细胞培养中边缘效应和解决办法

MTT实验心得2

MTT实验心得MTT实验是检测细胞活力的实验方法，由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此也常常用来检测细胞的增殖情况。

MTT的原理：活细胞有琥珀酸脱氢酶，将MTT还原成棕褐色沉淀。

由于一般介绍园子里已经很多，笔者将自己的心得按照实验流程与大家交流交流。

1、培养好细胞点板。

养细胞没啥好说的，如果不知道细胞如何养，那就看看相关的文献方法。

如果知道了细胞的名字，就可以上检索细胞的培养信息，这个网站上的培养方法是标准培养方法。

当然可以根据自己实验要求进行修改。

由于细胞计数很繁琐，点板时的细胞浓度是最难掌握的，这一点笔者的心得如下：自己先将细胞养一段时间，大概了解细胞的增殖情况，在MTT检测时实际上要求细胞大概能长满96-孔板的80-90%，如果打算养48小时就检测，根据细胞的生长情况反推点板时的细胞浓度状况。

这时可以将细胞不进行计数，将消化好的细胞混匀后（可能是10 ml）直接在一个废弃（最好进行过无菌处理）的96孔板中依次加入180、100、50微升细胞，将细胞放置几分钟就会沉到板底了，这时在显微镜下观察，推测哪个孔的细胞48 h能基本长满板底，假设50 微升的孔比较合适，而点板时没孔需点200 微升，那么就将细胞浓度再稀释4倍就可以正式点板了，这时顺便将细胞进行计数（因为实验记录要求写啊）。

这样就OK了！如果细胞还太多，将细胞稀释4倍后再重复以上操作。

注意：不要过分信赖细胞计数，因为细胞计数的取样量为20 微升左右，由于颗粒的分布不均匀，代表性是很差的。

建议：细胞计数一定要会，但不要完全依赖它。

点板时一定要将细胞消化成单个细胞，而且一定要混匀，最好用排枪，否则，MTT的SD会狂大。

2、点板布局。

其实这一点很多人不懈一顾。

如果你的细胞要养48 h或更长，建议不要吝啬96-孔板的四周边孔，这32个边孔不能使用，建议加入灭菌PBS以饱和中间64个孔的水分。

因为细胞培养过程中，边孔的水分蒸发很快，培养液及里面的药物会出现浓缩现象，细胞的状况就复杂了，有些人称之为“边缘效应”这些孔的SD也会狂大，既然如此，不如不用。

MTT

MTT原理：MTT是一种检测细胞功能的方法。

细胞在活化增值的过程中，线粒体的能量代谢能够把MTT代谢为蓝紫色的甲臜，甲臜沉积于细胞内或细胞周围，形成甲臜的量与细胞活化的程度成正比，通过盐酸异丙醇或其他溶剂溶解甲臜，用酶标仪测溶液的光密度就可以反映甲臜的量并从而判断细胞活化增值的程度。

步骤：1、培养好细胞点板。

养细胞没啥好说的，如果不知道细胞如何养，那就看看相关的文献方法。

如果知道了细胞的名字，就可以上检索细胞的培养信息，这个网站上的培养方法是标准培养方法。

当然可以根据自己实验要求进行修改。

由于细胞计数很繁琐，点板时的细胞浓度是最难掌握的，这一点笔者的心得如下：自己先将细胞养一段时间，大概了解细胞的增殖情况，在MTT检测时实际上要求细胞大概能长满96-孔板的80-90%，如果打算养48小时就检测，根据细胞的生长情况反推点板时的细胞浓度状况。

这时可以将细胞不进行计数，将消化好的细胞混匀后（可能是10 ml）直接在一个废弃（最好进行过无菌处理）的96孔板中依次加入180、100、50微升细胞，将细胞放置几分钟就会沉到板底了，这时在显微镜下观察，推测哪个孔的细胞48 h能基本长满板底，假设50 微升的孔比较合适，而点板时没孔需点200 微升，那么就将细胞浓度再稀释4倍就可以正式点板了，这时顺便将细胞进行计数（因为实验记录要求写啊）。

这样就OK了！如果细胞还太多，将细胞稀释4倍后再重复以上操作。

注意：不要过分信赖细胞计数，因为细胞计数的取样量为20 微升左右，由于颗粒的分布不均匀，代表性是很差的。

建议：细胞计数一定要会，但不要完全依赖它。

点板时一定要将细胞消化成单个细胞，而且一定要混匀，最好用排枪，否则，MTT的SD会狂大！2、点板布局。

其实这一点很多人不懈一顾。

如果你的细胞要养48 h或更长，建议不要吝啬96-孔板的四周边孔，这32个边孔不能使用，建议加入灭菌PBS以饱和中间64个孔的水分。

因为细胞培养过程中，边孔的水分蒸发很快，培养液及里面的药物会出现浓缩现象，细胞的状况就复杂了，有些人称之为“边缘效应”这些孔的SD 也会狂大，既然如此，不如不用。

