T载体克隆
实验三 AT法(T载体)克隆PCR产物
AT克隆原理
载体DNA产生的LacZ α多肽可与宿主细胞 （基因型为LacZ∆M15）产生的ω多肽片段 结合，表现出β-半乳糖苷酶活性（α-互补）。 β-半乳糖苷酶可以催化X-gal降解成不溶的 蓝色产物，从而有利于我们通过显色反应 来筛选重组克隆，并通过酶切鉴定插入序 列。
连接酶
连接酶
AT法（T载体）克隆 法 载体） 载体 克隆PCR产物 产物
AT克隆原理
Taq DNA多聚酶是耐热DNA聚合酶，是从 水生栖热菌（Thermus aquaticus）中分离的。 Taq DNA聚合酶是一个单亚基，分子量为 94，000 Da。具有5’-->3的聚合酶活力，5’->3’的外切核酸酶活力，无3’-->5’的外切核 酸酶活力，会在3’末端不依赖模板加入1个 脱氧核苷酸（通常为A，故PCR产物克隆中 有与之匹配的T载体。
TA克隆(pMD18-T载体)
pMD18-TVector:•制品说明pMD18-TVector是一种高效克隆PCR产物(TACloning)的专用载体。
本载体由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的Xbal和Sall识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用EcoRV进行酶切反应后，再在两侧的3’端添加“T”而成。
因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
由于本载体以pUC18载体为基础构建而成，所以它具有同pUC18载体相同的功能。
此外，本制品中的高效连接液SolutionI 可以在短时间内(约30分钟)完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。
本制品中的ControlInsert(500bp)还可以用于Control反应。
•制品内容pMD18-TVector(50ng/gl)20glX1支ControlInsert(50ng/gl)10glX1支SolutionI*30glX5支*使用时请于冰中融解。
•保存：-20°C•纯度■ControlInsert经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有InsertDNA片段。
■ControlInsert经克隆后，用双脱氧测序法确认多克隆酶切位点及T碱基的存在。
•用途■进行TA克隆，克隆PCR产物。
■对克隆后的PCR产物使用BcaBESTTMSequencingPrimers、M13Primers进行DNA测序。
HJnd111AccIEciflVIbeI和mH]SmaIXinaIDigesietrb/v•计砒科宙护和。
TA克隆简述
生物秀论坛『中国生物科学论坛』PCR产物的T载体克隆（一）重组T质粒的构建一．原理外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。
重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。
但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。
连接反应通常将两个不同大小的片断相连。
因为DNA片断有两个端点，所以切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。
对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。
为了减少自环的高本底，可对载体进行5’除磷酸处理，原理是连接酶只能连接DNA片断的3’OH末端与5’端，所以除磷后载体不会自环。
一旦有外源片断插入时，由外源片断提供5’端就能与载体进行连接。
通过这种方法可大大减少由载体的自环造成的高本底。
对于双酶切来说，无论载体与供体同一片段上都有不同的末端，这样就避免了载体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。
双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。
但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。
T载体克隆连接原理、制备及载体序列
T载体克隆连接原理、制备及载体序列T载体的定义：T载体（T-Vector）是一种髙效克隆PCR产物（TA克隆）的专用质粒载体，为线性化载体，无需酶切可直接与具有A末端的PCR产物连接，属于非定向克隆。
T载体的作用原理：大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都具有在PCR产物的3'末端添加一个“A”的特性（下图红色框内所示位置）。
因此，人们在线性化平末端载体的两端分别又人工加上一个额外的T碱基（下图两个红色箭头所示），从而可与PCR克隆产物的A末端互补配对，提髙了PCR产物连接和克隆的效率。
