Western-blot实验方法步骤(精编课件).ppt
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疑难杂证
• 请问分子量为41KD和57KD作WESTERN时,可以分 开切胶吗?分别用多大电流转膜?转多长时间?
理论上分的开！蛋白Marker分子量分别为97kd 66kd、45kd、30kd、21kd、14kd ！跑蛋白时， 分离的效果都比较好！分子量为41KD和57KD的蛋 白分子量相差16KD！蛋白Marker的45kd、30kd， 蛋白分子量相差15KD，分离效果很明显。应该可 以分开切胶！
• 多克隆抗血清是由单一免疫球蛋白组成的不确定混合物， 通常对其特异性、亲和力以及浓度都一无所知。因而不可 能预言用特定多克隆抗血清来测定某一固定化变性靶蛋白 上的不同抗原表位的效果。
• 设置对照： 1不与靶蛋白反应的抗体（即免疫前血清或非相关单克隆抗 体） 2 样品对照，即含有已知量靶抗原或完全不含有靶抗原的 制品
• 超声打碎染色体DNA,直至溶液不粘为止。 • 4度，13000rpm，30分钟离心。分成三层：上
层为油脂，中层为蛋白质，下层为沉淀。 • 有必要时重复上一步骤。 • 上清用于做SDS-PAGE，如不能立即做，可将上
清转入另一Eppendorf -80°C保存
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注意事项
• 细胞裂解液的量 • 超声的频率，时间，次数。插得深不起泡
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配制试剂
• 4×SDS Sample Buffer
2.4克 Tris HCL，溶解在30ml水中100ml
40ml甘油
10ml DTT贮存液
• 1mol/L DTT贮存液：0.01mol/L 乙酸钠 20ml 3.09克DTT过滤除菌后20℃保存，分装成1ml。
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疑难杂证
• 没有注明可以用来做western blot的一抗， 可以用来做western blot吗？
不一定,因为有的抗体是识别线性表位的,有 的是识别构象型表位的，识别构象型表位 的抗体不能用于western blotting，因为在 western blotting中抗体识别的是完全变性 的蛋白质抗原，而蛋白质抗原的构象型表 位变性时被破坏。
冲液裂解。 • 2 酵母先用玻璃珠振荡法或酶法裂解细胞，然后
制备提取液。 • 3 哺乳动物组织通常可以机械分散并直接溶于
SDS凝胶加样缓冲液。 • 4 哺乳动物细胞可用去污剂温和裂解。如果靶抗
原耐受相应抽提过程，也可在SDS凝胶加样缓冲 液裂解。
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细胞准备
• 用PBS洗两次细胞，加入细胞裂解液，用橡胶刮 子刮下细胞，由于染色体DNA的释放，溶液变 得很粘稠。吸入1.5ml离心管。
• 考马斯亮兰染液：
45ml 甲醇
45ml 水
用Whatman滤纸过滤，去除颗粒状物质
10ml 冰乙酸
0.25克 考马斯亮兰R250
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抗体选择
• 一种免疫球蛋白可优先识别其靶表位的某一特定构象（例 如变性构象或天然构象）。并非所有的单克隆抗体都适合 作为探针用于WETERN-BLOT，因为这一实验中靶蛋白是 彻底变性的。
Western-blot 试验
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概论
• 它结合了凝胶分辨力高和固相免疫测定的特异敏 感等多种优点，与免疫沉淀法比较，这种方法无 需对靶蛋白进行同位素标记。几乎总在变性条件 下进行，可以避免溶解、聚集以及靶蛋白与外来 蛋白的共沉淀等诸多问题。
• 具有从混杂抗原中检测出特定抗原，或从多克隆 抗体中检测出单克隆抗体的优越性，还可以对转 移到固相膜上的蛋白质进行连续分析，具有蛋白 质反应均一性，固相膜保存时间长等优点。
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疑难杂证
• western blot 使用的膜哪种最好啊，PVDF好还 是NC膜，能介绍一下膜的选择吗？
PVDF膜价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白 印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。
NC膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差 一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白 吸附容量高，亲水性较好。
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实验步骤
• 转膜 小心取下凝胶，把预先在转膜缓冲液中平 衡过的Whatman滤纸及硝酸纤维素膜切成与凝 胶同样大小，按次序叠放在一起，在4度100V 电压转膜1H,取出硝酸纤维素膜，右上角切去以 作标记，丽春红染色，可见多条粉红色条带， 再用TBST漂洗至膜发白。
• 封闭 称取脱脂奶粉1克，用1×TBS溶解到20ml， 使脱脂奶粉浓度为5％。将硝酸膜浸在20ml封 闭液中，室温摇2h后。
沫。 • 检测蛋白的敏感性1－5ng,0.75mm厚的
SDS－PAGE的一个孔大约上100ug的总蛋 白。 • 只要被检测蛋白占总蛋白的1/100000,即可 被检测。 • 未知蛋白应同时作阳性对照。
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主要试剂
• RIPA（华舜公司） • 苯甲基磺酰氟PMSF（华舜公司） • 丙烯酰胺（Amresco公司） • 双丙烯酰胺（Amresco公司） • 丽春红染料（华舜公司） • Tween 20（Amresco公司） • 过硫酸铵（Sigma公司） • 四甲基乙二胺TEMED（Sigma公司） • 硝酸纤维素膜（Amersham公司） • 考马斯亮兰（Fluka公司） • 兔抗大鼠Glut 1多克隆抗体（Santa Cruz公司） • Phototope-HRP Western Blot Detection System（Cell Signaling
