
希望以上信息能够帮助你更全面地了解这一技术。
时间分辨荧光免疫层析 技术原理
时间分辨荧光免疫层析技术原理
时间分辨荧光免疫层析技术（TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，利用
镧系元素标记抗原或抗体，通过时间分辨技术测量荧光。
具体来说，当含有待测抗原（抗体）的样品滴在加样区时，待测样品中的抗原（抗体）与结合垫中的荧光纳米微球标记的抗体（抗原）结合并通过毛细作用向前层析。
当达到检测区后，与检测线上固定的抗体（抗原）结合，形成微粒-抗体-抗原-抗体夹心复合物并被固定在检测线上，而多余的荧光微
球标记物继续向前层析，与固定在质控线上的二抗结合。
反应结束后，用紫外光源（340nm）对检测区扫描检测，检测线和质控线
上荧光纳米微球发出高强度的荧光（615nm），且衰变时间也较长。
通过
测量延缓时间，待样品基质中自然发生的短寿命荧光（1-10ns）全部衰变后，再测量稀土元素的特异性荧光，这样就可以排除非特异本底荧光的干扰。
通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值，即可分析出样品中待测物的浓度。
这种技术具有高灵敏度、高特异性和可定量分析等特点。
以上内容仅供参考，如需更多信息，建议查阅时间分辨荧光免疫层析相关文献或咨询该领域专家。
时间分辨荧光免疫分析仪特点及性能
时间分辨荧光免疫分析仪特点及性能时间分辨荧光免疫分析仪采用现代光学、机械、计算机等先进技术，通过标记离子螯合物产生的特异性荧光寿命长、强度高，消除本底干扰荧光；利用激发光波谱宽、荧光发射波谱窄，增强荧光强度，提高分辨率的原理，对临床免疫血样进行定量分析，为临床血样提供灵敏、准确、可靠的数据。
概述时间分辨荧光免疫法所用的标记物是镧系元素螯合物，利用这类荧光物质荧光寿命长等特点，通过波长和时间两种分辨技术，有效排除了非特异本底荧光的干扰。
特点1、灵敏度高；2、标记物制备简单；3、稳定性好；4、标准曲线线性范围宽；5、操作方便。
技术性能电源：210～240V，50～60Hz；外型尺寸：550mm×600mm×270mm；重量：25 kg；灵敏度：10-13 mol/L；线性度：10-12～10-8 mol/L；快速测试：1秒/样；高稳定性：< ±1 %；工作制：连续运行；安全分类：I类；防电击程度：B型；熔断器：Φ5×20 5A。
应用领域主要用于对人的血液和其它体液中的各种免疫检测项目进行定量分析，它可以适用与传染病检查、内分泌科检查、细胞学检查、肿瘤科检查等。
随着检验医学的发展，对微量、超微量的测定会越来越多，同时RIA的污染问题会越来越被重视，因此，时间分辨荧光分析法具有越来越大的应用空间。
产品特性产品参数产品特点：1) 采用进口光源、光学镜片及光电倍增管，保证检测结果的稳定性及可靠性；2) 测试速度快，1秒／样本；3) 标本灵活，适合任意份标本量；4) 全中文软件，操作界面简便；5) 是国内首家研发出成功，填补国内空白，并获得国家科技进步二等奖。
技术参数：1) 测定原理：时间分辨2) 激发光源：进口氙灯3) 灵敏度: 10 -17 mol／孔（Eu 3+）4) 线性范围：10 -13 mol／孔～10 -17 mol／孔5) 高稳定性：＜5 %6) 电源：AC 198～242V 50～60Hz7) 外型尺寸：710mm×520mm×320mm8) 重量：30kg9) 工作制：连续运行10) 安全分类：I类11) 防电击程度：B型12) 熔断器：型号T 电流额定值3A电路分析时间分辨荧光免疫分析仪，它包括光源、测样进给、检测及接口电路等几部分，其中接口电路又由译码及逻辑电路、锁存器、计数器及时基电路等构成。
时间分辨荧光技术
时间分辨荧光技术时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。
（一）TRFIA分析原理在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。
大部分背景荧光信号是短时存在的，因此将长衰减寿命的标记物与时间分辨荧光技术相结合，就可以使瞬时荧光干扰减到最小化。
时间分辨荧光分析法（TRFIA）实际上是在荧光分析（FIA）的基础上发展起来的，它是一种特殊的荧光分析。
荧光分析利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外-可见分光分析法中杂色光的影响，同时，荧光分析与普通分光不同，光电接受器与激发光不在同一直线上，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度地提高了光学分析的灵敏度。