T载体进行TA克隆的优势：相对于另一种非定向克隆平末端克隆，使用T载体进行TA克隆是一种快速、髙效、一步到位的非定向克隆法。
有研究曾证明，平末端克隆的连接效率仅为粘端连接的1/50，且自身环化率髙。
T载体的制备：1商业化T载体：一般来说，商业化的T载体多是先使用平端限制性内切酶（如EcoRV）将克隆载体进行线性化，然后再单独加入dTTP和Taq酶72〜751反应，进行末端的加T。
2自制T载体：一种常见的自制方法是利用限制性内切酶制造出具有单个T末端突出的片段,最常用的内切酶为Xcml,其识别和切割特点如下：其中XcmI的识别序列分别为两端的CCA和TGG，而切割序列则为中间三角箭头所指的N（N代表任意碱基）。
由于N可以是任意碱基，所以如果将切割位置的N设置为T，那么在该酶的切割下，就可以产生一个3'T末端。
相似的，在其互补链上设置另一个相同或者类似的XcmI酶切位点（保证切割位点为T即可）就可以产生另一个T末端。
一般可以在商业化的T载体基础上进行改造，通过PCR或者合成Oligo的方式插入上述两个XcmI位点。
连接成功的质粒可按需要自行扩增和保存，使用时用XcmI进行完全酶切（这里的酶切必须保证完全，否则载体易自连，所以XcmI酶最好过量，或者适当延长消化时间），就可以制备得到T载体。
[3]常见T载体及序列：虽然上面提到可以自制T-Vector，但实际上现在的商业化载体已经做到比较便宜，而且批次间稳定性保持的不错。
克隆载体与表达载体
克隆载体与表达载体
1. T载体是克隆载体，你的基因通过TA克隆法插入载体，这一步的目的是扩增基因，得到大量你要的目的基因片段，以便进行下一步表达载体的构建；DH5α是克隆菌株，不能用来做表达；
2. 欲在大肠杆菌中表达外源基因，需要首先构建原核表达载体，如可将构建至T 载体的目的通过双酶切切下来然后连接到表达载体上，如PET系列的载体等，构建成原核表达载体后，可将此载体转化表达菌株，如BL21(DE3,)等，如果你的目的基因含有稀有密码子，也可以转化Rosetta系列的表达菌株。
最后将构建成功的基因工程菌进行诱导表达。
1、T载体常用于克隆，一般来讲都会再把目的基因亚克隆到表达载体上。
但是并非T载体不能用来表达。
常见的pMD18-T，含有lacZ操纵子，可以IPTG诱导表达。
pGEM-T则含有T7和SP6启动子。
2、为了能够顺利地使用T7系统来表达蛋白，在如BL21（DE3）一类的大肠杆菌菌株中，编码T7RNA聚合酶的基因被整合到其染色体上，并位于lacUV5启动子的下游，受乳糖操纵子调控。
而目标蛋白的编码序列则被构建到含T7启动子序列的质粒上，并受T7RNA聚合酶调控转录。
3、构建质粒、基因表达看似比较成熟，也比较简单。
其实这里面大有学问。
学会看菌株和质粒的相关文档，答案就在其中。
pcr扩增后t载体
pcr扩增后t载体PCR扩增后的T载体是一种常用的分子生物学工具，用于在实验室中进行DNA片段的克隆和基因的表达研究。
本文将详细介绍PCR扩增后T载体的概念、构建方法以及在科研中的应用。
一、PCR扩增后T载体的概念PCR扩增后T载体是一种用于克隆PCR产物的载体，它通过连接PCR扩增产物的末端与T载体的末端序列相互匹配，实现PCR产物的快速克隆。
PCR扩增后的T载体通常包含T载体的启动子和选择标记，方便后续对克隆产物的筛选和表达。
二、PCR扩增后T载体的构建方法PCR扩增后T载体的构建通常包括以下几个步骤：1.设计引物首先根据需要克隆的PCR产物设计引物，使其在扩增产物的末端含有T载体的末端序列。
T载体的末端序列通常为5'-AATTGGGAAAA-3'。
2.进行PCR扩增使用设计好的引物进行PCR扩增，获取所需的DNA片段。
在PCR反应中，可以根据需要添加引物的Pfu酶切位点，便于后续的克隆步骤。
3.准备PCR产物将PCR产物进行电泳检测，确认目标片段的大小和纯度。
如有必要，可进行片段纯化和测序验证。
4.连接T载体序列将PCR产物与线性化的T载体进行连接。
连接反应中，需将PCR产物和T载体按一定比例混合，加入连接酶和缓冲液，进行高效连接。
5.转化宿主细胞将连接产物与宿主细胞（如大肠杆菌）进行转化。
转化后，将转化产物接种到含有选择抗生素的琼脂平板上，筛选并培养阳性克隆。
6.验证克隆基因通过PCR或限制酶切等方法验证克隆基因的存在，并进行测序分析。
确保克隆基因的准确性和完整性。
三、PCR扩增后T载体的应用PCR扩增后的T载体在科研中有着广泛的应用，主要包括以下几个方面：1.基因克隆通过PCR扩增后T载体的使用，可以高效地克隆和表达目标基因。
这为基因功能研究和蛋白质表达提供了方便和快捷的工具。
2.基因组库构建PCR扩增后T载体可以用于构建基因组文库，提供了大规模筛选和鉴定目标基因的手段。
T载体的克隆
实验原理重组质粒的构建T质粒载体重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。
但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。