1、一抗、或二抗抗体浓度太高 2、多克隆抗体本身的非特异性反应 3、抗体的特异性不强 4、目的蛋白经过处理后发生变化,而内参的条带基本均匀 一致.这样才有说服力,表明的确是处理因素造成目的蛋白 的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化. 所以严格意义上说,内参是必须做的。
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配制试剂
• 10×电泳Buffer
称取Tris-base 30.3克
glycine
144克 加去离子水，定容至1000ml
SDS
10克
• 1.5M Tris.HCl PH 8.8
称取18.15克Tris，加60ml ddH2O溶解，调PH至8.8，定容100ml
• 0.5M Tris.HCl PH6.8
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配制试剂
• 30％Acry-Bis 29克丙烯酰胺＋1克双丙烯酰胺，加ddH2O 100ml配成，避光4℃保存
• 10％过硫酸胺，新鲜配制，<1week 0.1克过硫酸胺加ddH2O 1ml配成，4℃保存
• 封闭试剂 10×TBS （应用液：1×TBS） 10×TBS：取24.2克Tris－Base 80克氯化钠 用 800mlddH2O溶解后，用HCl调PH至7.6，定 容至1000ml 1×TBS：取10×TBS 50ml，稀释至500ml，临用 前加0.1％Tween 20，500ul。
称取6.0克Tris，加60ml ddH2O溶解，调PH至6.8，定容100ml
• 转膜缓冲液
称取3.03克Tris.base，14.4克Glycine，用ddH2O溶解，定容至 800ml，临用前加200ml甲醇
10*：30.3克Tris.base，144克Glycine，用ddH2O溶解，定容至 800ml。
• 选用抗变性蛋白的高滴度多克隆抗血清或单克隆抗体混合 物为佳。
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实验步骤
• 配胶 • 制胶 先用1ml枪头小心铺10%分离胶，上加少
许异丙醇，待分离胶干凝后，倒去异丙醇，用 水洗去多余未聚合的胶，滤纸吸干。再铺4%积 层胶，注意不要产生气泡，斜插上梳子，待胶 干后备用，拔去梳子。 • 上样，所有上样孔均加样，没有样本，用上样 缓冲液代替。 • 100V，溴酚兰走到分离胶底部后，1.5h后电泳 结束。
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疑难杂证
• 分别用多大电流转膜? 一、一般跟你的分离胶的浓度有关。 二、与你的转印系统型号有关. 三、与目的蛋白的分子量有关. 一般50KD左右的蛋白，50mA，1.5h；
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疑难杂证
• WESTERN为什么出现了多条带,每个加样槽中都出现了多 条带，而且好象都很有规律,为什么?是封闭时间不够吗,请 指教 .做WESTERN必须要内参吗？
疑难杂证
• western用的一抗,单抗好些还是用多抗好些？购买一抗时 发现单抗（用于western)比多抗（用于western和ELISA) 要便宜不少,用于western的抗体和用于ELISA的抗体有什 么不同的要求？ 作为western来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但 单抗种类较少一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。 用于western的抗体和用于ELISA的抗体，一般来说用于 western的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而可用于 ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特 异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书 来确定。 做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选 抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一 个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。
都可以用丽春红染色。 具体使用还要参考相关文献
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疑难杂证
• 做western，在分子量很低的位置总是出现一条 很强的带（通常比我要的带强），不知道为什么？ 是蛋白降解了吗？
有降解的可能，但如果用的是多抗出现非特异也 是可能的，关键是你要的位置出现了吗？
减少非特异可以延长封闭时间，对付降解要视 具体情况了。
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疑难杂证
• 做western每次只加一种一抗，请教有人同时加两种或者 多种一抗的吗？ 最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非 特异信号的话，就说不清楚了。做Western在同一张膜上 检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗， ECL显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、 二抗，ECL显色、压片、洗片。 曾经做过Western在同一张膜上检测两种蛋白。因为这 两种目的蛋白的分子量相差较远，转完膜后，一边给 Marker染色，一边封闭。在上一抗之前，根据Marker的 条带把膜水平剪开，分子量小的目的蛋白在下面半张，大 的在上面半张。然后分别上一抗、二抗，检测。
疑难杂证
• 请问分子量为41KD和57KD作WESTERN时,可以分 开切胶吗?分别用多大电流转膜?转多长时间?