细胞培养常见问题的原因及其解决的办法

细胞培养常见问题的原因及其解决的办法：问题1培养液pH值变化太快可能原因(1)CO2张力不对(2)培养瓶盖拧得太紧(3)NaHCO3缓冲系统缓冲力不足(4)培养液中盐浓度不正确(5)细菌、酵母或真菌污染建议解决方法(1)按培养液中NaHCO3浓度增加或减少培养箱内CO2浓度，2.0g/L到3.7g/L浓度NaHCO3对应CO2浓度为5%到10%。

(2)松开瓶盖1/4圈。

(3)改用不依赖CO2培养液。

加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度。

(4)在CO2培养环境中改用基于Earle′s盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks盐配制的培养液。

(5)丢弃培养物，或用抗生素除菌。

问题2：培养液出现沉淀，但pH值不变可能原因(1)洗涤剂清洗后残留有磷酸盐，将培养基成分沉淀下来(2)冰冻保存培养液建议解决方法(1)用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后灭菌。

(2)将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。

问题3：培养液出现沉淀，同时pH发生变化可能原因细菌或真菌污染建议解决方法丢弃培养物，或用抗生素除菌。

问题4：培养细胞不贴壁可能原因(1)胰蛋白酶消化过度(2)支原体污染(3)培养瓶瓶底不干净(4)培养液pH值过碱(NaHCO3分解)(5)消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不细胞老化(如传代前细胞已汇合导致失去贴附性)(7)接种细胞起始浓度太低或太高建议解决方法(1)缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。

(2)分离培养物，检测支原体。

清洁支架和培养箱。

如发现支原体污染，丢弃培养物。

(3)注意刷洗，或换用一次性塑料培养瓶(4)使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2(将培养液敞口放入培养箱也可)(5)重新配置消化液或培养液启用新的保种细胞(7)调节最佳接种细胞浓度问题5：悬浮细胞成簇可能原因(1)培养液中含钙、镁离子(2)支原体污染(3)蛋白酶过度消化使得细胞裂解释(4)DNA污染建议解决方法(1)用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液。

细胞培养常见问题及其解决

细胞培养常见问题及其解决1、如何选用特殊细胞系培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条件。

在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。

总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。

2、何时须更换培养基？视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。

3、可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。

每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。

4、可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。

血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。

来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。

5、何谓FBS, FCS, CS, HS ?FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼，请不要再使用。

CS (calf serum) 则是指小牛血清。

HS (horseserum) 则是指马血清。

6、培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。

当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时，则应使用5 % CO2 培养细胞。

7、Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。

原因是什么？Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。

细胞培养教学中的常见问题及应对措施

细胞培养教学中的常见问题及应对措施标签：细胞培养;实验教学;评价标准细胞培养技术已经成为当今生命科学各研究领域的基本技术,是生命科学工作者必备的实验技能。

细胞培养的成败受细胞生长的各种条件,个人操作手法、操作环境、使用器具等多种因素的影响[1]。

在多年的教学实践中,笔者发现细胞培养过程一些常见的问题直接影响到教学的顺利进行,针对这些问题,笔者采取了一些应对措施,取得了较好的效果。

1 细胞培养教学中的一些常见问题1.1 培养的细胞易被污染离体培养的细胞没有抗感染能力,因此防止污染是细胞培养成败的关键。

笔者在教学中发现因各种因素导致学生培养的细胞被污染的比例达30%~40%。

1.2 细胞培养对操作环境要求高,不易组织教学细胞培养需要在无菌室的超净台中进行,空间较小,教师无法面对大量的学生进行实验示教,因此在组织教学上有一定的困难。

1.3 实验过程较长,操作步骤多,不易监控细胞培养实验的特点是实验的前期准备工作多,实验过程长,操作步骤多。

进行一轮完整的实验,往往需数天时间,而且在实验过程中,学生来做实验的时间不固定,因此教师不容易对学生的实验全过程进行监控。

1.4 实验评价标准单一,不适于这一类实验的教学以往对学生细胞培养实验的评价是以学生培养的细胞的生长状况和实验报告为依据,其缺陷是只注重结果而忽视实验的过程,而学生是否真正掌握细胞培养技术,主要体现在实验的过程中。

笔者曾在中国科学院生物物理研究所、北京大学医学部、解放军传染病研究所等国内一些重点实验室学习和进修,虽然细胞培养只是这些实验室最基础的一种技术,但其做细胞培养实验的一些有益的经验非常值得参考和借鉴。