连接反应通常将两个不同大小的片断相连。
很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。
pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。
这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。
但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。
因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
感受态制备原理细菌在0°C CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的感受态。
β-半乳糖甘酶显色反应选择法LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。
β—半乳糖核苷酶是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解．用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色。
TA克隆-T载体
TA克隆概述TA克隆载体即T载体，是目前克隆PCR产物最简便、快捷的方法。
随着基因组计划的进行，以及分子生物学技术、基因芯片技术在生命科学研究、生物工程和医学等领域的应用，对TA载体的需求量会逐步扩大TA克隆方法(OriginalTACloningKit)即利用Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条PCR扩增产物的3'端自动添加一个3'-A突出端。
利用TaKaRa的T载体，直接高效地连接PCR产物。
所以TA克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需将PCR产物进行优化，不需把PCR产物做平端处理，不需在PCR扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。
TA克隆的策略摘要：对于亚克隆来说，酶切-连接可谓是最经典的方式。
虽说效果不错，可着实有些麻烦。
载体和片段分别酶切、跑胶、回收，再加上连接和转化，一星期转眼就过去了。
新的克隆方法也在不断涌现。
速度更快，片段更长。
生物通近期就将盘点一下市场上一些非一般的克隆。
从TA克隆开始，我们着重于一些容易忽视的问题。
TA克隆的idea最初来自1994年。
几位学者发现TaqDNA聚合酶会在PCR产物的3'末端加上一个脱氧腺苷（A）,而且这种特性与模板无关。
之后，Invitrogen公司发明了TA克隆技术，并拥有全球TAcloning商标的专利权，直至2013年。
（这个就够他们赚得盆满钵满了。
）线性化的T载体在3'末端拥有一个脱氧胸苷（T），与PCR产物的A尾巴互补。
原理就是这么简单。
不过由于价格的原因，Invitrogen的T载体在国内却不是销量最好的。
Promega的pGEM-T（easy）和Takara的pMD18-T因性价比高，更加深入人心。
TA克隆的步骤无需赘述，相信大家都很清楚。
无非就是PCR、连接、转化、鉴定这几个步骤，不过还有一些不得不说的问题，值得大家注意。
用什么样的聚合酶？不是所有的聚合酶都会在PCR产物末端加A。
具有3'到5'外切酶活性的高保真酶就不会产生A尾巴。
TA克隆-T载体
TA 克隆概述TA 克隆载体即 T 载体，是目前克隆 PCR 产物最简便、快捷的方法。
随着基因组计划的进行，以及分子生物学技术、基因芯片技术在生命科学研究、生物工程和医学等领域的应用，对 TA 载体的需求量会逐步扩大TA 克隆方法（ Original TA Cloning Kit ）即利用 Taq 聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条 PCR 扩增产物的3` 端自动添加一个 3`-A 突出端。
利用 TaKaRa 的 T 载体，直接高效地连接 PCR 产物。
所以 TA 克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需将 PCR 产物进行优化，不需把 PCR 产物做平端处理，不需在 PCR 扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。
原理如下：TA克隆的策略摘要：对于亚克隆来说，酶切-连接可谓是最经典的方式。
虽说效果不错，可着实有些麻烦。
载体和片段分别酶切、跑胶、回收，再加上连接和转化，一星期转眼就过去了。
新的克隆方法也在不断涌现。
速度更快，片段更长。
生物通近期就将盘点一下市场上一些非一般的克隆。
从TA克隆开始，我们着重于一些容易忽视的问题。
TA 克隆的idea 最初来自1994 年。
几位学者发现Taq DNA 聚合酶会在PCR 产物的3’末端加上一个脱氧腺苷（A），而且这种特性与模板无关。