理论上分的开！蛋白Marker分子量分别为97kd 66kd、45kd、30kd、21kd、14kd ！跑蛋白时， 分离的效果都比较好！分子量为41KD和57KD的蛋 白分子量相差16KD！蛋白Marker的45kd、30kd， 蛋白分子量相差15KD，分离效果很明显。应该可 以分开切胶！
• 多克隆抗血清是由单一免疫球蛋白组成的不确定混合物， 通常对其特异性、亲和力以及浓度都一无所知。因而不可 能预言用特定多克隆抗血清来测定某一固定化变性靶蛋白 上的不同抗原表位的效果。
• 设置对照： 1不与靶蛋白反应的抗体（即免疫前血清或非相关单克隆抗 体） 2 样品对照，即含有已知量靶抗原或完全不含有靶抗原的 制品
• 超声打碎染色体DNA,直至溶液不粘为止。 • 4度，13000rpm，30分钟离心。分成三层：上
层为油脂，中层为蛋白质，下层为沉淀。 • 有必要时重复上一步骤。 • 上清用于做SDS-PAGE，如不能立即做，可将上
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注意事项
• 细胞裂解液的量 • 超声的频率，时间，次数。插得深不起泡
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• 4×SDS Sample Buffer
2.4克 Tris HCL，溶解在30ml水中100ml
40ml甘油
10ml DTT贮存液
• 1mol/L DTT贮存液：0.01mol/L 乙酸钠 20ml 3.09克DTT过滤除菌后20℃保存，分装成1ml。
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疑难杂证
• 没有注明可以用来做western blot的一抗， 可以用来做western blot吗？
不一定,因为有的抗体是识别线性表位的,有 的是识别构象型表位的，识别构象型表位 的抗体不能用于western blotting，因为在 western blotting中抗体识别的是完全变性 的蛋白质抗原，而蛋白质抗原的构象型表 位变性时被破坏。
冲液裂解。 • 2 酵母先用玻璃珠振荡法或酶法裂解细胞，然后
制备提取液。 • 3 哺乳动物组织通常可以机械分散并直接溶于
SDS凝胶加样缓冲液。 • 4 哺乳动物细胞可用去污剂温和裂解。如果靶抗
原耐受相应抽提过程，也可在SDS凝胶加样缓冲 液裂解。
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• 用PBS洗两次细胞，加入细胞裂解液，用橡胶刮 子刮下细胞，由于染色体DNA的释放，溶液变 得很粘稠。吸入1.5ml离心管。
• 考马斯亮兰染液：
45ml 甲醇
45ml 水
用Whatman滤纸过滤，去除颗粒状物质
10ml 冰乙酸
0.25克 考马斯亮兰R250
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抗体选择
• 一种免疫球蛋白可优先识别其靶表位的某一特定构象（例 如变性构象或天然构象）。并非所有的单克隆抗体都适合 作为探针用于WETERN-BLOT，因为这一实验中靶蛋白是 彻底变性的。
Western-blot 试验
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概论
• 它结合了凝胶分辨力高和固相免疫测定的特异敏 感等多种优点，与免疫沉淀法比较，这种方法无 需对靶蛋白进行同位素标记。几乎总在变性条件 下进行，可以避免溶解、聚集以及靶蛋白与外来 蛋白的共沉淀等诸多问题。
• 具有从混杂抗原中检测出特定抗原，或从多克隆 抗体中检测出单克隆抗体的优越性，还可以对转 移到固相膜上的蛋白质进行连续分析，具有蛋白 质反应均一性，固相膜保存时间长等优点。
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• western blot 使用的膜哪种最好啊，PVDF好还 是NC膜，能介绍一下膜的选择吗？
PVDF膜价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白 印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。
NC膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差 一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白 吸附容量高，亲水性较好。
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实验步骤
• 转膜 小心取下凝胶，把预先在转膜缓冲液中平 衡过的Whatman滤纸及硝酸纤维素膜切成与凝 胶同样大小，按次序叠放在一起，在4度100V 电压转膜1H,取出硝酸纤维素膜，右上角切去以 作标记，丽春红染色，可见多条粉红色条带， 再用TBST漂洗至膜发白。
• 封闭 称取脱脂奶粉1克，用1×TBS溶解到20ml， 使脱脂奶粉浓度为5％。将硝酸膜浸在20ml封 闭液中，室温摇2h后。
沫。 • 检测蛋白的敏感性1－5ng,0.75mm厚的
SDS－PAGE的一个孔大约上100ug的总蛋 白。 • 只要被检测蛋白占总蛋白的1/100000,即可 被检测。 • 未知蛋白应同时作阳性对照。
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主要试剂
• RIPA（华舜公司） • 苯甲基磺酰氟PMSF（华舜公司） • 丙烯酰胺（Amresco公司） • 双丙烯酰胺（Amresco公司） • 丽春红染料（华舜公司） • Tween 20（Amresco公司） • 过硫酸铵（Sigma公司） • 四甲基乙二胺TEMED（Sigma公司） • 硝酸纤维素膜（Amersham公司） • 考马斯亮兰（Fluka公司） • 兔抗大鼠Glut 1多克隆抗体（Santa Cruz公司） • Phototope-HRP Western Blot Detection System（Cell Signaling
1、一抗、或二抗抗体浓度太高 2、多克隆抗体本身的非特异性反应 3、抗体的特异性不强 4、目的蛋白经过处理后发生变化,而内参的条带基本均匀 一致.这样才有说服力,表明的确是处理因素造成目的蛋白 的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化. 所以严格意义上说,内参是必须做的。
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• 10×电泳Buffer
称取Tris-base 30.3克
glycine
144克 加去离子水，定容至1000ml
SDS
10克
• 1.5M Tris.HCl PH 8.8
称取18.15克Tris，加60ml ddH2O溶解，调PH至8.8，定容100ml
