痢疾杆菌分离与鉴定课件

痢疾杆菌的分离与鉴定濮阳市疾病预防控制中心许银怀第一节概述➢志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌，引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。

➢1899年由日本人志贺首先发现。

➢全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。

➢发展中国家发病率较高，如阿根廷990.6／10万、印度972.3／10万；发达国家相对较低，如美国6～12／10万、德国2.7／10万、法国0.3／10万；我国上世纪50～80年代发病率在46.37～1018.93／10万之间。

➢近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。

➢人群对细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。

➢据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%～15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。

➢发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。

美国宋内志贺菌>75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。

➢鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。

➢细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在7～9月份。

细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容：➢细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据；➢缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍；➢志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大；➢洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化；➢目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。

第二节病原学一、抗原分类志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。

(一) 菌体（O）抗原1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。

2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分为多种亚型。

(二)表面(K)抗原➢常在新分离的A、C、D群各血清型及B群的2a型、6型细菌中出现。

➢K抗原存在时，可阻止菌体抗原与相应免疫血清发生凝集；需经100℃30分钟加热破坏后露出菌体抗原，与相应的免疫血清发生凝集。

二、血清分群(一)A群(志贺痢疾杆菌):有12个血清型;具有K抗原菌株可阻碍O抗原的凝集;在我国常见的为2型(又称司密斯杆菌)，1型较少见，其余各型更为罕见。

(二)B群（福氏痢疾杆菌）➢具有型、群抗原；型抗原存在于同型菌株中；群抗原有多种，存在于B群各菌型中。

➢近年1C（I:7）、2b（Ⅱ:3,4;7）、3c（Ⅲ:6）、4c（Ⅳ:7,8）及4型（Ⅳ:-）等新型菌株出现。

➢目前有6个血清型，（14个亚型及2个变种)。

(三)C群(鲍氏痢疾杆菌):18个血清型。

(四)D群(宋内痢疾杆菌):仅一个血清型(Ⅰ、Ⅱ相);Ⅰ相(光滑型菌落)多从急性期感染病人标本中分离;Ⅱ相亦称R型(粗糙型菌落)常从慢性患者或带菌者检出。

三、属间抗原关系志贺菌属与埃希菌属的O抗原关系非常密切，有近半数的菌型与大肠埃希氏菌的某些O抗原完全相同；相同抗原菌属间存在血清交叉凝集反应。

表1 志贺菌属与大肠埃希菌的O抗原关系四、菌群分布与变迁➢菌群分布与变迁因国家、地区、年份不同而异。

➢40年代前A群是优势流行菌,60年代初几乎销声匿迹，但1969-1970年突然在中美地区暴发，1972-1978年又在南亚的孟加拉国连年发生流行，继之印度、斯里兰卡、马尔代夫、尼泊尔、不丹、缅甸、泰国等地区和国家受到侵袭。

➢D群从60年代起在许多工业发达国家跃居首位。

➢国内过去流行菌型为2a为主;近年来4、4c、5b、1a等菌型呈上升趋势；城市D群为上升态势。

➢我国个别地区发现A1型和C18型局部暴发流行。

五、溶原性➢噬菌体对相应的细菌具有特异性裂解作用,温和噬菌体DNA侵入宿主细胞后，整合于宿主细胞的染色体DNA上，称为前噬菌体；➢前噬菌体与宿主细胞的染色体同时复制，这个过程称为溶原化；➢被感染的细菌称为溶原性细菌。