笔者针对在教学中学生经常出现的一些影响实验教学的问题,综合这些经验,提出了相应的处理对策。

2 应对措施2.1 完善细胞培养室设施,规范实验操作步骤2.1.1 细胞培养室应单独隔离出来专用,能建立一定清洁级别的培养室是最好的,考虑到用于教学的实验室需要较大的面积,可能不易达到这样的清洁级别要求,但至少要有一个洁净的环境和隔离出一个专用的无菌区[2]。

细胞培养中的常见问题及解决方法

细胞培养中的常见问题及解决方法细胞培养是现代生命科学研究中常用的实验技术之一，可以用于细胞增殖、分化、转染等研究。

然而，细胞培养过程中常常会出现一些问题，如细胞污染、细胞凋亡和细胞失活等。

本文将讨论细胞培养中的这些常见问题，并提出相应的解决方法。

1. 细胞污染细胞污染是细胞培养中的一大难题。

它可以由细菌、真菌或其他细胞类型的污染引起。

细胞污染会影响实验结果的准确性，并可能导致细胞系的丢失。

为了解决这个问题，我们可以采取以下措施：（1）经常检查细胞培养器具和培养基，确保其无菌；（2）使用抗生素或抗黴剂对培养基进行预处理，以减少污染的风险；（3）定期进行污染检测，例如细胞培养液和工作区的表面。

2. 细胞凋亡细胞凋亡是正常细胞生命周期的一部分，但在细胞培养中，过多的细胞凋亡会导致实验结果的误差。

为了减少细胞凋亡的发生，我们可以考虑以下措施：（1）优化培养条件，包括温度、CO2浓度和培养基配方等；（2）定期检查细胞形态和健康状况，及时处理出现凋亡现象的细胞；（3）使用细胞凋亡检测工具，如Annexin V-FITC/PI染色法，来评估细胞凋亡水平。

3. 细胞失活细胞失活现象在细胞培养中常常发生，可能是由于细胞老化、无营养补充或培养条件不佳等原因引起。

为了避免细胞失活的发生，我们可以尝试以下方法：（1）及时更换培养基，确保细胞获得充足的营养物质；（2）避免过度培养，及时传代细胞；（3）定期鉴定细胞的纯度和活力，并确保培养条件适当；（4）尝试使用细胞增殖激素或生长因子来促进细胞的增殖和存活。

细胞培养中的常见问题并不局限于上述三个，还有其他一些问题，例如细胞出现突变、细胞凝固等。

针对这些问题，我们可以进一步深入研究并寻找解决方法。

同时，注意维持实验室的清洁和规范操作也是解决这些问题的关键。

细胞培养在生命科学研究中发挥着重要作用。

了解并解决细胞培养中的常见问题，有助于提高实验结果的准确性和可重复性。

通过合理的实验设计、严谨的操作和科学的方法选择，我们可以克服这些问题，为细胞培养研究的进展做出贡献。

免疫组织化学染色过程中出现问题及对策

1941年co ons首先用荧光素标记抗体,检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功,从而创建了免疫组织化学技术。

经过60余年的不断发展,由最初的直接免疫荧光标记法,逐渐发展出现了间接法,免疫酶法,免疫胶体金法,酶标记复合法等等。

该方法的敏感性和特异性不断得到提高,使其成为医学和生命科学领域中研究组织形态、功能和代谢的一项有力工具[1—3]。

随着该技术应用的普及和深入,免疫组织化学(免疫组化)染色技术作为病理诊断的主要辅助手段,各种新技术的引入以及新抗体相继问世,使免疫组织化学技术得到了更广泛的推广和应用,为临床病理诊断、肿瘤性质的判定、预后的估测等提供了重要依据。

但是,由于影响其操作的因素较多,免疫组化质量不稳定常常困扰着免疫组化工作人员。

本文举出了一些染色过程中出现的问题,并分析其中可能原因。

1.阴性反应染色结束后,切片中见不到任何阳性信号。

排除掉组织或细胞中确实不表达与抗体相关的抗原的原因外,还可能是染色过程中的某一或某些环节出了问题,出现了假阴性结果。

可能原因如下:1.1操作失误有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达,却未进行抗原修复[1,2];或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体;或一抗失效,也可见于染色过程中漏掉了某一环节;还可能是所选用的检测系统与一抗不匹配,如选用的一抗是兔源性抗体,二抗错选了抗鼠源性抗体。

解决办法:在三抗孵育结束时,将切片上的三抗滴在一张白纸上,再将配制好的DAB滴在白纸的三抗上,观察是否出现棕色。

如果出现了,证明三抗和DAB的配制过程正确。

如果不出现棕色反应,则三抗或DAB的配制过程有误。

1.2假阴性造成假阴性结果的因素一般来自三方面:1.组织处理不当,抗原损失过多或被遮蔽;2.抗体(包括特异性一抗和标记抗体)失活,效价过低或稀释度不合适;3.染色步骤的差错或其他试剂的问题,如显色剂、缓冲液的离子强度及ph值[3]。