之后，Invitrogen 公司发明了TA 克隆技术，并拥有全球TA cloning 商标的专利权，直至2013 年。
（这个就够他们赚得盆满钵满了。
）线性化的T 载体在3’末端拥有一个脱氧胸苷（T），与PCR 产物的 A 尾巴互补。
原理就是这么简单。
不过由于价格的原因，Invitrogen 的T 载体在国内却不是销量最好的。
Promega 的pGEM-T（easy）和Takara的pMD18-T 因性价比高，更加深入人心。
TA 克隆的步骤无需赘述，相信大家都很清楚。
无非就是PCR、连接、转化、鉴定这几个步骤，不过还有一些不得不说的问题，值得大家注意。
基因工程中的t载体 详细介绍
基因工程中的t载体详细介绍T载体是指用于携带或传递目标基因的工具，它可以将目标基因导入到宿主细胞中，实现基因的转移和表达。
T载体通常由DNA构成，具有一系列特殊的序列和结构，以确保基因的稳定传递和高效表达。
T载体在基因工程中起到了至关重要的作用。
它可以作为基因工程的工具，将外源基因导入到宿主细胞中，进而实现对基因的研究和应用。
在基因工程的研究中，T载体被广泛应用于基因克隆、基因表达、基因敲除等方面。
T载体在基因克隆中扮演着重要的角色。
通过将目标基因插入到T 载体的多克隆位点中，可以实现对基因的扩增和复制。
这种克隆技术可以帮助研究人员获得大量的目标基因，并进一步进行后续实验和研究。
T载体在基因表达中也具有重要的功能。
通过将目标基因插入到T 载体的表达位点中，可以实现对目标基因的高效表达。
T载体通常包含有启动子、转录终止子、选择标记等功能元件，这些元件可以调控基因的转录和翻译过程，从而实现对目标基因表达水平的调控。
T载体还可以用于基因敲除实验。
通过将特定基因的敲除片段插入到T载体中，然后将该T载体导入到宿主细胞中，可以实现对目标基因的敲除。
这种技术可以帮助研究人员研究基因的功能和作用机制，进一步揭示基因与生物体发育和生理过程的关系。
在实际应用中，T载体的选择要根据具体研究目的和要求来确定。
不同的T载体具有不同的特点和功能，可以用于不同的实验和研究。
常见的T载体有质粒、病毒载体等，它们具有不同的载体容量、复制机制、转染效率等特点，可以根据实验需要进行选择。
T载体在基因工程中扮演着重要的角色，它是基因工程的重要工具之一。
通过T载体的应用，研究人员可以实现基因的克隆、表达和敲除，从而推动基因工程和生物技术的发展。
随着基因工程技术的不断进步，相信T载体在未来的研究中将发挥更加重要的作用。
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T载体克隆实验原理一•重组质粒的构建T质粒载体重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。
但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：首先，T4DNA连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5'磷酸基和3'羟基切口的DNA上,使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。
连接反应通常将两个不同大小的片断相连。
很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3'端加上一个突出的碱基A。
pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3'端带有一个突出的T。
这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。
连接反应的温度在37°C时有利于连接酶的活性。
但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。
因此采取折中的温度，即12-16C，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
二. 感受态制备原理细菌在OPCaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的感受态。
三. 1半乳糖甘酶显色反应选择法LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码0—半乳糖核苷酶。
0—半乳糖核苷酶是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解.用X-Gal 为底物进行染色时，呈蓝色。
现在一些特定的质粒（比如pUC/pBS等），常带有0—半乳糖核苷酶的调控序列和0—半乳糖核苷酶N端146个氨基酸（a肽段）的编码序列，在这个编码序列里还插入一个多克隆位点（MCS），它并不影响lacZ的表达。
另外，常用的大肠杆菌带有0—半乳糖核苷酶C端部分序列（0肽段），的编码序列。