➢溶原性细菌对于相同的噬菌体具有免疫力，并获得一些新的性状，称为溶原性转换。

该转换可导致福氏志贺菌型抗原和群抗原发生广泛的变异。

六、变异性(一) S-R变异➢志贺菌属菌落可由光滑型变异成为粗糙型(S-R变异)，并常伴有生化反应、抗原构造和致病性的变异。

➢在慢性痢疾病人或恢复期病人体内，菌株可变异成为不典型菌株。

部分变异菌株可通过10％的胆汁肉汤培养发生返祖，成为典型菌株。

因而在分离这类细菌时注意要反复多次地检查。

(二) 抗原变异(溶原性转换)➢根据溶原性转换变种和细胞壁多糖免疫化学分析,福氏志贺菌除6型菌外其它型、亚型以及变种都是由一个种所产生的许多溶原性的变种。

➢y变种是非溶原性的前体型，当被六种不同的噬菌体溶原化后，可以变为各型福氏菌的a亚型或x变种，这是第一次溶原化；➢一次溶原化的培养物，还可以发生第二次溶原化，变为各型福氏菌的b亚型。

➢福氏型特异性抗原Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ和群7,8抗原，均以y变种群3,4抗原多糖为前体型，经温和噬菌体溶原性转换而来。

➢噬菌体(Φ)7,8溶原化的结果是使群7,8抗原变为x变种，同时群3,4抗原成为隐蔽状态；➢前体型经ΦⅡ、ΦⅤ、ΦⅠ、ΦⅣ溶原化结果，则是相应型抗原的产生，分别变为2a、5a、1a、4a等型。

其中x变种、2a型和5a 型还可以经第二次的溶原化，变为2b型和5b型。

➢群6抗原是群4抗原乙酰化（ΦⅢ,6溶原性转换）所致；型Ⅲ抗原为群3,4复合抗原乙酰化的结果。

福氏1a型和4a型的群4抗原乙酰化后出现群6抗原，变为1b型和4b型，但此时型Ⅲ抗原成为隐蔽状态,仅当型抗原Ⅰ、Ⅳ消失时显现。

➢宋内志贺菌Ⅰ相抗原受控于一个140Mda大质粒，若质粒丢失，Ⅰ相抗原不能合成，菌则从Ⅰ相转变为Ⅱ相。

(三) 毒力变异志贺菌的2型肠毒素（ShET-2）、粘附性、侵袭力、胞内繁殖、细胞间扩散等活性编码基因均存在于一个140Mda的质粒上，其表达受染色体上多个基因的调控。

该调控基因的变异或大质粒的丢失，均可造成毒菌株的毒力减弱或消失。

七、致病性(一)侵袭力：菌毛-有利于菌粘附至肠粘膜(二)毒素：↗通透性增加内毒素→局部→作用于肠壁↘↘粘膜炎症、溃疡全身→内毒素血症外毒素（A群1型）→与内毒素协同作用↘加重局部和全身症状➢志贺菌具有抗酸性，能顺利通过胃酸屏障进入肠道，侵袭于结肠粘膜上皮细胞，引起炎症反应。

➢有研究表明最小感染剂量为10个CFU。

➢产生的SHET1肠毒素是染色体编码毒素，主要见于福氏志贺菌；SHET2是质粒编码毒素，志贺菌和侵袭性大肠杆菌均能产生。

➢痢疾志贺菌可产生志贺毒素（ST），为染色体编码，由1个A亚单位和5个B亚单位构成，具有肠毒性、细胞毒性和神经毒性。

第三节实验室分离一、标本的采集和运送(一) 标本的采集腹泻病人粪便标本：➢监测点人员发现疑似病人和腹泻病人后，立即发给病人洁净塑料袋，要求其接取自然排出的可疑粪便部分立即送检；➢婴幼、儿童则让其父母协助其坐排于罩有干净塑料袋的痰盂内(要求勿混入尿液)。