• 0.5M Tris.HCl PH6.8
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• 30％Acry-Bis 29克丙烯酰胺＋1克双丙烯酰胺，加ddH2O 100ml配成，避光4℃保存
• 10％过硫酸胺，新鲜配制，<1week 0.1克过硫酸胺加ddH2O 1ml配成，4℃保存
• 封闭试剂 10×TBS （应用液：1×TBS） 10×TBS：取24.2克Tris－Base 80克氯化钠 用 800mlddH2O溶解后，用HCl调PH至7.6，定 容至1000ml 1×TBS：取10×TBS 50ml，稀释至500ml，临用 前加0.1％Tween 20，500ul。
称取6.0克Tris，加60ml ddH2O溶解，调PH至6.8，定容100ml
• 转膜缓冲液
称取3.03克Tris.base，14.4克Glycine，用ddH2O溶解，定容至 800ml，临用前加200ml甲醇
10*：30.3克Tris.base，144克Glycine，用ddH2O溶解，定容至 800ml。
• 选用抗变性蛋白的高滴度多克隆抗血清或单克隆抗体混合 物为佳。
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• 配胶 • 制胶 先用1ml枪头小心铺10%分离胶，上加少
许异丙醇，待分离胶干凝后，倒去异丙醇，用 水洗去多余未聚合的胶，滤纸吸干。再铺4%积 层胶，注意不要产生气泡，斜插上梳子，待胶 干后备用，拔去梳子。 • 上样，所有上样孔均加样，没有样本，用上样 缓冲液代替。 • 100V，溴酚兰走到分离胶底部后，1.5h后电泳 结束。
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疑难杂证
• 分别用多大电流转膜? 一、一般跟你的分离胶的浓度有关。 二、与你的转印系统型号有关. 三、与目的蛋白的分子量有关. 一般50KD左右的蛋白，50mA，1.5h；
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疑难杂证
• WESTERN为什么出现了多条带,每个加样槽中都出现了多 条带，而且好象都很有规律,为什么?是封闭时间不够吗,请 指教 .做WESTERN必须要内参吗？
疑难杂证
• western用的一抗,单抗好些还是用多抗好些？购买一抗时 发现单抗（用于western)比多抗（用于western和ELISA) 要便宜不少,用于western的抗体和用于ELISA的抗体有什 么不同的要求？ 作为western来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但 单抗种类较少一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。 用于western的抗体和用于ELISA的抗体，一般来说用于 western的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而可用于 ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特 异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书 来确定。 做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选 抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一 个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。
都可以用丽春红染色。 具体使用还要参考相关文献
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• 做western，在分子量很低的位置总是出现一条 很强的带（通常比我要的带强），不知道为什么？ 是蛋白降解了吗？
有降解的可能，但如果用的是多抗出现非特异也 是可能的，关键是你要的位置出现了吗？
减少非特异可以延长封闭时间，对付降解要视 具体情况了。
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• 做western每次只加一种一抗，请教有人同时加两种或者 多种一抗的吗？ 最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非 特异信号的话，就说不清楚了。做Western在同一张膜上 检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗， ECL显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、 二抗，ECL显色、压片、洗片。 曾经做过Western在同一张膜上检测两种蛋白。因为这 两种目的蛋白的分子量相差较远，转完膜后，一边给 Marker染色，一边封闭。在上一抗之前，根据Marker的 条带把膜水平剪开，分子量小的目的蛋白在下面半张，大 的在上面半张。然后分别上一抗、二抗，检测。
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WESTERNBLOT操作步骤图PPT课件
WESTERN BLOTTING 过程图解
1
图中绿色的是夹玻璃片的架子
2
玻璃板对齐后放入架中，把两侧的夹子卡紧。要使短玻璃靠 外，长玻璃靠内。
3
然后垂直卡在架子上准备灌胶。操作时要使两玻璃对齐，以 免漏胶。 图示两块玻璃板放在一个架子上。
4
配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸 取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层 水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要 放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液
33
将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中
34
室温下脱色摇床上摇动封闭1h。 35
按所需稀释浓度滴加一抗（直接加在封闭液里）4℃ 过夜或37℃ 3h。
36
第二天取出膜，用TBST洗三次每次10min，然后加 入TBS液中，按稀释浓度滴加二抗。室温孵育1h,再用 TBST洗三次每次10min。最后DAB显色或者化学发光法 显影。
封时要很慢，否则胶会被冲变型。）
5