但是，当进行超微量分析的时候，激发光的杂散光的影响就显得严重了。
因此，解决激发光的杂散光的影响成了提高灵敏度的瓶颈。
解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在。
但普通的荧光标志物荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。
不过有非常少的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）的荧光寿命较长，可达1～2ms，能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法医学教|育网搜集整理。
平时常用的稀土金属主要是Eu（铕）和Tb（铽），Eu荧光寿命1ms，在水中不稳定，但加入增强剂后可以克服；Tb荧光寿命1.6ms，水中稳定，但其荧光波长短、散射严重、能量大易使组分分解，因此从测量方法学上看Tb很好，但不适合用于生物分析，故Eu最为常用。
（二）时间分辨信号原理普通物质荧光光谱分为激发光谱和发射光谱，在选择荧光物质作为标记物时，必须考虑激发光谱和发射光谱之间的波长差，即Stakes位移的大小。
时间分辨荧光免疫技术
定量
ELISA（定性）
意义
0~10mIU/ml 10~100mIU/ml
>100mIU/ml
阴性（-） 阳性（+）` 阳性（+）
机体对乙肝病毒无免疫力，易感染 乙肝病毒
机体对乙肝病毒的免疫力很弱，甚 至不能预防HBV感染，仍有感染 HBV的危险
机体对乙肝病毒有较强的免疫力， 使机体有抵抗HBV入侵的作用，较 大程度上减少感染HBV的风险
而且半寿期也长，介于10-1000us之间，比普通荧光标记物高5-6 个数量级（1000ns=1us)。 含有铕或钐的螯合物的荧光衰变时间分别为730000ns和50000 ns。 因此利用延缓测量时间，待测样品中短寿命的自然荧光完全衰变 后，再检测稀土离子螯合物的荧光信号（见图1）。消除了来自样 品、试剂及其他非特异荧光，从而达到降低自然本底荧光和消除 样品荧光的干扰，大大提高了检测灵敏读。这既是我们长提到的 时间分辨。
放射性（125I），对环境的污染及对 身体的危害，已经为重视环保的国家
命性的贡献，是一项 逐步取消。（如整个欧洲仅尚存几个
较为成熟的诊断技术。 放免试验室）
125I的半衰期短而导致其试剂有效期
夹心法、竞争法的标 记原理为以后的检测
短。 标记物125I的稳定性差，导致试剂盒
技术的发展奠定了基 础。
WALLAC和新波公司使用疝灯，主要用于临床
标记物为具有独特荧光特性的稀土金属---镧系元素
镧系元素共有15种，属三价元素，应用在时间分辨荧光免疫技术中 有四种：
铕(Eu)、钐Sm)、镝(Dy)、铽(Te)
Eu3 +的应用最为广泛， Sm3+ 可作为第二种选择以进行双标记或多标记技术
时间分辨荧光免疫测定原理
时间分辨荧光免疫测定原理时间分辨荧光免疫测定（TRFIA，Time Resolved Fluorescence Immunoassay）是一种非同位素免疫分析技术。
它利用镧系元素（如铕、铽等）标记抗原或抗体，通过测量荧光强度和时间两个参数来检测待测物。
与传统的荧光免疫分析相比，TRFIA具有更高的灵敏度和特异性，能有效排除非特异性荧光的干扰。
TRFIA的分析原理主要包括以下几个方面：1.镧系元素标记：将镧系元素与抗原或抗体结合，形成具有荧光性质的标记物。
镧系元素的荧光具有较长的寿命，且发光强度与抗原或抗体的结合程度密切相关。
2.时间分辨技术：通过时间分辨技术对荧光信号进行测量，即在一定时间内对荧光信号进行积分和分析。
这种技术能够有效地区分特异性荧光信号和背景荧光信号，提高分析灵敏度。
3.信号分辨：通过检测波长和时间两个参数来分辨特异性荧光信号和非特异性荧光信号。
由于生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度会严重下降。
而TRFIA方法通过时间分辨技术使瞬时荧光干扰减到最小化。
4.激发光控制：TRFIA方法在测量时采用延迟测量时间的方法，有效地消除背景荧光的干扰。
同时，解决激发光的杂散光影响也是提高灵敏度的关键。
5.数据分析：通过对测量得到的荧光信号进行数据分析，得到待测物的浓度。
TRFIA方法能够实现对超微量样品的高灵敏度检测，具有很高的分析精度。
总之，时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是一种基于镧系元素标记、时间分辨技术、信号分辨、激发光控制和数据分析等原理的一种高灵敏度、高特异性的免疫分析方法。