➢用2个棉拭子分别在大便中可疑部分多点蘸取并旋转棉拭子使全部蘸满大便（约1-2克）。

➢将绵拭子插入装有Cary-Blair运送培养基的采样管中(注意培养基应埋住粪便拭子)，手接触的棉签尾部在管口处折断丢弃。

➢编号后将采样管置4℃冰箱或冷藏包中保存。

➢认真填写腹泻病人粪便采样表。

监测点/村医需配备和更换的监测材料:➢腹泻病人粪便采样登记表。

➢消毒棉签。

➢装有Cary-Blair运送培养基的采样管(4℃保存可备用半年)。

➢采便塑料袋。

➢冷藏包(应每日更换冰排) 。

(二) 标本的运送➢采集标本后应立即通知监测点运送标本人员，或每天分中午、下午两次送交实验室。

➢如当天晚上采集，最长保存时间最好是48小时内。

二、实验室分离技术(一)选择分离培养基➢直接划线分离于麦康凯（MAC）及木糖赖氨酸去氧胆酸钠(XLD)，也可选志贺-沙门菌琼脂(SS) 、去氧胆酸钠硫化氢乳糖琼脂(DHL)、去氧胆酸钠柠檬酸盐琼脂(DCA)或海克顿肠道琼脂(HE)。

➢但慎用SS，其可抑制志贺菌1型生长常造成漏检。

表2.志贺菌及大肠菌在选择培养基上菌落生长特征木糖赖氨酸去氧胆酸钠琼脂（XLD)：木糖；赖氨酸5g；乳糖7.5g；蔗糖7.5g；去氧胆酸钠2.5g；硫代硫酸钠6.8g；柠檬酸铁铵；酚红。

去氧胆酸钠柠檬酸盐琼脂（DCA）:乳糖10g；去氧胆酸钠1g；柠檬酸铁1g；中性红0.03g。

(二)病原分离➢用接种环多点沾取粪便标本中可疑部分,或用采样拭子涂种，直接划线分离选择琼脂平板各一块（见示意图4）；➢36℃培养18～24小时。

如无菌生长或接种过密应重新分离平板（可取菌苔处）（合格的分离平板菌落数>150个）。

图4 采样拭子接种平板及划线分离方法示意图(三) 菌落生长特性➢志贺菌属是需氧或兼性厌氧杆菌。

➢经37℃培养18～24小时，形成圆形、稍凸起、边缘整齐、表面光滑、湿润、无色、半透明、直径约2mm的较小菌落；➢相对宋内菌的生长菌落较大、扁平，较不透明，易出现粗糙型菌落。

➢志贺痢疾杆菌1型的营养需求比较高，必须补给15种氨基酸方能生长。

(四) 生化初筛1.可疑菌落的观察和挑选：➢许多细菌在选择性培养基上被抑制，既不发育也未死亡，有的能长出肉眼看不见的小菌落。

➢因而在观察、挑取可疑菌落时应用接种针挑取菌落中心，避免接触培养基表面以造成污染。

2.接种生化反应管：➢从选择培养平板上挑取可疑菌落3-5个，用接种针挑取菌落中心，分别接种KIA和MIU；➢先接种KIA(将接种针在其斜面上划直线，随之插入底层,取出后再在斜面上划密集的横线)，不经火焰直接穿刺接种MIU培养基；➢置36℃±1℃培养16～20小时后观察结果。

3.生化反应鉴别：➢KIA：斜面－黄(分解乳糖产酸)／红(不分解乳糖)；底部－红(产碱,非发酵菌)／黄(分解葡萄糖或乳糖)／产气／产H2S；➢MIU：动力(M)－沿接种线周围向外扩散生长呈现混浊者为阳性(用未接种MIU管对比观察)。

吲哚(I)－培养基变红为阳性。

尿素(U)－加0.5mlKovac’s试剂，数分钟内表层试剂变深红色为阳性。

表3.用克氏双糖(KIA) 和动力-吲哚-尿素(MIU)生化反应初步鉴别痢疾志贺菌与其它肠道菌爱德华氏菌属KⒶ+++––哈夫尼亚菌属D A++–––注：K碱性反应（红色）；A产酸（黄色）；Ⓐ产酸（黄色）＋产气；D不定（K或A）；W = 弱或迟缓反应；＊某些福氏6型产气；＊＊鲍氏痢疾菌血清13和14型产气；＊＊＊侵袭性大肠菌无动力。

4.注意事项：➢KIA管最好用棉花塞,若用螺旋帽或硅胶塞，将盖子拧松一些,使有足够的氧气促进反应;➢MIU需用橡皮胶塞盖紧，因尿素酶反应需避开氧气。