解决阴性染色的问题,需要设立“阳性对照”和“阴性对照”。

MTT检测法

MTT法检测细胞存活和生长MTT全称为3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。

是一种黄颜色的染料。

又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。

其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

它的特点是灵敏度高、经济。

缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。

这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。

MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。

因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。

在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。

在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。

MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。

我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。

transwell小室边缘效应

transwell小室边缘效应Transwell小室边缘效应，指在进行细胞培养等实验时，小室边缘区域会出现细胞死亡、细胞树枝突起等现象，严重影响实验结果的准确性和可靠性。

这种现象是由于小室边缘区域的细胞受到了不均衡的培养条件（比如营养物质、氧气和CO2浓度的不均衡）而导致的。

下面将从几个方面来探讨如何避免或减轻Transwell小室边缘效应。

一、准备工作1.选择合适的Transwell小室，尽量避免小室边缘区域影响实验结果。

2.选用透气性好的滤膜，有利于保持小室内外氧气和CO2浓度的均衡。

二、培养基的制备1.培养基的pH值应该是均衡的，避免因pH的不均衡而造成了Transwell小室边缘效应。

2.加入适量的缓冲剂，用于维持培养基的pH值，保持培养基的稳定性并减少Transwell小室边缘效应的发生。

3.在培养基中加入适当的营养物质和氨基酸，有利于细胞生长和繁殖，同时也可以减轻Transwell小室边缘效应。

三、小室的处理方式1.将Transwell小室放于加热垫或温箱内，可以使小室内外温度均衡，避免因温度不均衡导致的效应出现。

2.在小室上下方各放置一张培养皿，可以使小室内外氧气和CO2浓度保持均衡，减少Transwell小室边缘效应的发生。

四、细胞的处理方式1.尽量避免或减少细胞接触小室边缘区域，可以通过在培养基中加入适量的润滑剂或防止细胞树突延伸的化学物质等方式实现。

2.适当调节细胞密度，可以在一定程度上减少Transwell小室边缘效应的发生。

通过以上的措施，可以有效地避免或减轻Transwell小室边缘效应的发生，从而保证实验结果的可靠性和准确性。

需要注意的是，不同实验条件下可能会有不同的影响因素，因此在具体进行实验前，需要根据实验条件和需要考察的样品等因素综合考虑，选用相应的措施进行处理，以避免出现影响实验结果的Transwell小室边缘效应。

96孔板边缘效应

96孔板边缘效应随着科学技术的不断发展，96孔板作为一种常用的实验工具，被广泛应用于生物医学研究和实验室工作中。

然而，人们在使用96孔板时常常会遇到一个问题，那就是边缘效应。

本文将从边缘效应的定义、原因、影响和应对措施等方面进行探讨，以期帮助读者更好地理解和应对这一问题。

边缘效应是指在96孔板的边缘位置，由于温度、湿度、气体和液体的不均匀分布，导致实验结果出现偏差的现象。

这种现象常常会造成边缘孔位的实验结果与中心孔位的实验结果不一致，给实验数据的准确性和可靠性带来了挑战。

边缘效应的产生原因主要有以下几点。

首先，96孔板边缘孔位与周围环境的接触面积较大，容易受到外界环境的影响。

其次，边缘孔位与中心孔位相比，受到的温度和湿度变化更加明显。

此外，边缘孔位与周围孔位之间的热传导和气体扩散也存在差异，进一步造成了边缘效应的产生。

边缘效应对实验结果的影响主要表现在两个方面。

一方面，边缘效应会使边缘孔位的温度和湿度变化较大，导致实验结果的不稳定性，增加了实验误差。

另一方面，边缘效应还会导致边缘孔位与中心孔位的实验结果不一致，给实验数据的分析和解释带来困难。

针对边缘效应，我们可以采取一些应对措施，以提高实验结果的准确性和可靠性。

首先，可以在实验开始前对96孔板进行预处理，如将其放置在恒温箱中使其达到均匀的温度和湿度。

其次，可以调整实验条件，如控制好实验液体的用量和浓度，尽量减小液体在孔位中的接触面积，从而减少边缘效应的影响。

此外，还可以选择合适的实验方法和数据处理方法，以降低边缘效应对实验结果的影响。

边缘效应是96孔板在实验过程中常常会遇到的一个问题。

它的产生原因主要是由于温度、湿度、气体和液体的不均匀分布所致。

边缘效应会对实验结果的准确性和可靠性造成一定的影响，但我们可以通过采取一些应对措施来减小其影响。

希望本文的介绍和讨论能够帮助读者更好地理解和应对边缘效应，提高实验结果的质量和可靠性。