CLSI系列文件---定量检测系统线性评价方法(EP6-A)

定量检测系统线性评价方法— EP6-A法线性范围是分析方法的重要技术指标之一，线性范围越宽，说明该分析方法的性能越好，越适用于临床。

目前评价分析方法线性范围的方法很多，如：目测法、EP6-P法、美国临床病理学家协会设备委员会（CAP-IRC）法、EP6-A法等。

本文主要介绍了目前评价分析方法线性范围最好的方法即EP6-A法。

1. 仪器熟悉阶段在线性评价实验之前，仪器应当在实验室安装并使用相当长的一段时间，以便实验者熟练掌握仪器的操作，并保证仪器经过正确的定标、实验样本经过适当的准备。

如果仪器生产商为实验者提供了培训，这也可以作为本阶段的一个部分。

2. 线性评价实验2.1 实验样本的数目线性评价实验的样本数目依据实验目的而确定：①如果实验目的是验证某方法的线性范围，需要5～7个不同浓度水平的样本，这些样本的浓度必须覆盖厂家申明的线性范围，并且每个样本重复测量2次。

②如果实验目的是建立新方法的线性范围，需要7～11个不同浓度水平的样本，这些样本的浓度必须覆盖预期的线性范围。

一般情况下，新方法线性范围的建立者希望有更多浓度水平的实验样本，并且这些实验样本的浓度应该比预期的线性范围宽20%～30%，这样能确定最合适的线性范围。

此外，再根据检测系统不精密度的大小，每个样本重复测量2～4次。

③多元回归分析法评价线性范围时至少需要5个不同浓度水平的实验样本，并且实验样本越多，就越能准确地评价线性范围。

2.2 实验样本的配制EP6-A文件推荐使用高值和低值浓度的样本按特定的比例精确配制成一系列不同浓度的样本，并且这些样本的浓度可以为等间距排列，也可以为不等间距排列，具体配制方法可以参考文件后的附录A。

在配制过程中，实验者应优先选用移液管法配制实验样本，因为用移液管精确吸量高值、低值浓度样本配制实验样本所产生的误差比称量法、配制复溶溶液法要小。

此外，实验者在吸取小体积溶液时要特别小心。

2.3 实验样本的编号在线性评价实验前，实验样本中分析物浓度可以为未知条件，只是此时必须对每个实验样本进行编号来反映实验样本中分析物浓度的关系。

如果实验样本中分析物浓度是按等间距排列，且最高浓度是最低浓度的n倍时，则可以把最低浓度的实验样本编为1号，其余实验样本的编号按分析物浓度由低到高依次为2、3、4……n。

如果实验样本中分析物浓度不是按等间距排列，实验者必须知道相邻实验样本中分析物浓度之间的关系，此时的样本编号可以不为整数。

2.4 基质效应在实验过程中，实验者还应考虑基质效应对实验结果的影响，因此线性评价的实验样本应该与临床实验室所用的测试标本相似，并且还应不含有对测试方法有干扰的因素如溶血、黄疸、脂血等。

