【精品】毛细管电泳法

毛细管电泳法电泳（electrophoresis）是电解质中带电粒子在电场作用下想电荷相反方向迁移的现象，利用种现象对物质进行分离分析的方法，称之为电泳法。

电泳已有近百年历史，在生物和生物化学发展中有重要的意义，Tiselins等用电泳法从人血清中分离出清蛋白、α—、β-和γ—球蛋白，由于他们的杰出贡献,1948年荣获诺贝尔化学奖。

经典电泳最大的局限性在于难以克服由高电压引起的电解质的自解，称为焦耳热（J ouleheating)，这种影响随电场强度的增大而迅速加剧,因此限制了高压电的应用。

毛细管电泳(Capillaryelectrophoresis，CE）是在散热效率很高的毛细管内进行的电泳,可以应用高压电,极大地改善了分离效果。

毛细管电泳的开创性工作一般认为是在1981年,Jorgenson和Lukacs使用内径75µm的毛细管柱，分离丹酰化氨基酸，获得了40万/米理论塔板数的高柱效，充分展现了细内经毛细管电泳的巨大潜力。

他们还从理论上证明，毛细管电泳柱效与电场强度成正比,与分子扩散系数成反比，这样意味着外加高电压可以获高柱效，而且分离扩散系数小的分子，如生物大分子可以更有效。

随着1988年商品仪器的迅速推出，毛细管电泳开始突飞猛进的发展.近年来又建立了芯片式毛细管电泳(Chipcapillaryelectrophoresis;CCE）和阵列毛细管电泳（capillaryarrayelectrophoresis；CAE）.芯片式毛细管电泳利用刻制在载玻片上的毛细通道进行电泳,可以在秒级时间内完成上百的样品的同时分析。

阵列式毛细管芯片有多条电泳通道,如Mathies实验室理由具有96条放射状分布的阵列毛细管芯片在25min内完成了四色M13标准DNA的测序工作。

此外,还实现了样品预处理及柱后衍生化芯片式毛细管电泳.毛细管电泳对单细胞成分的分析、对疾病的早期诊断和特定药物的研究开发都具有重大的意义.第一节毛细管电泳的特点和分类一、电泳与色谱毛细管电泳和色谱都是一种分离分析方法，但二者的原理不同，两者比较见下。

1.分离原理电泳是指带电粒子在一定介质中因电场作用而发生定向运动,因粒子所带的电荷数、形状、离解度等不同,有不同的迁移速度而分离。

色谱是不同组分在两相(固定相和流动相）中的分配系数的不同而分离。

但毛细管电泳的一些分离模式也包含了色谱的分离机制。

2.分离过程电泳和色谱的分离过成都是差速迁移过程，可用相同的理论来描述，如色谱中所用的一些名词概念和基本理论，如保留值、塔板理论和速率理论等均可借用于毛细管电泳中。

3.仪器流程色谱与电泳的仪器，都包括进洋部分、分离柱。

检测器和数据处理等部分.二、毛细管电泳的特点毛细管电泳和高效液相色谱一样，同是液相分离技术,它们可以互为补充，但无论从效率、速度、样品用量和成本来说,毛细管电泳都显示了一定的优势。

毛细管电泳柱效更高，可达105～106m—1，故也称为高效毛细管电泳(highperformancecapillaryelectrophoresis;HPCE），分离速度更快，几十秒至几十分钟内即可完成一个式样的分析；溶剂和试样的消耗极少,试样用量仅为纳升级；毛细管电泳没有高压泵输液,因此仪器成本更低；通过改变操作模式和缓冲溶液的成分，毛细管电泳有很大的选择性，可以对性质不同的各种分离对象进行有效的分离。

毛细管电泳的特点可以概括为“高效、低耗、快速、应用广泛”。

三、毛细管电泳的分类按毛细管中填充物质的性状可分为自由溶液和非自有溶液毛细管电泳;按机制可分为电泳型、色谱型和电泳/色谱型三类.常用于药物分析的毛细管电泳的分离模式详见表21—1表21—1毛细管电泳主要分离模式名称缩写 管内填充物 说明 毛细管区带电泳 CZE pH 缓冲的自由电解质溶液,可含有一定功能的添加剂 属自由溶液电泳型，但可通过加添加剂引入色谱机制胶束电动毛细管色谱 MECC CZE 载体+带电荷的胶束 CEZ 扩展的色谱型微乳液电动毛细管色谱 MEECC 由缓冲液、不溶于水的有机液体和乳化剂构成的微乳液 CEZ 扩展的色谱型毛细管凝胶电泳 CGE 各种电泳用凝胶或其他筛分介质 属非自由溶液电泳,含有“分子筛"效应毛细管等电聚焦 CIEF 建立pH 梯度的两性电解质 按等电点分离，属电泳型，要求完全抑制电渗流毛细管电色谱 CEC CEC 载体+液相色谱固定相 属非自由溶液色谱型非水毛细管电泳 NACE 含电解质的非水体系 属自由溶液电泳型第二节 毛细管电泳理论一、电泳和电泳淌度电泳是在电场作用下带电粒子在缓冲溶液中的定向移动，这种移动速度u ep 由下式决定:E u ep ep •=μ（21·1）式中E 为电场强度，µep 为电泳淌度（mobility ），即溶质在给定缓冲溶液中中和单位场强下单位时间内移动的距离，即单位场强下的电泳速度（µep/E ）。

下标ep 表示电泳（electrophoresis ）。

在空心毛细管中一个粒子的淌度可近似表示为：4 ep πηεζμi =(21·2）式中ε和η分别为介质的介电常数和粘度。

ζi 是粒子的Zeta 电势,这是电荷粒子形成的类似双电层结构，再剪切平面，即在荷电粒子有效半径所构成的面存在的Zeta 电势，其大小和粒子表面的电荷密度有关，近似地正比与3/2/M Z ，其中M 是摩尔质量，Z 是净电荷,即表面电荷越大，质量越小，Zeta 电势越大，因此离子可按它们的表面电荷密度的差别，一不同的速率在电介质中移动，而实现分离。