当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等 3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸 干。 按前面方法配4％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可 灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。 灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
6
16
电泳时间一般1-2 h，电压为100V较好，也可用60V。电
泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳。
17
取出转移槽
18
2020/3/6
可编辑修改
19
取下玻璃板
20
两块玻璃板都已经取下
1
图中绿色的是夹玻璃片的架子
2
玻璃板对齐后放入架中，把两侧的夹子卡紧。要使短玻璃靠 外，长玻璃靠内。
3
然后垂直卡在架子上准备灌胶。操作时要使两玻璃对齐，以 免漏胶。 图示两块玻璃板放在一个架子上。
4
配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸 取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层 水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要 放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液
33
将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中
34
室温下脱色摇床上摇动封闭1h。 35
按所需稀释浓度滴加一抗（直接加在封闭液里）4℃ 过夜或37℃ 3h。
36
第二天取出膜，用TBST洗三次每次10min，然后加 入TBS液中，按稀释浓度滴加二抗。室温孵育1h,再用 TBST洗三次每次10min。最后DAB显色或者化学发光法 显影。
封时要很慢，否则胶会被冲变型。）
5
当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等 3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸 干。 按前面方法配4％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可 灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。 灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
6
16
电泳时间一般1-2 h，电压为100V较好，也可用60V。电
泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳。
17
取出转移槽
18
2020/3/6
可编辑修改
19
取下玻璃板
20
两块玻璃板都已经取下
Westernblot实验技术PPT
待测蛋白状态 凝胶条件
上样buffer
电泳buffer
ReducedDenatured
ReducedNative
OxidizedDenatured
OxidizedNative
还原，变 性
还原，不 变性
不还原， 变性
不还原， 不变性
含β-巯基乙醇或 DTT，含SDS
含β-巯基乙醇或 DTT，不含SDS
泳动速率就只剩下分子大小一项因素
凝胶成份
丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵(时间) Tris-甘氨酸电泳缓冲液
分子筛效应
AP-TEMED系统 单体：丙烯酰胺（Acr） 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis） 催化剂：过硫酸铵（AP） 诱发剂：四甲基乙二胺（TEMED）
配胶温度：室温或37℃ 配胶试剂：
AP：现用现配或分装冻存 TEMED ：最后加,边加边晃 Tris-HCl: 上下胶pH勿混(上6.8/下8.8) 丙烯酰胺: 神经毒性
蛋白分子量 （ku） 4-40 10-43 12-60 20-80
25-200 57-212
凝胶浓度 （％） 20 15 12 10 8 5
检测；
WB常见问题
无信号(白板)或 弱信号(不是白板胜似白板) 高背景(黑板、几尽黑板) 非特异性条带（杂带） 脏带（操作）、补丁染色 表情条带（微笑、皱眉） 闹鬼（鬼带、鬼影） 拖尾、纹理、偏斜、过长、过粗条带 其它
无信号/弱信号问题(白板)
1. 样品
样品中无目的蛋白或目的蛋白降解---- ①设立阳性对照②检查封闭液 是否有蛋白酶③使用蛋白酶抑制剂
封闭问题
定义:
使用含有惰性蛋白质或非离子去污剂 的缓冲液（PBST/TBST）封闭杂交膜 上的非特异性位点
western-blotting(蛋白免疫印迹)PPT课件
.
20
膜的选择
1. PVDF膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹 法中常用的一种固相支持物。
2. PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔 径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 大于20KD的蛋白选用0.45um的膜，小于20KD的 蛋白选用0.2um的膜。
1.含HRP的抗体； 2.发光试剂； 3.反应的杂质;
.
27
洗脱抗体
一抗洗脱 二抗洗脱 一抗种属来源不同时，strip二抗即可
.
28
三、显色
暗室曝光 Tanon 5200 全自动化学发光图像分析系统
.
29
Tanon 5200---性能特点
适用于高分辨率和高灵 敏度的图像拍摄；
可设定连续采样的次数、 起始及终止曝光时间， 进行动态连续拍摄，拍 摄得高质量的图片；
在裂解液中加入合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准
确性！ .
7
蛋白样品的制备
① SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分 子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
② 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二 硫键，破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚 成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形 成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束。
对
电转仪长期使用导致海绵变薄，
策
“三明治”结构不紧凑导致。
确保膜和胶块之间没有气泡
缓冲液中离子浓度太低，电流或电
压太高。转膜过程注意降温
.