如果无法达到上述条件，则应在实验报告中注明实验样本所采用的处理方法或基质类型。

以下为线性评价实验可能用到的样本类型，注意在评价一些特殊方法的线性范围时要选用合适的基质。

①患者样本混合液：患者样本混合液是理想的实验样本类型，用接近预期线性范围上限、下限的高值、低值浓度样本配制所有实验样本。

②用推荐稀释液稀释的患者样本：用于稀释高值患者样本的稀释液可能对测试结果产生影响，因此必须使用试剂生产商推荐的或者经过实验室证实为可接受的稀释液稀释患者样本。

③在患者样本混合液中添加分析物：如果患者样本中不存在干扰物质，添加的分析物不需要很高的纯度，反之则应在实验报告中标明添加分析物的来源、纯度、预期影响等。

如果添加的分析物为浓溶液，则浓溶液的加入量应尽可能的少（小于总体积的10%），并且记录所使用的溶剂。

④用处理过的低浓度物质或混合物质稀释的患者样本：如果可能，可以使用低浓度的患者样本作为稀释液。

另外，患者样本经过适当处理（如透析、热处理、层析）后可以降低其分析物浓度，但是需要注意这些处理可以改变分析物的基质。

⑤商品化质控物/定标物/线性评价实验物：如果使用这些物质作为实验样本，则应将它们与患者样本同样地进行分析。

如果没有合适浓度的质控物/定标物/线性评价实验物，则可以将高值、低值质控物/定标物/线性评价实验物混合得到中间浓度的实验样本。

但需要注意的是，此时应保证分析物与正常生理状态下的形式一样。

⑥用其他不是推荐稀释液稀释的患者样本：使用这些物质作为实验样本时，应注意基质差异对检测结果的影响，加入的稀释液也应尽可能少。

⑦稀释不足/过度稀释的商品化质控物：同样也应注意基质差异对检测结果的影响，并且影响的程度还随着稀释倍数不同而改变，同时要保证质控物完全溶解。

⑧水溶液：当使用水溶液作为实验样本时，基质效应可能会影响分析物与试剂的反应。

⑨其他溶剂：当使用其他有机溶剂作为稀释剂时，基质效应可能更大。

2.5 样本添加物的选择当实验过程中需要在低浓度患者样本混合液中添加分析物时，需要选择合适的添加物，因为使用其他某些添加物可能会对实验结果产生一定的影响。

EP6-A文件的表1列出了一些物质作为分析对象时的建议添加物质，如以谷氨酸氨基转移酶作为分析物时的建议添加物质为纯化酶，实验者在实验过程中可以参考该表。

此外，在使用某些推荐的添加物时需要考虑其溶解度，如纯胆固醇在血清或水基质中都不易溶解。

2.6 分析顺序及数据收集将实验样本按随机的顺序进行测定。

如果实验结果存在明显的携带污染或漂移，则应采取相应的改进措施。

此外，在实验过程中，必须保证仪器的室内质量控制在控。

全部实验数据尽可能在较短的时间内收集，如可能，单个分析试验最好在一天内做完。

3.实验数据的处理3.1初步数据检查实验数据必须经过可接受性和有用性评估，详细的评估步骤有如下几点：①检查数据是否存在明显大的差异，如果差异产生的原因可以确定为分析或技术上的问题，将发现的问题纠正后重新测定全部实验样本。

②如果没有发现极其明显的分析或技术性结果差异，则应目视检查每个实验样本重复测定的结果是否存在离群点。

首先以样本浓度或其相对浓度为x 轴、测定浓度为y轴绘制散点图，其次再将每个样本重复测定结果的均值画在图上，用手工或计算机方法将这些均值点连接起来，观察各测定值与均值连线的大致偏差，如果某测定值明显偏离组内其他数据的表现，可以判断其为离群点。

③当某个样本的某测定值明显偏离其他测定值时，目视判断它是一个离群点。

④在线性分析前必须将离群点从数据组中删除。

如果发现两个或两个以上不可解释的离群点时，就应怀疑系统的性能，查找问题产生的原因，必要时请求厂家协助。

⑤目视检查xy散点图对于后续的线性评价是相当重要的，它可以很容易地发现非线性或实验样本的浓度范围是否太窄或太宽，同时还可以为后续的统计分析选择最合适的统计方法提供依据。

⑥如果需要，将每个样本的各测定值按检测时间顺序排列，检查各测定值是否存在漂移或趋势性变化。

如果发现明显的偏差，在纠正偏差产生的原因后重新测定整批实验样本，要避免在纠正原因之前选择多次重复测定结果中的“好”数据进行线性分析。

⑦观察相邻样本重复测定结果均值之间的差值。

在线性模型中，各段的斜率大致相等，如果存在斜率增加或降低的趋势则提示非线性。

3.2 离群点检查在本指南中，“离群点”是指某个结果在目视和/或统计学上明显偏离其他测定结果，它仅适用于评价某个重复测定的结果，而不适用于评价某样本多个重复测定的结果或测定结果的均值，出现离群点提示非线性或其他系统误差。