这就是在自由溶液区带电泳中不同粒子的分离基础。

在实际溶液中，离子活度系数、溶质分子的离解度程度均对粒子的淌度有影响,这时的淌度称为有效淌度，用µef 表示: ∑=i epi i ef μγαμ（21·3）式中αi 为样品分子的第i 级离解度，i γ为活度系数或其他平衡离解度.由上而见，荷电粒子在电场中的迁移速度，除与电场强度和介质特性有关外，还与粒子的离解度、电荷数及其大小形状有关。

二、电渗和电渗率电渗是一种液体相对于带电的管壁移动的现象.电渗的产生和双点层有关，由于用作毛吸管材料的石英的等电点约为1.5左右，因此在常用缓冲溶液pH （pH 〉2）下,管壁带负电,即石英毛细管内壁覆盖一层硅醇基阴离子,并吸引溶液中的阳离子，由此在毛细管内壁形成表面带阴离子的双点层。

双点层中处于扩散层的阳离子，在负电荷表面形成一个圆筒形的阳离子塞流，在外加电场作用下，朝向阴极方向运动，如图21—2。

由于这些阳离子是溶剂化的，当它们沿剪切面作相对运动时,携带着溶剂一齐向阴极迁移，形成电渗流（electroosmoticflow ；EOF ）。

在开管柱条件下，毛细管内电渗流为平头塞状，即流速在管截面方向上不变.电渗流速度u os 以下式表示：E E u os os os ηεζμ==（21·4）式中µos 为电渗率（或电渗淌度）,ζos 为管壁的Zeta 电势,下标os 表示电渗。

在多数水溶液中，石英和玻璃毛细管表面因硅醇基离解会产生负电荷，许多有机材料如聚四氟乙烯,聚苯乙烯等也会因为残留的羧基而产生负电荷，其结果是产生指向负极的电渗。

因此，在通常的毛细管区带电泳条件下，电渗流从阳极流向阴极，其大小受电场强度、Zeta 电势、双电层厚度和介质粘度的影响.一般,Zeta 电势越大，双电层越薄，粘度越小，电渗流值越大。

在一般情况下，电渗流的速度是电泳速度的5~7倍.三、表观淌度和权均淌度在毛细管电泳中，同时存在着电泳流和电渗流,在不考虑相互作用的前提下，粒子在毛细管内的运动速度应当是两种速度的矢量和，即：E u u u os ef os ef ap )(μμ+=+=（21·5）或os ep ap μμμ+=(21·6）u ap 为表观迁移速度，µap 称为表观淌度（apparentmobility ）。

当把试样从正极端注入到毛细管内时,不同符号的离子将按表21-2的速度向负极迁移。

分离后出峰的次序是：正离子>中性分子>负离子。

中性分子都与电渗流速度相同，不能相互分离。

表21—2在电泳中的组分迁移速度组分表观淌度 表观迁移速度 正离子µef +µos u ef +u os 中性离子 µos u os负离子 µos —µef u os —u ef在毛细管内一旦灌入缓冲溶液，就可能形成固—液界面，这就有了向分配的基础条件。

如果在毛细管中引入另一相，如胶束、高分子团等准固定相或色谱固定相等,称为P 相，则试样就会有机会在溶液相与P 相之间进行分配。

这样，当试样组分在电迁移过程中会发生相间分配，其迁移速度或淌度将发生变化。

因此，引入另一平衡的粒子迁移速度和淌度,称之为加权平均速度和加权平均淌度，简称为权均速度和权均淌度，以符号u 和µ表示。

设相分配过程远快于电泳过程，则有： s p p n n k /= （21·7）p p p p k k E u μμμ+++==1111（21·8）式中k p 为容量因子，n p 和n s 分别为试样在P 相和溶剂中的分子数,µp 为P 相的表观淌度。

注意，P 相在电场中可静止，也可迁移，运动方向可正、可负。

引入P 相后，可以使中性组分产生不同的权均淌度，因而解决中性组分在毛细管电泳中的分离问题。

四、分离效率和谱带展宽（一）理论塔板数和塔板高度由于毛细管电泳在功能和结果显示形式上，与色谱技术颇为相似，因此，在不少讨论中引入与色谱相似的处理和表达方法，特别是直接沿用了色谱的塔板高度H 和理论塔板数n 的概念，用以表示柱效。

22/1)/(54.5W t n m =(21·9)t m 为流出曲线最高点对应的时间，称为迁移时间（migrationtime ）。

因为毛细管电泳中,在理想情况下粒子和管壁之间的相互作用可以忽略，因此可以认为没有离子保留下来,所以用迁移时间代替色谱中的保留时间。

另外，对于柱上检测的毛细管电泳来说，记录器上显示峰顶时,组分尚未流出，因此在毛细管电泳的塔板高度为：n L H d /=（21·10)L d 为进样口到检测器的距离.理论塔板数和塔板高度用来评价色谱峰的展宽，衡量整个毛细管电泳系统性能的优劣.但塔板理论是以分配平衡为基础的色谱理论概念，这种分离理论的基础和电泳所涉及的被分离物质的电荷、质量及形状等有着本质的差别，因此，在毛细管电泳中引入理论塔板数的概念主要是为了寻求一种对分离效率评价的通用方法。

（二）谱带展宽在毛细管电泳中，影响谱带展宽的原因主要有两类：①来源于柱内溶液和溶质本身，其中特别是自热、扩散和吸附；②来源于系统，如进样和检测。