34
四、SDS-PAGE常见问题
背景太高
原因
1. 膜没有均匀浸湿 2. 膜或者缓冲液污染 3. 封闭不充分 4. 抗体与封闭剂出现交叉
Westernblot操作流程ppt课件
蛋白印迹杂交—— Western blot
张蕾
Western blot的原理
利用抗原抗体的免疫反应，先将蛋白通过SDSPAGE电泳分离开来，然后再利用电场力的作 用将胶上的蛋白转移到固相载体（NC膜或 PVDF膜）上，然后再加抗体形成抗原抗体复 合物，利用增强化学发光法或生色底物呈色反 应将结果显示到膜或底片上。从而对目的蛋白 进行定性和半定量分析的一种检测蛋白的方法
抗体的选择
显色或显影
印迹用酶联二抗处理后，再用适当的底物溶液处理 ，当酶纯化底物生成有颜色的产物时，就会出现可 见的区带，即指示目的蛋白的位置
酶联的二抗： 辣根过氧化物酶体系(HRP)：DAB显色或化学发光 试剂显影（ECL） 碱性磷酸酶体系(AP)： BCIP+NBT显色
ECL试剂采用氧化还原反应的原理：利用二抗 上标记的过氧化物酶或辣根过氧化物酶，在 H2O2的存在下，使底物(化学发光物质鲁米那) 发生氧化还原反应，从而发出荧光。
组织中总蛋白的提取 0.1g加入0.8ml RIPA（强）裂解液 用干净的剪刀将组织块尽量剪碎后匀浆
蛋白质含量的测定
考马斯亮兰染色法(CBB法，Bradford法)
原理：考马斯亮蓝(CBB)测定蛋白质含量属于染料结合法的 一种。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收 在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色 素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值 与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定 。
成像
关于内参
内参即是内部参照（Internal Control），对于哺 乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表 达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织 和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水 平变化时常用它来做参照物。以校正蛋白质定量 、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的 准确性。
张蕾
Western blot的原理
利用抗原抗体的免疫反应，先将蛋白通过SDSPAGE电泳分离开来，然后再利用电场力的作 用将胶上的蛋白转移到固相载体（NC膜或 PVDF膜）上，然后再加抗体形成抗原抗体复 合物，利用增强化学发光法或生色底物呈色反 应将结果显示到膜或底片上。从而对目的蛋白 进行定性和半定量分析的一种检测蛋白的方法
抗体的选择
显色或显影
印迹用酶联二抗处理后，再用适当的底物溶液处理 ，当酶纯化底物生成有颜色的产物时，就会出现可 见的区带，即指示目的蛋白的位置
酶联的二抗： 辣根过氧化物酶体系(HRP)：DAB显色或化学发光 试剂显影（ECL） 碱性磷酸酶体系(AP)： BCIP+NBT显色
ECL试剂采用氧化还原反应的原理：利用二抗 上标记的过氧化物酶或辣根过氧化物酶，在 H2O2的存在下，使底物(化学发光物质鲁米那) 发生氧化还原反应，从而发出荧光。
组织中总蛋白的提取 0.1g加入0.8ml RIPA（强）裂解液 用干净的剪刀将组织块尽量剪碎后匀浆
蛋白质含量的测定
考马斯亮兰染色法(CBB法，Bradford法)
原理：考马斯亮蓝(CBB)测定蛋白质含量属于染料结合法的 一种。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收 在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色 素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值 与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定 。
成像
关于内参
内参即是内部参照（Internal Control），对于哺 乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表 达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织 和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水 平变化时常用它来做参照物。以校正蛋白质定量 、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的 准确性。
westernblot详解PPT课件
蛋白质Marker
➢主要目的是确定靶蛋白的分子量大小； 使用预染的Marker还可以实时检测电泳 分离情况，并可以转移到膜上。
Fermentas
Prestained protein ladders Unstained protein ladders
第29页/共53页
上样缓冲液 Loading buffer
第6页/共53页
第7页/共53页
一 配分离胶
准备物品： 玻璃板 洗衣粉 灌胶架 移液枪 两个烧杯（ 1 ml 200ul 20ul） 30%Acrylamide 1M （4度冰箱）， Tris-HCL 溶液（ PH=8.8）， ddH2O 10%AP （-20冰箱） ， TEMD（4度 ） ，SDS（常温） 1 清洗玻璃板： 一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗衣粉轻轻擦 洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用ddH2O冲洗干净后立在 通风处或烘箱中 2 配制分离胶： 玻璃板对齐后放入夹中加紧，注意使两玻璃板对齐。然后垂直卡 在架子上准备灌胶。 先配制分离胶。配方如下：