根据离群点的定义可知，判断某个结果是否为离群点的方法有两种：一种是统计学方法，另外一种是通过目视判断。

尽管目前有多种统计学方法用于离群点的判断，但是在大多数情况下，通过目视检查测定值与预期值的散点图即可以发现离群点。

如果数据组中出现一个离群点时可以删除而不需要替换，但是有两个或两个以上的离群点时，则应考虑检测系统的精密度是否达到实验要求，此时必须查找原因并纠正。

4. 线性范围的确定4.3.1 对数据进行多项式回归分析在收集完所有数据后，实验者对数据进行多项式回归分析（可以用统计软件完成，如SPSS的Curve Estimation子菜单），具体步骤如下：①实验者对数据进行一次、二次和三次多项式回归分析，回归方程分别为y=b0+b1x、y=b0+b1x+b2x2、y=b0+b1x+b2x2+b3x3，式中b i为回归系数。

一次回归多项式为线性模型，二次、三次回归多项式为非线性模型。

在二次回归多项式中，b2为非线性系数；在三次回归多项式中，b2和b3为非线性系数。

②实验者对每个非线性系数的斜率求标准误SE i，然后进行t检验，判断非线性系数与0是否有显著性差异。

回归多项式中的b0和b1不需要分析，因为它们不反应非线性。

b2和b3的检验统计量计算公式如下：t=b i /SE i，如果b i为负数，则取t的绝对值。

自由度的计算公式为df=L.R-Rdf，式中L为线性实验的样本个数；R为每个样本重复测定的次数；Rdf为回归分析占用的自由度，一次、二次、三次多项式回归分析的Rdf分别为2、3、4。

③查t值表（见EP6-A文件的附录B，选择双侧检验且α=0.05）。

如果非线性系数b2和b3的检验统计量t<t0.05(df)，则P>0.05，可以认为数据组呈线性关系。

如果二次回归多项式的b2，或三次回归多项式的b2或b3的检验统计量t>t0.05(df)，则P<0.05，可认为数据组呈非线性关系。

需要注意的是，这只表示分析方法在实验样本的浓度范围内为非线性，并不认为因为非线性的存在已经影响到患者的结果。

④如果二次回归多项式的b2和三次回归多项式的b3都是显著的，则需要选择最适多项式，具体方法为比较二次多项式和三次多项式回归标准误（Sy.x，计算公式参考EP9-A2文件）大小，取Sy.x较小的多项式为最适多项式。

4.3.2 非线性度的判断计算每个样本的线性偏离DL i ，公式为DL i = p(x i) - (b0+b1x i),式中x的取值范围为x1…x n；p(x i) 为最适多项式在点x i处的计算值；b0+b1x i为一次回归多项式在点x i处的计算值，因此DL i 是最适非线性模型与线性模型在点x i处的差异。

由公式可知，DL i的单位与分析物的计量单位一致，因此可以将DL i 与预期目标进行比较。

如果预期目标以百分比表示，则可以将DL i 除以已知的样本浓度或多次重复测定结果的均值（使用相对浓度时）再乘以100%。

检查每个样本的DL i 并将其与该浓度水平处规定的误差标准作比较，如果每个DL i 均小于规定的误差标准，虽然回归多项式在统计学上已经检出显著的非线性，但是这还是可接受的。

如果任意一个DL i 大于规定的误差标准，说明分析方法在该浓度水平处可能存在非线性，可以按以下两种方法进行处理：①寻找非线性的原因（样本准备、干扰、仪器校准等）并将其纠正，必要时请求仪器生产商协助。

②观察测定值与预期值的散点图，观察非线性在分析浓度范围内的位置，如果是在两端，可以先删除DL i 太大那个点，并重新进行统计分析，但是这样会缩小线性范围。