在生物医学、环境监测、食品安全等领域具有广泛的应用前景。
时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程
时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程一、产前筛查定义及其原理产前筛查（Prenatal Screening)是指通过经济、简便和较少创伤的检测方法，从孕妇群体中发现怀有某些先天缺陷胎儿的高危孕妇，以便进而进行诊断，以最大限度地减少异常儿的出生。
血清学标志物产前筛查已成为非侵入性产前诊断的重要方法。
目前产前筛查的两种主要疾病是唐氏综合征（Down’s Sydrome，DS；又称21三体综合征）和胎儿神经管缺陷（Neural Tube Defects，NTDs），也包括一部分18三体综合征。
产前筛查可以在妊娠早期（7～13周）或中期（14～21周）进行。
目前用于产前筛查的血清学标志物有：甲胎蛋白（AFP）、游离β-）、妊娠相关血浆蛋白（PAPP-A）、绒毛膜促性腺激素（F-β-hCG）、游离雌三醇（uE3抑制素A（inhibin A）等。
产前筛查实验测量通用评价指标为中位值倍数（MOM），正常妊娠特定的MOM=标本检测浓度/相应孕周中位值浓度。
产前筛查系统由体外诊断试剂、检测仪器和筛查分析软件组成。
检测仪器配合体外诊断试剂检测出孕妇血清中标记物（AFP、F-β-hCG、PAPP-A等）的浓度，将检测数据及孕妇相关因素输入筛查分析软件中，即可得出唐氏综合征（DS）和神经管缺陷（NTD）筛查的结果。
由于目前的技术水平的限制，产前筛查技术都不能做到筛查100%正确。
假阴性病例因此会误诊，假阳性病例一般在产前诊断实验时被纠正。
二、唐氏综合征的产前筛查唐氏综合征是人类最常见的一种染色体病，发病率约1/800～1/600，男性多于女性。
1866年英国医生Langdom Down 首次对此病进行临床描述，因此命名称为Down，s Syndrome，简称DS。
1959年Lejeune首先发现本病的病因是多了一条21号染色体，故又将其命名为21三体综合征。
唐氏综合征的主要临床表现：严重智力低下、愚型面容，约50%伴有先天性心脏病、小头畸形等发育异常。
时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay)操作
时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay)是在荧光分析的基础上发展起来的一种特殊的荧光分析。
它利用具有长效荧光的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）作标记物，充分利用激发光与发射光之间的降移与发射光较长的半寿期，在激发光后延时测量发射光的强度。
从而所测的荧光不受激发光和被检物中的非特异荧光干扰，提高了检测的特异性与灵敏度。
在激发光后延时400微秒，测量400微秒，间歇200微秒后进入下一个测量周期，每一个周期为1000微秒。
对每一个样品实施1秒钟的测量，意味着完成了1000个周期的测量，测量精确度极高。
（一）Auto DELFIA自动时间分辨荧光免疫分析仪开/关程序1 开机1.1 依次打开样品处理器电源，微孔板处理器电源，打印机电源。
1.2 打开计算机显示器。
1.3 启动计算机。
1.4 运行系统软件：Auto DELFIA与Multicalc系统软件在Windows启动后自动运行。
Auto DELFIA workstation软件用于控制Auto DELFIA的运行，MultiCalc的主要功能是与主机通讯，对测试结果进行评估和对质控及其他数据处理（可通过双击屏幕上图标不运行）。
在MultiCalc Auto DELFIA环境下，只有键盘有效，鼠标无效。
2 开机后准备1.1 清洗液准备1.1.1 微孔板处理器洗液（250ml浓缩液＋600ml去离子水混合），每做一块板至少1升用量，洗液在密闭条件可保存2周时间。
1.1.2 准备样品处理器洗液（50ml浓缩液＋5000ml去离子水混合），每做一块板至少需要800ml洗液，洗液在密闭条件下可保存1周时间。
1.2 样品处理器准备1.2.1 在Wash bottle（清洗液瓶）、Rinse bottle (冲洗液瓶)分别注入足够用量的清洗液和去离子水，倒空废液瓶。
拧紧各瓶盖，确保废液瓶管路向下。
1.2.2 如样品需要稀释，放入稀释杯和稀释液。