1.将200mg组织块剪碎，置于1ml裂解液中（
5ml离心管）。
2.匀浆器进行匀浆，注意冰上操作，匀浆后置于
冰上。
3.10，000g ,4℃,10min,（5ml管）离心
4.取上清至1.5ml管，12，000g ,4℃,60min,
离心
5.取上清至新1.5ml管,-80℃储存
第22页/共53页
3·1·2 蛋白样品浓度的测定方法
第18页/共53页
3·1 固定
①用ddH2O水冲洗一下玻璃板，将其放入电 泳槽中。注意，小玻璃板面向内，大玻璃板 面向外。
②向电泳槽中加入1x电泳液
• 5X电泳液缓冲液 ③Tr拔is（掉M梳W子1，2注1.1意4动）作轻柔。
《westernblot精华》PPT课件
3.大部分抗体收到后40C短暂保存1-2周对抗体活性是没有影 响的。
任何时候，绝对避免反复冻融！
精选课件ppt
21
Western Blot常见问题分析
精选课件ppt
22
SDS-PAGE电泳
胶不平？ 凝胶漏液？
➢ 胶板洗刷干净 ➢ 加入APS和TEMED的量要合适 ➢ 加入试剂后摇匀，使其充分混
精选课件ppt
17
封闭（1h）(封闭时间过短会导致背景过深 )
5％脱脂奶粉封闭1h，置于摇床上。 封闭前，要用双蒸水洗3-5min,
剪膜
精选课件ppt
18
一抗、二抗孵育
把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料盒中，根据滤膜面积以 0.1ml/cm2的量加入一抗溶液与滤膜温育（抗体浓度过高会导 致背景较深，过低会导致和抗原结合不充分，出现假阴性 ）。室温 不少于7小时，4 ℃时过夜。（一般）
10%-SDS
150ul
50ul
10%-APS
150ul
50ul
TEMED
15ul
10ul
精选课件pp
3.5 5.0 8.0 12.0 15.0 20.0 30.0
分离范围（KD)
100-2000 80-500 60-400 40-200 25-150 6-100 6以下
精选课件ppt
6
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理：
SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水 性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺 基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋 白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质和SDS结合
western blot原理及操作方法ppt课件
常见问题
8.二抗的选择根据一抗的种属来源，如：一抗是兔抗大鼠目 的蛋白的抗体，则二抗应选择山羊或其他来源抗兔的抗体， 而且二抗要标记有同位素或酶。 9.条带两边扩散：加样量过多 10.条带两边高，中间凹 原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏 高
常见问题
11.条带呈皱眉状，中间高，两边低 原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡 板底部有气泡，或者两边聚合不完全 12.条带有拖尾现象 原因：样品溶解不好 13.混合搅拌速度时不宜太快，容易产生气泡影响聚合，导致 电泳带畸形。 太慢不均匀，特别是甘油
常见问题
3. 加入分离胶后，立即覆一层双蒸水，一是为了使分离胶界 面保持水平，用水就可以把它压平，使蛋白质分子跑时在 同一水平线上；二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制 作用。也可以覆盖一层无水乙醇。
常见问题
4. 从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜保湿，避 免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。 5.膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路 6.电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温 7.切滤纸和膜时，一定要戴手套，因为手上的蛋白会污 染膜
主要试剂
13.封闭缓冲液 封闭膜上的非特异性蛋白结合位点，防止一抗、二抗 的非特异性反应 • TBST Buffer 100 mL • 5 % Nonfat Milk 5g 14.一抗 15.二抗：羊抗兔IgG/HRP（辣根过氧化酶） 使试剂中的发光物氧化并发光 16. ECL检测试剂
操作步骤
提取总蛋白
主要试剂
8.10×转印Buffer（贮存液） 4℃保存 • 10×转印Buffer（贮存液）的配制： • 0.25 M Tris 30.28 g • 1.92 M Glycine 144.13 g • 三蒸水定容至 1000 mL • 1×Transfer Buffer（工作液）： • 10×Transfer Buffer 100 mL • 三蒸水 700 mL • 20 % 甲醇 200 mL
蛋白质免疫印迹实验(Western-BlotPPT课件
硝酸纤维素薄膜和六层Whatman 3MM滤纸，在硝酸纤维素薄膜左下角 剪去一角作为标记。将硝酸纤维素薄膜漂浮于去离子水的表面，使水从 膜的下部浸透以去除其间气泡，将Whatman 3MM滤纸在电转移缓冲液 中浸湿，用蒸馏水淋洗石墨电极，先将三层浸湿的滤纸放在阳极上，在 滤纸表面滚动玻璃棒以除去其间的气泡，再将浸湿的硝酸纤维素薄膜小 心平铺在滤纸上，用玻璃棒小心去除气泡。随后将12%SDS-PAGE凝胶 舒展平铺在硝酸纤维素薄膜上，用玻璃棒小心去除气泡，再将三层浸湿 的滤纸平铺在凝胶上，沁心去除气泡，最后加上石墨电极板，接通电源 进行电转移，电流的大小由凝胶的大小决定，为0.65mA/平方厘米。电 转移2小时后，停止通电，卸掉电转移装置，取下凝胶进行考马斯亮兰 染色，以检测电转移是否完全。小心取下硝酸纤维素薄膜，放在一张干 滤纸上，吸干30-60分钟后，开始进显色反应。
蛋白质免疫印迹实验
（Western Blotting）
.