在各自独立的情况下，这些质粒与大肠杆菌各自编码的0—半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性。
只有当携带a肽编码信息的克隆载体成功进入宿主细胞，在培养基诱导物IPTG的诱导下，载体质粒能够合成0—半乳糖核苷酶N端（a肽段），这样就与宿主细胞合成的0—半乳糖核苷酶C端部分序列（0肽段）互补，形成完整的0—半乳糖核苷酶活性蛋白。
而当外源基因插入到此种载体质粒lacZ的多克隆位点后，会造成lacZ基因不能表达，从而不能合成0—半乳糖核苷酶；而对于空载体，lacZ基因正常表达,通过a互补合成0—半乳糖核苷酶，分解培养基里的色素底物X-gal，最终形成蓝色的化合物，出现蓝色菌斑。
实验准备清洗，5个100ml锥形瓶（外加1个小的），6副培养皿，3个小试剂瓶，接种环，涂布棒准备100ml超纯水溶液:LB300ml（液体50ml+50ml,固体100ml）,0.1mol/LCaCl210ml，100mg/mlAmp1ml，20mg/mlX-gal1ml，200mg/mlIPTG1ml。
大肠杆菌菌液1ml感受态细胞连接产物4管4x5=20ul做4份目的基因T载体T4连接酶10x冲液4x4uL4x1uL4x0.5uL4x1uL灭菌：5个100ml锥形瓶（外加1个小的），6副培养皿，3个小试剂瓶，接种环，涂布棒，10ml超纯水，LB培养基，1.5mlEP管，大小枪头，过滤用具2畐副,,0.1mol/LCaCl2试剂配制20mg/mlX-gal X-gal为5-溴-4-氯-3-吲哚-0-D半乳糖苷。
用二基甲酰胺（DMF）溶解X-gal配制成的20mg/ml（取0・02gX-gal,用DMF定容为1ml）的贮存液。
保存于一玻璃管或聚丙烯管中，装有X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏，并应贮存于-20°C。
X-gal溶液无须过滤除菌。
（DMF 二甲基甲酰胺；Dimethylformamide;N,N-Dimethylformamide;DMF;CAS：68-12-2理化性质:无色、淡的胺味的液体。
分子式C3-H7-N-O。
分子量73.10。
相对密度0.9445（25°C）。
熔点-61C。
沸点152.8C。
）溶于DMSO，溶解度可达20mg/ml。
也溶于DMF溶于DMSO，溶解度可达20mg/ml。
也溶于DMF 200mg/mlIPTG在0.8ml蒸馏水中溶解0.2gIPTG后，用蒸馏水定容至1ml,用0.22pm滤器过滤除菌，贮存于-20C。
LB培养基：配制每升培养基,应该在950ml去离子水中加入:胰化蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl10g摇动容器直至溶质溶解•用5mol/LNaOH调pH至7.3.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min.（100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉为固体培养基）0・1mol/LCaCl2：取0.11098g氯化钙固体定容至10mlAmp（100mg/ml）：溶解0.1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至1ml,用0.22pm滤膜过滤除菌.实验过程（一）•目的基因片段与载体连接器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面离心管架，台式离心机，干式恒温气浴。
试剂T载体，T4DNA连接酶，连接酶缓冲液，无菌ddWater操作步骤PCR产物与T载体直接连接：（1）事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在14~16^C o（2）取4个灭菌的200ul微量离心管，加入：（需要调整）4ml目的基因1mlT载体0・5mlT4DNA连接酶（TAKARA,350U/ul）1ml连接酶缓冲液10xbuffer3・5mlddWater总量10ml体系（3）述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14°C干式恒温仪（或14°C水中）中保温过夜（12-16h）°（4）连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°C冰箱备用。
（二）.大肠杆菌感受态细胞的制备细菌转化器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml微量离心管，1.5ml微量离心管，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱，滤膜和过滤器试剂E.coli菌种，LB培养基，0.1mol/LCaCl2溶液，无菌ddWater，LB培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddwater，IPTG，X-gal。