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镧系元素发射峰窄
优点
? 灵敏度高（10-18mol/孔） ? 原子标记 ? 多标记技术
二、时间分辨荧光免疫分析体系
? 非均相时间分辨荧光免疫分析 ? 均相时间分辨荧光免疫分析
（一）非均相时间分辨荧光免疫分析
? 时间分辨固相免疫分析 ? 解离增强荧光免疫分析 ? 酶放大免疫分析
? ALP
酶放大免疫分析示意图
双标记测定 AFP和β-hCG
β-NTA作为螯合剂 340 nm 激发，Eu:615 nm, 820 μs；Sm:643 nm, 88 μs
（二）均相免疫分析
? 基于时间分辨荧光共振能量转移 ? 无需洗涤、分离、加增强液
? TBP-Eu：Eu3+-二吡啶二胺，最大发射 615nm，供体
104 -106 ns
2. Stokes位移大
荧光物质 Eu-(β-NTA)3 Sm-(β-NTA)3
Tb-(PTA) 3 Dy-(PTA) 3
激发波长 340 nm 340 nm 295 nm 295 nm
发射波长 613 nm 600 nm 490/543 nm 573 nm
Stokes 位移 273 nm 260 nm
1.荧光衰减时间长
镧系元素荧光衰变时间
常见荧光物质荧光寿命
荧光物质 Eu3+
非特异性荧光背景 人血清白蛋白
人球蛋白、血红蛋白 细胞色素C FITC 丹磺酰氯 苯胺萘磺酸 稀土螯合物
荧光寿命 714 μs 1-10 ns 4.1 ns 3.0 ns 3.5 ns 4.5 ns 14 ns 16 ns
2. 传染病检测
? 梅毒螺旋体抗体检测：双抗原夹心法
? 强阳性血清和正常人血清分别作为阴阳对照 ? 阴性对照、阳性对照和样品加入板上，孵育 ? 加入铕标记抗原，孵育 ? 加入增强液，检测荧光
? 符合中国药品生物制品鉴定所结果
3.糖尿病检测
? C-肽检测：双抗体夹心法 ? 抗体包被微孔板 ? 加入标准品或样品 ? 加入铕标记抗体 ? 增强液，检测荧光 ? 灵敏度：0.08ng/ml
育，离心，测上清荧光 ? 计算比释放率（%）
实验释放量 ? 自然释放量 ×100% 最大释放量 ? 自然释放量
4.激素检测
? 三碘甲状腺原氨酸（T3）：竞争法 ? 微孔板中加入抗体 ? 标准品或样品、铕标记T3 ? 加入增强液，测定荧光 ? 灵敏度：0.21ng/ml
5.细胞活性检测
T：靶细胞 E：效应细胞
测定细胞活性原理图
NK细胞活性
? 靶细胞：K562细胞 ? 加入EuCl3, DTPA, 硫酸葡聚糖，4oC孵育 ? 向靶细胞中加入效应细胞（NK细胞），孵
1.时间分辨固相免疫分析
灵敏度一般不高
? 实例 ? 加拿大Cyber Fluor 的FIAgen 系统 ? Eu 3+-BCPDA 为标记物
2.解离增强分析
原理示意图
（1）双功能螯合剂
? EDTA 衍生物、 DTTA 衍生物、 DTPA 衍生物 ? 一端与镧系离子螯合，一端与抗原 /抗体连接 ? 近中性时，螯合物足够稳定 ? 酸性条件下，镧系离子迅速、彻底释放 ? Eu-DTTA 应用最广泛
5-2 时间分辨荧光免疫分析
郑鹄志 西南大学 化学化工学院
发展历程
? 1979年，可标记抗体的Eu3+-β-二酮体-EDTA
? 1983年，建立时间分辨荧光免疫技术，用于测 定HCG和磷酸酯酶A
? “镧系元素时间分辨荧光分析技术及仪器的配 套研究”获2003年度国家科技进步二等奖
一、时间分辨荧光免疫分析特点
4. 捕获法
捕获法测定抗 -CMV IgM
5. 生物素-亲和素法
生物素-亲和素检测 PAPP-A
四、应用
? 1. 肿瘤标志物检测 ? 2. 传染病检测 ? 3. 糖尿病检测 ? 4. 激素检测 ? 5. 细胞活性检测
1.肿瘤标志物
? AFP测定：双抗体夹心法 ? 固相包被抗体 ? 加入样品或标准品 ? 加入Eu标记抗体 ? 加入增强液 ? 测定荧光 ? 灵敏度：0.17 U/ml
? APC ：别藻蓝蛋白，最大发射665nm ，受 体
? 能量转移效率最高的供体/受体对
时间分辨荧光共振能量转移免疫分析示意图
三、时间分辨免疫分析方法
? 夹心法 ? 竞争法 ? 间接法 ? 捕获法 ? 生物素-亲和素放大法
1. 夹心法
双抗体夹心法
双抗原夹心法
2. 竞争法
3. 间接法
间接法测定 HCV 抗体
（2）增强液
增强原理图
一般增强百万倍
? β-NTA：Eu(β-NTA)3(TOPO) 2复合物 ? TOPO ：荧光增强协同剂 ? Triton X-100 ：表面活性剂，形成胶束 ? 醋酸：酸性介质
（3）酶放大
? 酶催化底物，生成的产物与溶液中镧系离 子、螯合剂生成荧光强、寿命长的三元复 合物