1
一 实验原理
Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。
首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离， 然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固 体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。 随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为第 一抗体）为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免疫反 应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗 第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应， 只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体 发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存 在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二抗体的 待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。
缓冲液在室温下封闭2小时，同时1：100加入兔抗GST
蛋白质免疫印迹实验
（Western Blotting）
.
1
一 实验原理
Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。
首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离， 然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固 体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。 随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为第 一抗体）为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免疫反 应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗 第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应， 只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体 发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存 在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二抗体的 待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。
缓冲液在室温下封闭2小时，同时1：100加入兔抗GST
Wesern-bloing蛋白免疫印迹实验ppt课件
子时要使梳子保持水平。）
④ 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，
槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
27
清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
①测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋 白加入4：15*Loading Buffer于离心管，100℃水中煮5min使蛋白 变性。放置冰上3min，离心15min，13000rpm，4℃。
2.结果分析
3.注意事项
四
实验室常见问题解答
20
蛋白样品制 备 蛋白含量测
定
21
在六孔板中，按照一 个孔添加150μL的比 例添加适量RIPA裂解 液，用枪吹打均匀以 充分接触细胞。
样品放置冰上 30min（中间混 匀5-6次）直至 裂解完全。
充分裂解后，1000014000g离心3-5分钟， 取上清，即可进行后续 的PAGE、Western和免 疫沉淀等操作
②加足够的1*电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃 板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样 器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气
泡也可能使样品溢出。）
28
清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
浓缩胶80V电压跑20 分钟，可多跑几分钟； 分离胶180V电压跑 至底端。
疾病早期诊断
例：诸延慧，容瓘等.酶联免疫印迹术(EITB)在小鼠日本血吸虫感染早期 诊断中的应用[J]. 中国人兽共患病杂志,1993,9(3):26-29.
5
检测样品中特异性蛋白质是否
④ 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，
槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
27
清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
①测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋 白加入4：15*Loading Buffer于离心管，100℃水中煮5min使蛋白 变性。放置冰上3min，离心15min，13000rpm，4℃。
2.结果分析
3.注意事项
四
实验室常见问题解答
20
蛋白样品制 备 蛋白含量测
定
21
在六孔板中，按照一 个孔添加150μL的比 例添加适量RIPA裂解 液，用枪吹打均匀以 充分接触细胞。
样品放置冰上 30min（中间混 匀5-6次）直至 裂解完全。
充分裂解后，1000014000g离心3-5分钟， 取上清，即可进行后续 的PAGE、Western和免 疫沉淀等操作
②加足够的1*电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃 板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样 器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气
泡也可能使样品溢出。）
28
清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
浓缩胶80V电压跑20 分钟，可多跑几分钟； 分离胶180V电压跑 至底端。
疾病早期诊断
例：诸延慧，容瓘等.酶联免疫印迹术(EITB)在小鼠日本血吸虫感染早期 诊断中的应用[J]. 中国人兽共患病杂志,1993,9(3):26-29.
5
检测样品中特异性蛋白质是否
Western blot 实验原理和实验步骤 PPT
1
Western blot 基本原理
蛋白免疫印迹的组成
Western blot 一般流程
Western blot 常见问题分析
Western Blot基本原理
WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，
“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。SDS-PAGE可对蛋白质
样品进行分离，转移到固相载体——例如PVDF膜上。固相载体可
滤纸，擀几下盖上阴极盖子。整个操作在转膜液中进行，要不断的擀去气泡。
（5） 将盒子放入转膜槽中，转膜时会产热，打开电源，设置mA 和时间转
膜时间。
转膜条件
11
ห้องสมุดไป่ตู้
推荐：25V，1.0A，25min。（适合本实验室半干转移条件）
转膜注意事项： 滤纸、胶、膜之间不能有气泡产生 滤纸、胶、膜的大小和摆放顺序 胶和膜上要做好标记，识别正反面和上下 PVDF膜需要100%甲醇预处理，后续操作中膜必须保持湿润
以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
转移后的PVDF膜就称为一个印迹（blot），用蛋白溶液（如
5%BSA或脱脂奶粉溶液）处理，封闭PVDF膜上的疏水结合位点。
用目标蛋白的抗体（一抗）处理PVDF膜——只有待研究的蛋白质
1
才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合 的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。用一抗处理过
小心剥下分离胶，并根据胶的大小裁剪同样大小PVDF膜，剪去膜的左上角作为
标记。如果样本多，同时做几张膜，可用铅笔在膜下角标ABCD或1234，这样可
以分出膜的正反和加样顺序。
注意：裁滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。