步骤（1）在超净工作台中，将1ml大肠杆菌菌液加入100mlLB液态培养基（不含抗菌素），37°C摇床培养过夜。
（2）取0・5ml上述菌液转接到含有50mLLB培养基的三角烧瓶中，37C 下250r/min摇床培养2~3h，测定OD590为0・35~0.4左右（＜0・4~0・6,细胞数＜108/mL，此为关键参数！）。
（注意：此步摇菌的时候，要有一管不加菌的LB培养液同时摇菌）（3）将1ml菌液加入到4支1・5mL预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min，然后于4C，5000rpm离心5min。
（4）将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml冰冷的0・1mol/LCaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min o（5）4C,5000rpm离心5min，弃上清液后，用100“L冰冷的0・1mol/LCaCl2溶液垂悬，插入冰中放置2h，可以直接用作转化实验，或立即放入-4摄氏度冰柜中保藏。
（6）事先将恒温水浴的温度调到42Co(7)从-70°C超低温冰柜中取出一管(100pL)感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10min。
(8)加入5pL连接好的质粒混合液(DNA含量不超过100ng)，轻轻震荡后放置冰上20min。
(9)轻轻摇匀后插入42C水浴中90s进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3min。
(10)在超净工作台中向上述各管中分别加入300pLLB培养基(不含抗菌素)轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37C震荡1h。
(11)在超净工作台中取上述转化混合液200pL，分别滴到含合适抗菌素(Amp100ug/L)的固体LB平板培养皿中，再在平板上滴加40pL20mg/mlX-gal，7pL200mg/mlIPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀(注意：一个不含抗生素作为对照组，玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂，菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。
)。
(12)在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37C恒温培养箱中30min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37C恒温培养箱过夜。
(13)在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面。
(14)观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。
注意白色菌斑。
(三)・转化克隆的筛选和鉴定器材旋涡混合器，小镊子，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面离心管架，干式恒温气浴(或恒温水浴锅)，制冰机，恒温摇床，超净工作台，酒精灯，无菌牙签，摇菌管。
试剂LB培养基(加抗菌素)，PCR用试剂，引物，质粒提取用试剂，酶切需要的限制性内且酶及其缓冲液,65%甘油(65%甘油，0.1mol/LMgSO4,0.025mol/LTrisClpH8.0)。
操作步骤方法一.快速PCR筛选法(1)在转化的平板培养基上随机选取4个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔在其所在的培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号。
(2)在0・2mlPCR微量离心管中配制25pl反应体系。
ddwater16pl10黄PCRbuffer(不含MgCl2)2・5pl25mMMgCl21・5pl2・5mmol/LdNTP2pl(每种dNTP终浓度0・2mM)10pmol/LPrimerl1pl(12.5—25pmoles)10pmol/Lprimer21pl(12・5—25pmoles)模板质粒用小tip头轻轻粘一下选中的白色菌落，再伸入PCR混合液中洗一洗Taq酶0.5pl(1.5u)总体积25pl（2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序（本实验室已经设置为WZ）：①94°C5min②94C1min③60C1min④72°C1min50s⑤goto②29times⑥72°C10min（2）PCR结束后，取10“产物进行琼脂糖凝胶电泳（与原始插入片断同时比对）。